Somos gratos a quatro revisores anônimos para melhorar o manuscrito, e com a National Science Foundation (Grant IOS-0546784) para o apoio.

1. Condutância da folha de medição hidráulica para Folhas hidratado (K max) <ol><li> Colete tiros de preferência à noite ou a noite de tal forma que as tensões do xilema são baixos, corte no ar e coloque em saco plástico escuro repleto de toalhas de papel molhado. No laboratório, recut pelo menos dois nodos a partir do final de cada tiro sob a água. Deixe disparar hidratar durante a noite em água pura, ou outra solução a ser usado para as medições de folha K. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator. </li><li> Corte a folha do tiro com uma lâmina de barbear fresco sob solução fluxo parcialmente desgaseificado. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator. Recomendamos desgaseificação a solução durante a noite num frasco utilizando uma bomba de vácuo, mas outros métodos podem ser utilizados. </li><li> Envoltório parafilme pré-esticada ao redor da petiole para assegurar uma boa vedação entre o pecíolo e tubos. Este passo é especialmente útil para não-redondas pecíolos, como embrulho parafilme extra vai ajudar em volta do pecíolo para caber dentro da tubulação. Pasta dental pode ser aplicado ao pecíolo antes de envolver o parafilme para preencher sulcos em pecíolos. </li><li> Ligue a folha de tubo de silicone em água ultrapura para evitar que o ar que entra no sistema. À medida que a folha é levantada acima da fonte de água, a água na tubagem está sob pressão subatmosférica, e, portanto, a vedação é boa se nenhum ar é aspirado para dentro do tubo durante a medição. Como alternativa para vedar o pecíolo directamente na tubagem de silicone, com um encaixe de compressão da junta de borracha podem ser usados ​​(por exemplo, (Omnifit A2227 adaptador furo; Omnifit, Cambridge, Reino Unido); esta abordagem é útil para o pecíolo com formas especialmente complexos, ou por folhas de relva , que pode ser envolvida em torno de uma vareta de vidro e seladas com o encaixe de compressão. Quando possível, selando o pecíolo directamente em silicone tubagem tem a vantagem de ser rápida e deixando uma junção pecíolo-tubo, que é transparente, permitindo que as bolhas sejam mais facilmente vistos. A tubagem liga a folha de tubo rígido correr para um cilindro graduado no equilíbrio (± resolução 10 ug), que regista dados cada 30 segundos a um computador (por exemplo, utilizando &quot;Balance Link&quot; Software; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Suíça) para o cálculo da taxa de fluxo através da folha. </li><li> As folhas devem ser realizadas para cima superfície adaxial em molduras de madeira amarradas com linha de pesca acima de um ventilador grande caixa e sob uma fonte de luz (&gt; 1.000 m 2 mol • • s -1 radiação fotossinteticamente ativa de alta irradiância medições), ligeiramente acima do nível de o menisco no cilindro graduado. A folha deve ser colocada acima da água no cilindro graduado para assegurar que a água em movimento para a folha é impulsionado pela transpiração, e que não entram na folha sob pressão devido à gravidade, como o fariaser o caso se a folha foi colocado abaixo do menisco da água no cilindro. Pequenos recipientes cheios com uma toalha de papel molhado é colocado dentro da câmara de equilíbrio para assegurar o ar no equilíbrio é saturado com água, evitando assim a evaporação a partir da fonte de água para a atmosfera na balança. Esta possibilidade pode ser verificada por travar a fluir para a folha, usando uma válvula de torneira de quatro vias na tubagem, e verificar que a massa do cilindro de água sobre o saldo não diminui. </li><li> Coloque um recipiente de Pyrex transparente cheio de água acima da folha para absorver o calor da lâmpada. </li><li> Manter a temperatura da folha, entre 23 ° C e 28 ° C durante toda a