Esta pesquisa foi suportada por concessões GM046406 (a DB) e pelo Instituto Nacional de General Medical Sciences Center para Quantitative Biology (GM071508). RSM reconhece financiamento do NSF Graduate Research Fellowship. MNM é apoiado por um Lewis-Sigler Fellowship. Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório Botstein para discussões úteis e ex-membros Allegra Petti e Nikolai Slavov por suas contribuições para o projeto ciclo metabólico. Agradecemos a Daniel Zenklusen e Robert Singer para obter nós começou com o método FISH.

Figuras 1 e 2 são esquemas dos procedimentos experimentais peixes e dutos de análise de imagem utilizado para quantificar as imagens dos peixes. 1. Soluções para preparar * As soluções abaixo são para uso com sondas cantor. Se estiver usando sondas Stellaris, substituir &quot;40% formamida&quot; com &quot;10% de formamida&quot; tanto Tampão de Hibridização e tampão de lavagem. Alterações adicionais Tampão de Hibridização quando utilizando sondas Stellaris são: (1) adicionar 1 g de sulfato de dextrano e (2) não incluem 10 mg ssDNA. Tampão B 8 ml de 1 M de KH 2 PO 4 41,5 ml de 1 M de K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Tampão Spheroplasting 890 mL de buffer B VRC 100 mL 10 ul de 25.000 U / ml de liticase 2 ul β-mercaptoetanol &lt;strong&gt; tampão de hibridação (10 ml de volume final) 10 mg de E. coli tRNA 10 mg de ssDNA * 100 l mM estoque 200 VRC 40 ul de 50 mg / ml de BSA 1 ml de SSC 20X 4 ml de formamida a 40% * Nuclease de água livre (a 10 ml de volume final) 1 g de sulfato de dextrano * * Tampão de hibridização pode ser mantido em alíquotas de 0,5 ml a -20 ° C por conveniência. Tampão de Lavagem (50 ml de volume final) 5 ml de 20X SSC 20 ml de formamida a 40% * Nuclease de água livre (a 50 ml de volume final) Rotulagem de buffer 1,06 g de carbonato de sódio 100 ml de água DEPC pH 9 2. Sonda-rotulagem (Sondas Cantor Only) Nós obtemos estas sondas por síntese em casa usando um aparelho síntese de oligonucleotídeos ABI. Distróficoaliado, 4-5 ~ 50 pb são sintetizados oligonucleótidos que são homólogos ao gene de interesse, substituindo-alil-amino-timidina por vários thymidines espaçadas de pelo menos 8, de preferência de + 10 pb separadas. Por causa de sua sensibilidade ao ozônio, nós trabalhamos em uma instalação livre de ozono ao usar tinturas CY. <ol><li> Obter ~ 5 sondas e ressuspender em 100 mL de água - as concentrações de seleção na Nanodrop. </li><li> Dependendo de quantas sondas / gene, combine total de 10 mg / oligonucleotídeos gene (por exemplo, se tiverem 5 sondas / gene, então quero 2 mg / sonda). </li><li> Use colunas QIAquick para purificar as sondas de acordo com o Kit QIAquick Nucleotide remoção protocolo. </li><li> Adicionar 10 volumes de tampão PN ao volume total de sondas combinadas e misture. </li><li> Aplicar a amostra para a coluna QIAquick - se o volume total é superior a 750 mL, spin para baixo duas vezes com metade do volume em cada rodada </li><li> Deixe repousar por 1 min. </li><li> Centrifugar 1 min a 6000 rpm. </li><li> Lavar com 750 mL de tampão PE. </li><li> Centrifugador1 min a 6000 rpm. </li><li> Elimine o fluxo através da coluna e re-centrifugação durante 1 min a 13.000 rpm a secar. </li><li> Coluna QIAquick lugar no novo tubo de microcentrífuga e DNA eluir com 50 mL H 2 O - Certifique-se de H 2 O pH está dentro de 7.0 e 8.5 e é colocado diretamente na membrana. </li><li> Deixe repousar por 1 min. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto a 13000 rpm, para eluir o DNA. </li><li> Liofiliza-se o ADN a 45 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 ul de tampão de marcação e adicionar ao tubo do corante sem tocar no corante. </li><li> Repita com outro buffer rotulagem 10 ml. </li><li> Vortex e spin para baixo tubo de tinta e DNA. </li><li> Cubra os tubos com papel alumínio e manter no escuro, a RT O / N para rotular. </li><li> Repita QIAquick Nucleotide Removal Kit protocolo. Execute com duas diferenças: - Adicionar 200 mL de tampão PN sondas e colocar sondas marcadas através de colunas de 2x. - Realizar três lavagens com tampão PE, a fim de lavar qualquer corante solto antes de eluição. </li><li> After eluição obter concentração via NanoDrop. A eficiência de marcação é tipicamente ~ 0,25 pmol / ng de ADN de cadeia simples. </li></ol> 3. Lamela Preparação <ol><li> Coloque lamelas em slides em Plasma-preen câmara de vácuo ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (o mais próximo do centro, melhor). </li><li> Coloque câmara de vácuo no microondas e verifique se ele está selado. </li><li> Ligue a bomba primeiro e depois ligar a bomba de vácuo apenas uma vez é iniciado. </li><li> Ligue o forno de microondas, e parar de 5 segundos após plasma é visível. </li><li> Desligue o vácuo depois da bomba. </li><li> Retire a câmara de vácuo e remover lamelas com uma pinça (aqueles que caíram precisam ser limpos novamente). </li><li> Lugar Lamelas lado limpo em placas de 12 poços. </li></ol> 4. Procedimento de fixação <ol><li> Levedura crescer a uma DO600 de cerca de 0,1-0,2 em meio mínimo. 10 ml de células produz suficiente for ~ 10 hibridações separadas. </li><li> Adicione 1/10 volume 37% de formaldeído diretamente para a mídia de crescimento (10 ml de cultura + 1 ml de 37% de formaldeído) e deixe descansar por 45 min. </li><li> Lavar 2x com 1 ml de tampão B gelado num tubo de microcentrífuga (pode girar a 13.000 rpm durante 1 min.) </li><li> Adicionar 1 ml de tampão spheroplasting. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 15 min. Confira as células a cada poucos minutos, sob microscópio até a maioria das células são negros (ou seja, não phase-brilhante). </li><li> Lavar 2x com tampão B gelado, girando a uma velocidade baixa (~ 3500 rpm). </li><li> Adicione 1 ml de EtOH a 70%, ressuspender cuidadosamente e deixar durante a noite a 4 ° C (pode armazenar indefinidamente a -20 ° C). </li></ol> 5. Procedimento de Hibridação <ol><li> Preparar a solução de hibridização: para 100 ul de tampão de hibridação, adicionar 1-3 mL de detecção, depois vórtice e centrifuga-se. Sondas Cantor usar 8-10 total de ng por conjunto da sonda (ou seja, por gene). Temos fotografada até três genes simultaneamente com três difsonda marcada rente define. </li></ol> Certifique-se de aquecer a solução de hibridização à temperatura ambiente antes de abri-lo. Para sondas Stellaris, recomenda-se iniciar quatro reacções de hibridação em separado pela adição de 1 ul de cada uma de 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100 diluições de trabalho de sondas para ver qual é óptima. Diluições de trabalho de sondas Stellaris são preparadas em tampão de hibridação. <ol start="2"><li> Centrífuga (para todos os passos subsequentes, 3.500 rpm, 5 min) as células fixas (por exemplo, 200 ul) e aspirar para fora do etanol. </li><li> Suavemente ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem que contém a mesma percentagem de formamida como tampão de hibridização. Deixe repousar por 2-5 min. </li><li> Centrifugar amostra e tampão de lavagem aspirado, em seguida, adicionar solução de hibridização. Incubar no escuro, com agitação suave, O / N a 37 ° C. </li></ol> Nota: o procedimento a seguir é para a aplicação de células / Imagem em lamelas. Para wcalcinação / células de imagens em placas de 96 poços, incluindo limpador solução alternativa espécies reativas de oxigênio ver <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> No dia seguinte, ou antes, limpo (ver procedimento) e tratar lamelas com 150 ul de 0,01% de poli-L-lisina, durante 5 