experiência por adição de água mais fria para o recipiente de Pyrex de tal modo que a lâmpada de aquecimento não aquece o recipiente de Pyrex suficiente para aquecer o ar em torno da folha inferior. </li><li> Permitir que a folha a transpirar em cima do aparelho, pelo menos, 30 min, dando assim tempo suficiente para aclimatar a alta irradiância e additionally taxa de fluxo até que tenha se estabilizado, sem tendência para cima ou para baixo, e com um coeficiente de variação &lt;5%, pelo menos no local de medição 5-10 feitas a intervalos de 30 seg de fluxo. É essencial para a taxa de fluxo para atingir um estado de equilíbrio, porque este método pressupõe uma folha Ψ estável. Estudos anteriores encontraram estes critérios para ser suficiente para a estabilização do caudal (E), folha folha Ψ e K; testes com períodos mais longos de medição após fluxo estável foi estabelecido não mostrou qualquer relação de folha K para o tempo de medição de cada um dos sete espécies de uma gama gama de folha capacitância 17,18. Estabilização geralmente demora de 30 minutos ou menos, mas, em algumas espécies podem requerer mais do que uma hora para algumas espécies. </li></ol> Nota: Quando o caudal é muito baixa (&lt;8 ug s -1), a estabilidade pode ser determinado usando a média das últimas cinco intervalos de 30 seg. </p&gt; <ol start="9"><li> Descarte as medições se o fluxo muda de repente, quer devido ao fechamento dos estômatos súbita, ou fugas resulta do selo ou bloqueio no sistema por partículas ou bolhas de ar. </li><li> Quando o fluxo se estabiliza, registrar a temperatura da folha com um termopar. </li><li> Remover rapidamente a folha do tubo, dab secar o pecíolo e colocar a folha para um saco selável, que tinha sido previamente exalado em, para interromper a transpiração. </li><li> Deixe que a folha se equilibrar no seu saco, pelo menos, 20 min. </li><li> A média dos últimos 10 medições da vazão. Esta será a sua medição E. </li><li> Quando a folha é equilibrada, medir o potencial da água na última folha (Ψ final) com uma câmara de pressão. </li><li> Medir a área foliar com um digitalizador de mesa e software de processamento de imagem, ou com um medidor de área foliar. </li><li> K folha é calculado como E / ΔΨ-folha (onde ΔΨ folha = Ψ finais </sub&gt; - 0 MPa) e mais normalizada pela área foliar. As unidades estão em mmol m -2 s -1 MPa -1. Porque a folha está posicionada logo acima do nível da água no cilindro graduado, o efeito da gravidade na redução da pressão de água que entra na folha seria insignificante, especialmente em relação ao último Ψ, que é sempre&gt; MPa -0,1. </li><li> Para corrigir as alterações na folha K induzida por dependência da temperatura da viscosidade da água 15,19,20, padronizar os valores de K da folha a 25 ° C, utilizando a seguinte equação: </li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3.863in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1.jpg" /><ol start="18"><li> Condutância estomática (g s) pode ser determinada como E dividido pela diferença de pressão entre folha e de vapor do ar, equivalente à pressu vapordéfice re (DPV), determinada utilizando uma temperatura e sensor de humidade relativa adjacente à folha. VPD é calculada usando a seguinte equação 21 </li></ol><img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2.jpg" fo:content-width="1.67in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2highres.jpg" /> onde RH é a humidade relativa, VP é a pressão de vapor de saturação do ar (em kPa; uma função da temperatura, de acordo com a equação de Buck Arden 22), e AP, a pressão atmosférica (em kPa). 2. Medição de condutância da folha hidráulica para folhas desidratadas <ol><li> Colete tiros de preferência à noite ou a noite de tal forma que as tensões do xilema são baixos, corte no ar e coloque em sacos plásticos escuros cheios de toalhas de papel molhado. No laboratório, recut pelo menos dois nodos a partir do final de cada tiro sob a água. Deixe disparar hidratar durante a noite em água pura, ou outra solução a ser utilizado para o K lemedições AF. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator. </li><li> Cortar brotos em segmentos com pelo menos três folhas sob água ultrapura e desidratar tiros com um ventilador por diferentes períodos de tempo para um intervalo de valores da folha Ψ. </li><li> Uma vez que tiros são desidratadas, coloque sacos sealable (Whirl-Pak; Nasco, Fort Atkinson, WI, EUA), que tenham sido previamente exalado em) em torno de cada folha do tiro, e em seguida, coloque a filmagem inteira em um grande saco lacrado com papel molhado toalha. </li><li> Deixe a filmagem equilibrar durante pelo menos 30 min (para sessões fortemente desidratados vezes equílibrio mais longos podem ser necessários). </li><li> Após o equilíbrio, imposto a folha superior e inferior e medida inicial Ψ folha (Ψ = o) utilizando uma câmara de pressão. </li><li> Descartar o tiro, se a diferença na folha Ψ destas duas folhas é superior a 0,1 MPa (por stronfolhas desidratadas gly, este intervalo pode ser alargado a 0,3 MPa). </li><li> A terceira folha é então usado para determinar K foliar e g s com a EFM, seguindo as etapas de 1,2 -1,18 acima. Notavelmente, E estado estacionário pode ser obtida, mesmo para as folhas que foram severamente folhas desidratadas, como estômatos abrem e gerar valores substancialmente maiores do que a condutância cuticular 17 g s. </li><li> Para a construção das curvas de vulnerabilidade hidráulicos, calcular K folha utilizando o último Ψ como no passo 1.16, e, em seguida, os valores de K da trama folha contra o que for mais baixo, o Ψ Ψ ou final, ou seja, a mais forte desidratação experimentado pela folha durante a experiência (= Ψ menor). Do mesmo modo, a queda de g s, em resposta a desidratação da folha pode ser determinado através da representação gráfica g s contra Ψ menor. Trabalho anterior tem sh<html> desidratação que induz próprio, pelo menos, parcialmente declínios irreversíveis em folha e K s g 14,16. </li><li> Recomendamos obter pelo menos 6 valores de K foliares por 0,5 MPa de intervalo menor Ψ (esse intervalo pode ser reduzida para 0,25 MPa, se a espécie que está a trabalhar é muito vulnerável à desidratação). </li><li> Realizar teste Dixon outlier em valores da folha de K para cada intervalo de água de 0,5 MPa potencial de menor Ψ para remover outliers em sua curva de vulnerabilidade 23. </li><li> Porque as espécies diferem em suas respostas de K foliar e s g à desidratação 14,16, cabem funções diferentes para cada espécie e selecione a máxima verossimilhança (menor valor do AIC, ver 14 para detalhes). Recomendamos montagem, pelo menos, quatro funções anteriormente utilizados na literatura: linear (pg &quot;fo: conteúdo largura =&quot; 1.4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg &quot;/&gt;), sigmoidal ( <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4.jpg" fo:content-width="1.483in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4highres.jpg"/> ), Logística ( <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5.jpg" fo:content-width="1.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5highres.jpg"/> ) E exponencial ( <img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6.jpg" fo:content-width="1.583in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6highres.jpg"/> ). </li></ol> 3. Resultados representativos O declínio da condutância hidráulica folha com desidratação varia fortemente entre as espécies (Fig. 1). Espécies sensíveis à seca experimentar um forte declínio em potenciais hídricos menos negativos do que as espécies mais tolerantes à seca, quando medido sob alta irradiância (PAR&gt; 1.000 mmol m -2 • • s -1). A águapotencial de 80% de perda de condutividade