min. Aspirar, deixe secar, lave 3x com dH 2 O e deixe secar. </li><li> Na manhã seguinte, adicionar 1 ml de tampão de lavagem para a amostra, ressuspender cuidadosamente, de centrifugação e aspiração, ressuspender em seguida mais 1 ml de tampão de lavagem e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lava-se com 2X SSC + 0,1% de Triton X-100 à temperatura ambiente no agitador de 15 min. </li><li> Tome meio de montagem de freezer para permitir que ele venha até RT antes da montagem. </li><li> Lava-se com 1X SSC a RT 15 min, em agitador. </li><li> Diluir DAPI em PBS (0,1 ug / ml final) e ressuspender as células em 150 ul. </li><li> Solução local para limpeza / poli-Lys-tesouroted tampa desliza na placa de 12 poços, de pelo menos 30 minutos sem ser perturbado. </li><li> Remova a solução (você pode colocá-lo em uma lamínula de reposição como um backup) e lavar 3x com 1 ml de 1X PBS. </li><li> Coloque 3 ml de prolongar meio de montagem de ouro em um slide (Invitrogen P36934). Faça isso um de cada vez se você tiver vários deslizamentos de cobertura para evitar a secagem do meio de montagem. </li><li> Adicionar ~ 0,5 ml de etanol a lamela na placa de 12 poços, remover a lâmina de cobertura e de ar seco, mantendo, com uma pinça. </li><li> Coloque a tampa do lado da cela de deslizamento para baixo em meio de montagem e deixar endurecer várias horas ou O / N no escuro. </li><li> Selar as bordas com unha polonês e proceder à imagem. </li></ol> 6. Imagem de células com Olympus IX-81 Visão geral microscópio invertido <ol><li> Para a aquisição de imagens que utilizam software Slidebook (inteligente-imaging.com) e 100X, 1,45 NA, objetivo petróleo TIRFM. Para a série GFP, DAPI, Cy3, Cy5 Cy3.5 e imagem: conjuntos de filtros Chroma (ver reagentes). </li><li> Use filtro DAPIpara encontrar e concentrar células. </li><li> Definir isso como ponto de referência. </li><li> Tome uma z-stack de imagens ao redor do ponto de referência onde a distância total é de 5 mm com tamanho de 0,2 mM (25 aviões). Repita para cada canal de corante (ou seja, conjunto de cada sonda). </li><li> Exportar como um TIFF de 16 bits para análise de imagem. </li></ol> 7. Resumo Análise de Imagem (Sondas cantor) Abaixo fornecemos um esboço de métodos computacionais que usamos para a análise de imagens de peixes em MATLAB. As funções do MATLAB relevantes utilizados estão entre colchetes à direita. Os algoritmos e limites estão ajustados para dados de sondas estilo cantor. Usando sondas estilo Stellaris exigirá algum ajustamento, particularmente para o passo final de filtragem (7.8). Identificação de células 15 <ol><li> Celas separadas de fundo usando um limiar global sobre DAPI imagens de 16 [graythresh]. </li><li> Identificar núcleos usando a função maxima estendida [imextendedmax]. </li><li> Células segmento usando núcleos como sementes para um algoritmo de watershed [divisor de águas]. </li></ol> Encontrar pontos em cada canal de fluorescência <ol start="4"><li> Executar a transformação cartola para normalizar fundo e melhorar a relação sinal-ruído [bwmorph]. </li><li> Encontrar máximos para identificar a camada de focagem (no plano z) para cada mancha [imregionalmax]. </li><li> Filtrar pontos potenciais usando um modelo de ajuste linear a um gradiente radial. </li></ol> Intensidade da mancha medida e sinais de filtro simples vs múltipla sonda <ol start="7"><li> Montar um perfil gaussiano 2D para o local na camada de focagem previamente identificados e intensidade de estimativa 17. </li><li> Filtrar os pontos fracos que utilizam um limiar (baseado em um histograma). Para o tipo de cantor sondas isso é importante, mas é menos para as sondas Stellaris. </li><li> Contagem de pontos em cada célula. </li></ol>

<ol>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Até à data, FISH tem sido principalmente um método de baixo rendimento. O uso de Cy3, Cy3.5, Cy5 e corantes limita o número de genes pode-se investigar em células individuais ou três de cada vez. Algumas sondas adicionais têm sido desenvolvidos (Stellaris), mas o número de sondas distinguíveis é ainda, no máximo sete. Para ultrapassar esta limitação, as estratégias de rotulagem combinatórias usando vários fluoróforos têm sido usados ​​para criar os códigos de barras para as diferentes espécies de ARNm 19,20. Mais recentemente, Lubeck e Cai usado barcoding óptica e espectral para quantificar 32 espécies diferentes em simultâneo com FISH em células de levedura único 19. Uma das limitações dessa abordagem combinatória recente é que ele requer a utilização de microscopia de super-resolução. A análise necessária para distinguir as sondas de código de barras é também bastante complexa. Descobrimos que Cy3 e Cy3.5 são preferíveis para Cy5 para experiências de FISH. Uma das limitações do corante Cy5 é a sua sensibilidadea fotodegradação. No entanto, Stellaris desenvolveu recentemente Cy5 variantes que são anunciados como mais resistentes à fotodegradação, e pode aliviar este problema técnico. É importante notar também que o peixe é um método caro de implementar e que tanto o cantor e Stellaris sondas normalmente custam US $ 700 - US $ 1.000 por conjunto da sonda, embora os preços para sondas disponíveis no mercado devem diminuir no futuro. Poupadores de reagentes e rotulagem eficiente traz sondas cantor até a faixa mais baixa de preço. Um dos grandes desafios técnicos é a separação dos pontos de sonda única versus múltiplas, o que requer a implementação de sofisticados algoritmos de ponto-determinantes. Isso pode levar extensa revisão manual para ajustar os parâmetros de análise de imagem para montagens experimentais específicos. Um esboço de nosso pipeline computacional com funções MATLAB relevantes é fornecida na Seção 7 do protocolo. Esta questão é um pouco aliviado pelas sondas Stellaris que apenas têm<html> uma etiqueta por sonda. É, portanto, requer a co-localização de várias sondas para ver um sinal. Porque FISH requer a fixação de células, isso não facilitar o rastreamento de células individuais ao longo do tempo. Anteriormente, foram utilizados dados instantâneos peixe para reconstruir a dinâmica da expressão gênica em metabolicamente populações de leveduras de ciclismo individuais 6. Ciclismo metabólica é observada no pré-esfomeados, culturas contínuas, e é caracterizada por em toda a população oscilações coletivas no consumo de oxigênio. Essas oscilações estão associadas com o genoma de toda oscilações de transcrições que ocorrem por meio de todos os genes de leveduras em diferentes fases do consumo de oxigênio. Buscou-se determinar se ciclismo metabólica esteve presente em culturas de leveduras não sincronizadas contínuas. Se estiverem presentes, os transcritos que são anti-correlacionados em populações síncronas também deve ser anti-correlacionados em células individuais não sincronizadas, e vice-versa para as transcrições de correlacionadas. ent &quot;&gt; Para reconstruir dinâmica da produção de ARNm de tempo, os dados observados instantâneo deve ser comparado com o que é esperado a partir de um modelo de comportamento subjacente. existem limitações teóricas ao quando tais&quot; instantâneos &quot;de dados de expressão de genes podem ser usadas para determinar a dinâmica de expressão de genes subjacentes e que tipos de modelos podem ser distinguidos 21. Pelos dados do ciclo metabólicos, ao invés de mostrar diretamente a presença de oscilações temporais, medidas estatísticas foram implementadas para comprovar que realmente existe uma célula de programa oscilatório autônoma consistente com microarray massa medições.