hidráulica (P 80) para mesic erva Helianthus annuus foi de 3 MPa menos negativa do que a de Heteromeles arbutifolia, nativo da Califórnia chaparral. Heteromeles arbutifolia responderam linearmente para o declínio no potencial de água, enquanto que Helianthus annuus mostrou um não -linear declínio. Condutância estomática (g s) e condutância hidráulica folha (folha K) podem também reagir de forma dramática a irradiância (Fig. 2). Para Raphiolepis indica, a condutância estomática diminuiu fortemente com a desidratação de folhas medidos sob alta irradiância (PAR&gt; 1.000 mmol m -2 • • s -1) e sob a luz de laboratório (PAR &lt;6 mmol m -2 • • s -1). Sob alta irradiância, as folhas medido com o EFM que tinha sido desidratado para o potencial de água que é típico para bem iluminado leaves de plantas intactas ao meio-dia mostrou semelhante g s como para as folhas medidos nas plantas com uma porômetro (estrela na fig. 2). Notavelmente, para as folhas de hidratação máxima, K foliar foi quatro vezes maior de folhas expostas à alta do que baixa irradiância (11 vs 2,8 mmol m -2 s -1 MPa -1) e, portanto, K folhas apresentaram resposta mais forte a luz do bem folhas hidratadas do que g s. Além disso, sob alta irradiância, K folha diminuiu mais fortemente com a desidratação. A P 80 foi de 0,93 MPa menos negativo em alta de baixa irradiância. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig1.jpg" /> Figura 1. Curvas Folha hidráulicos de vulnerabilidade para uma seca sensível (em cima) e um tolerantes à seca (inferior) a partir de espécies (14,24). Cada ponto representa um pecadomedição gle de folha condutância hidráulica (K folha) sobre uma folha separada usando o método de evaporação do fluxo (EFM). As barras verticais representam o potencial da água no qual as espécies perdeu 80% da condutância inicial hidráulica (P 80). Melhores funções de ajuste utilizando máxima verossimilhança são plotados para ambas as espécies. <img alt="Equação 7" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7.jpg" fo:content-width="3.293in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7highres.jpg"/><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig2.jpg" /> Figura 2. A resposta da condutância estomática (g s) e condutância hidráulica (K folha) para o potencial de água na folha de declínio Raphiolepis indica medido sob alta vs baixa irradiância (de 16). (PAR&gt; 1.000 e &lt;6 mmol m -2 • • s-1). Cada ponto representa uma única medição em uma folha separada usando o método de fluxo de evaporação (EFM), com pontos brancos e negros representam folhas medidos sob alta irradiância e baixo, respectivamente. Equações para curvas de condutância estomática em alta irradiância vs baixo: <img alt="Equação 8" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8.jpg" fo:content-width="4.727in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8highres.jpg" /> e <img alt="Equação 9" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9.jpg" fo:content-width="2.26in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9highres.jpg"/> . Equações para as curvas de vulnerabilidade em alta irradiância vs baixo: <img alt="Equação 10" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10.jpg" fo:content-width="2.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10highres.jpg"/> e <img alt="Equação 11" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11.jpg" fo:content-width="1.8in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11highres.jpg"/> . A estrela de cinza no painel superior representa a média ± standard erro para g s e potencial de água na folha medida em folhas de plantas intactas ao meio-dia com um porômetro. Cinza e preto barras verticais no painel inferior representa o potencial de água em que a espécie perdeu 80% da condutância foliar inicial hidráulica (P 80) sob alta irradiância e baixo, respectivamente.