Utilizando técnicas de medição de massa, não é possível ensaiar a quantidade de transcritos ou atividade transcricional dentro de células individuais 1. Usando proteínas fluorescentes dirigidos por promotores de interesse como repórteres de expressão do gene pode resolver este problema, em certa medida, mas o tempo necessário para as proteínas fluorescentes para dobrar obscurece dinâmica precoces. Proteínas fluorescentes de longa duração também não pode relatar vidas de mRNA. O método de peixe pode ser usado para ensaio de ARNm durante o seu ciclo de vida completo, desde o início da transcrição no núcleo para a maturação e posterior deterioração das células individuais, com a resolução de uma única molécula. O original experimentos in situ para a visualização de ácidos nucléicos utilizadas sondas de RNA radiomarcados para sondar elementos de DNA. Estes incluíram visualizando ADN ribossomal em ovários da rã Xenopus laevis e 2 de ADN em tecido de rato por satélite 3. O primeiro fluorescente in situ em experiment usada uma molécula de ARN marcado com um fluoróforo para sondar as sequências de ADN específicas 4. A primeira aplicação de sondas fluorescentes para a visualização de RNA in situ foi a visualização da expressão do gene de actina de galinha em cultura de tecido muscular 5. Mais recentemente, na levedura de brotamento, FISH tem sido utilizada para investigar as oscilações na transcrição durante o ciclo metabólico levedura 6, o decaimento do ARNm durante a progressão do ciclo celular 7, e localização espacial dos transcritos de ARNm durante a mitose 8. FISH tem sido utilizado em fermento para mostrar que as flutuações não correlacionadas em genes constitutivamente transcritos, que constituem mais de metade de todos os genes de levedura, surgem uncorrelated iniciação da transcrição 9. Nas espécies não-levedura, FISH foi usado para identificar os marcadores de células-tronco no intestino do rato 10 e para determinar que a penetrância incompleta dos destinos de células pode resultar de flutuações de expressão de genes em C. estocásticoselegans embriões 11. O método descrito aqui funciona FISH por hibridização marcados com corante, as sondas de ADN de cadeia simples com o ARNm mensagens. As células são fotografadas e os mRNAs são contadas usando um algoritmo local de detecção. Sondas de cadeia simples podem ser gerados com um sintetizador de ADN e, em seguida rotulado (aqui referida como sondas de Singer) ou ordenados comercialmente como sondas de pré-marcadas (Stellaris sondas) 12,13. Uma diferença importante entre o cantor e Stellaris sondas é que as sondas são mais Cantor (~ 50 pb), e são multi-rotulado, enquanto as sondas são curtas Stellaris (~ 20 pb), com apenas uma etiqueta por sonda, tal como descrito por Raj et al 14. Além disso, a abordagem Stellaris utiliza sondas por muitos mais genes do que a de Cantor (~ 30 contra 5 sondas por gene, respectivamente). Abaixo é proporcionado um protocolo que descreva o uso de qualquer tipo de sonda. Na seção 2, apresentamos um protocolo para a rotulagem de amino-alil sondas thymidine contendo wom um corante Cy escolhido. Uma visão geral dos passos computacionais necessários para identificar pontos de mRNA individuais é fornecida na Seção 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

A hibridação in situ fluorescente (FISH), o método permite a detecção de ácidos nucleicos no ambiente celular nativo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a utilização de FISH para quantificar a quantidade de ARNm em células de levedura individuais. As células podem ser cultivadas em qualquer condição de interesse e, em seguida, fixado e tornado permeável. Posteriormente, vários deoxyoligonucleotides single-stranded conjugado com corantes fluorescentes são usados ​​para rotular e visualizar mRNAs. Difracção de fluorescência limitada a partir de moléculas de mRNA individuais é quantificada utilizando um algoritmo de detecção de ponto de identificar e contar o número de mRNAs por célula. Enquanto os métodos de quantificação mais padrão de manchas de Northern, RT-PCR e microarrays de expressão do gene de informação sobre os mRNAs da população média em grandes quantidades, PEIXE facilita tanto a contagem e localização destes ARNm em células individuais com uma resolução de uma única molécula.