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T., Salleo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylem+cavitation+in+the+leaf+of+Prunus+laurocerasus+and+its+impact+on+leaf+hydraulics.">Xylem cavitation in the leaf of Prunus laurocerasus and its impact on leaf hydraulics.</a> Plant Physiol. 125, 1700-1709 (2001).</li><li>Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+closure+during+leaf+dehydration,+correlation+with+other+leaf+physiological+traits.">Stomatal closure during leaf dehydration, correlation with other leaf physiological traits.</a> Plant Physiol. 132, 2166-2173 (2003).</li><li>Blackman, C. J., Brodribb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+measures+of+leaf+capacitance:+insights+into+the+water+transport+pathway+and+hydraulic+conductance+in+leaves.">Two measures of leaf capacitance: insights into the water transport pathway and hydraulic conductance in leaves.</a> Funct. Plant Biol. 38, 118-126 (2011).</li><li>Nardini, A., Raimondo, F., Lo Gullo, M. A., Salleo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leafminers+help+us+understand+leaf+hydraulic+design.">Leafminers help us understand leaf hydraulic design.</a> Plant Cell Environ. 33, 1091-1100 (2010).</li><li>Sheriff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+sites+and+distillation+in+leaves.">Evaporation sites and distillation in leaves.</a> Ann. Bot. 41, 1081-1082 (1977).</li><li>Canny, M. J., Huang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+water+content+and+palisade+cell+size.">Leaf water content and palisade cell size.</a> New Phytol. 170, 75-85 (2006).</li><li>Santiago, L. S., Mulkey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+test+of+gas+exchange+measurements+on+excised+canopy+branches+of+ten+tropical+tree+species.">A test of gas exchange measurements on excised canopy branches of ten tropical tree species.</a> Photosynthetica. 41, 343-347 (2003).</li><li>Sack, L., Cowan, P. D., Jaikumar, N., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'hydrology'+of+leaves:+co-ordination+of+structure+and+function+in+temperate+woody+species.">The 'hydrology' of leaves: co-ordination of structure and function in temperate woody species.</a> Plant Cell Environ. 26, 1343-1356 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de evaporação do fluxo aqui apresentada permite a determinação relativamente rápida (30 minutos) de condutância hidráulica foliar em laboratório com medição simultânea da condutância estomática. A EFM é medida pelo método que se segue mais de perto a via natural de água das folhas, dado que a água evapora nos espaços aéreos folha e difunde a partir do estomas 15. Uma série de outros métodos experimentais para determinação K folha existem 25, com três sendo especialmente comum. (1) No método de fluxo de alta pressão (HPFM), a água é empurrada através da folha sob pressão elevada, 15,26. No entanto, as curvas de vulnerabilidade não pode ser obtida com este método porque aplicadas pressões positivas podem encher êmbolos e hidratar o tecido mesófilo. (2) No método de re-hidratação cinética (RKM), K folha é calculada usando a analogia entre a re-hidratação das folhas desidratadas com o charging de um condensador em série com um 27,28 resistores. Este método é rápido, mas não se reproduzem todo o sistema de vias naturais transpirational na folha e não é facilmente modificado para permitir a medição de folhas aclimatadas à alta irradiância. (3) No método de bomba de vácuo (VPM), a folha é colocada numa câmara, a sua pecíolo ligado a uma fonte de água no equilíbrio, enquanto aspiradores de intensidades diferentes são aplicadas a uma perda de condução da água da folha da folha de 15,26. Este método pode ser demorado. As medições utilizando os três métodos foram encontrados para dar resultados consistentes 15,28,29, e, assim, o EFM é frequentemente utilizado devido à sua baseando-se em movimento de água transpirational, e sua rapidez relativa, e a sua modificação para a medição de folha K sob diferentes condições. Todos os métodos típicos usados ​​para a determinação da folha K envolvem um grau de incerteza na quantificação accurately a força motriz que corresponde a transpiração 25. Na EFM, a folha utilizada para calcular ΔΨ folha K é menor do que a verdadeira força motriz, uma vez que se baseia na folha Ψ granel após a folha é equilibrada pela bomba de pressão. Neste ponto, a folha Ψ granel que não representam necessariamente o potencial da água das células no final da via hidráulica, em que a água se evapora, mas sim uma média ponderada por volume para as células de um número relativamente pequeno de baixo potencial hídrico onde a água é mover-se e evaporando, e para as células mais numerosas de água