A figura 3 mostra histogramas típicos calculado a partir de imagens FISH e utilizada para determinar a quantidade de ARNm presente nas células individuais. Uma vantagem importante da microscopia baseado quantificação de ARN é que se pode obter informação sobre a localização de transcritos. Por exemplo, foi utilizado para identificar mRNAs FISH em células individuais com uma indutível CBF1 alelo (Figura 4). Como muitas moléculas de mRNA estão presentes no local da transcrição, que são capazes de identificar a presença e localização de sítios de transcrição no núcleo. Através da utilização de diferentes corantes de etiquetas de mRNAs de genes diferentes, pode-se quantificar a múltiplas espécies de mRNA nas mesmas células. Para demonstrar isto, as células de levedura foram incubadas na presença de factor-α e sorbitol. FUS1 transcrição (corante Quasar670, vermelho) é induzida por α-fator. Transcrição STL1 (tintura 570 Quasar, verde) é induzida pelo aumento da osmolaridade extracelular ( <strong&gt; Figura 5). Figura 4 é um exemplo de FISH com as sondas cantor. Figura 5 é um exemplo de FISH com as sondas Stellaris. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de procedimento experimental FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemático do gasoduto de análise de imagem. Os pontos finais são determinados na figura da direita. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figura 3. Histograma de intensidades local para um gene em particular usando sondas cantor </strong&gt;. Intensidades de sonda são computados dentro (vermelho) e fora das células (azuis). Pontos de baixa intensidade são ou ruído ou sondas individuais. Mensagens de mRNA reais são rotulados com várias sondas. Ao usar sondas Stellaris, sondas individuais são menos detectáveis ​​e, portanto, os limites e filtragem deve ser ajustada em conformidade. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figura 4. Os resultados representativos do procedimento FISH cantor. Nesta experiência, CBF1 transcrição é activada com um promotor indutível 18. Núcleos estão manchadas azul com DAPI. CBF1 mRNAs são marcados com sondas Cy3-marcadas. As setas brancas, evidenciar a presença de CBF1 sítios de transcrição no núcleo. Transcritos de mRNA individuais são visíveis no citoplasma. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figura 5. Os resultados representativos do procedimento FISH Stellaris. As células de levedura foram expostas simultaneamente Mata a 30 ng / ml de factor-α e 0,75 M de sorbitol durante 10 minutos e, simultaneamente, foram sondadas para FUS1 (Quasar 670, vermelho) e STL1 (Quasar 570, verde) transcrições. Na caixa de destaque, podemos ver uma célula responder apenas ao feromônio (FUS1 local de início, vermelho) e outro predominantemente respondendo ao sorbitol (local de início STL1, verde).

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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo descreve o procedimento experimental para a realização de Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH) para a contagem de mRNAs em células individuais em resolução de uma única molécula.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K visualizações.  Princeton University. Este protocolo descreve o procedimento experimental para a realização de Fluorescência In situ Hybridization (FISH) para a contagem de mRNAs em células individuais em resolução de uma única molécula.

Vídeo: Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.