elevado potencial que podem ser isoladas a partir do fluxo de transpiração. Quanto a folha Ψ difere da verdadeira força motriz depende, assim, em que a água se evapora na folha. Se a água evapora toda a folha, a folha Ψ em massa pode estar perto da verdadeira força motriz, e se a água evapora apenas de c relativamente poucosells perto dos estomas, a folha de massa pode Ψ substancialmente subestimam a verdadeira força motriz, isto é, o potencial da água das células podem, de facto, ser muito mais baixa e, portanto, folha K real seria menor do que a verificada com o MFE. Assim, na medida em que K folha determinada pelo EFM representa a folha verdadeira K é sensível às vias de fluxo de água, o que ainda não são bem compreendidas. Enquanto o EFM fornece dados que correspondem aos de outros métodos de medição K folha (ver acima), e é excelente para utilização comparativa, a possibilidade de variação da espécie em vias de fluxo de água através do mesofilo precisa de mais investigação. Com efeito, mesmo para folhas de espécies dadas, estas vias de água podem variar em diferentes condições, por exemplo, sob diferentes irradiâncias e cargas de calor 4,30 ou do estado da água diferente (dado o encolhimento do tecido) 31. Mais conhecimentodas vias de transporte de água, o que permitiria a EFM para ser utilizado para resolver os efeitos das mudanças de vias de transporte da folha global hidráulico. A medição da condutância estomática na EFM tem as vantagens de permitir a determinação de respostas a irradiância e desidratação, e proporcionando as respostas correspondentes de g s com folha K. Além disso, o efeito de desidratação da folha anterior, seguido por re-hidratação em g s pode ser avaliada com o presente método. No entanto, este método tem duas desvantagens potenciais. Em primeiro lugar, esta medição g s é feita sobre uma folha excisada, em vez de uma planta intacta e, segundo, a determinação da condutância estomática é baseada na medição do clima certa distância da folha, em vez de fechar a folha como em uma câmara porómetro , embora a folha de ventilação com o ventilador equilibra a superfície da folha com o ar circundante. Para algumas espécies, excisadosfolhas podem apresentar diferentes respostas estomáticas do que para as folhas em uma planta intacta 16,32. No entanto, por várias espécies g s estimados utilizando a EFM foi semelhante aos valores medidos nas plantas intactas com um porómetro de folhas ao meio-dia Ψ folha 16 (Fig. 2). A EFM podem ser aplicados para discernimento fisiológico, isto é, investigar a dinâmica de K foliar, a sua base na estrutura e anatomia, e suas respostas aos factores ambientais. Além disso, o método pode ser utilizado para comparar as plantas de espécies dadas crescidas sob diferentes condições, ou de diferentes idades, ou para comparar diferentes espécies de plantas adaptadas a diferentes ambientes. Através da construção de curvas de vulnerabilidade folha, pode-se obter insights sobre os mecanismos de tolerância à seca espécies. Durante a seca, a cavitação e colapso de células têm sido mostrados para ocorrer no xilema folha de algum<html> espécies e encolhimento da célula no mesofilo durante a desidratação pode também influenciar o movimento da água (revisto em 14). Estudos futuros serão necessários para determinar a importância relativa de cada um destes processos na condução do declínio de K foliar e fecho estomática. Irradiância também é um fator forte influenciando K foliar eo EFM é altamente adequado para medições sob alta irradiância. A resposta combinada das aquaporinas a irradiância e seca deve ganhar muito interesse. Irradiância elevada conduz a um aumento da expressão e / ou activação de aquaporinas que permitem o fluxo rápido de água através de células vivas, aumentando folha K, ao passo que leva à desidratação expressão reduzida e / ou de activatation de aquaporinas, reduzindo folha K. Os impactos combinados de irradiância e de abastecimento de água na folha K requerem mais investigações 4,10,16,33. tenda &quot;&gt; Além disso, através das espécies, K folha e sua vulnerabilidade tem sido relacionado com a distribuição das espécies em relação ao fornecimento de água, luz e outros recursos 3,13,24. Espécies de áreas secas tendem a mostrar maior resistência à queda hidráulica, de frente potenciais hídricos mais negativos do solo, e mantendo uma folha K elevado a potenciais mais negativos de água, que possam manter elevados g s e continuar a captura de CO2 para a fotossíntese 13,14. Assim, o estudo de propriedades hidráulicas folha fornece uma visão ao nível do celular, folha, e toda a planta e suas respostas ao meio ambiente, e é susceptível de produzir inúmeras novas descobertas importantes em todas as escalas.

measurement of leaf hydraulic conductance and stomatal conductance and their responses to irradiance and dehydration using the evaporative flux method (efm)

A água é um recurso fundamental, e a planta do sistema de transporte de água estabelece limites para o máximo crescimento e tolerância à seca. Quando as plantas abrir os estômatos para alcançar uma alta condutância estomática (g s) para capturar o CO 2 para a fotossíntese, a água é perdida pela transpiração 1,2. A evaporação a partir dos espaços aéreos é substituída a partir de paredes de células, por sua vez, o desenho de água a partir do xilema de nervuras, por sua vez, no desenho a partir de xilema nos caules e nas raízes. Como a água é puxada através do sistema, ela experimenta uma resistência hidráulica, criando uma tensão ao longo do sistema e um baixo potencial hídrico de folha (Ψ folha). A folha em si é um gargalo crítico no sistema de planta inteira, o que representa em média 30% da resistência da planta hidráulica 3. Condutância hidráulica (K = resistência de folha uma folha / hidráulico) é a razão entre a taxa de fluxo de água para o gradiente de potencial hídrico em toda a folha, e resume acomportamento de um sistema complexo:. água se move através do pecíolo e através de várias ordens de veias, sai na bainha e passa através ou em torno de células do mesofilo antes de evaporar no espaço aéreo e sendo transpirou da estômatos das folhas K é de grande interesse como uma traço fisiológico importante comparar as espécies, a quantificação da eficácia da estrutura da folha e fisiologia para o transporte de água, e uma chave variável para investigar a sua relação com a variação na estrutura (por exemplo, na arquitectura venation da folha) e os seus efeitos sobre as trocas gasosas fotossintéticas. Além disso, K folha responde fortemente ao ambiente da folha interna e externa 3. Folha K pode aumentar dramaticamente com irradiância aparentemente devido a alterações na expressão e activação das aquaporinas, proteínas envolvidas no transporte de água através de membranas de 4 e folha K diminui fortemente durante drdeveria, devido a cavitação e / ou o colapso das condutas do xilema, e / ou perda de permeabilidade dos tecidos do xilema-extra devido ao encolhimento e mesofilo feixe de células da bainha ou desactivação aquaporina 5-10. Porque K folha pode restringir g s e taxa fotossintética em espécies em condições bem regada e durante a seca, e, assim, limitar o desempenho planta inteira que pode, eventualmente, determinar a distribuição das espécies, especialmente as secas aumentam em freqüência e gravidade 11-14. Nós apresentamos um método simples para a determinação simultânea de K foliar e s g de folhas excisadas. Uma folha transpirante é ligado por sua pecíolo de tubagem em execução para uma fonte de água no equilíbrio. A perda de água a partir do balanço são registados para calcular a taxa de fluxo através da folha. Quando transpiração estado estacionário (E, mmol m -2 • • s -1) é atingido, g <sub&gt; S é determinado dividindo-se por vapor déficit de pressão, e K da folha, dividindo pela força de condução potencial de água determinado utilizando uma câmara de pressão (K folha = E / - Δψ folha, MPa) 15. Este método pode ser utilizado para avaliar as respostas da folha de K para diferentes irradiâncias e na vulnerabilidade da folha K à desidratação 14,16,17.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM at 

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Descreve-se um método relativamente rápido (30 min) e, simultaneamente, realista para medição da condutância hidráulica folha (<em&gt; K</em<sub&gt; Folha</sub&gt;) E condutância estomática (<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;) Para transpirar folhas excisadas. O método pode ser modificado para medir as respostas de luz e de desidratação<em&gt; K</em<sub&gt; Folha</sub&gt; E<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;.

Medição de condutividade hidráulica da folha e da condutância estomática e as respostas a irradiância e Desidratação Usando a evaporação Método Flux (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

measurement-leaf-hydraulic-conductance-stomatal-conductance-their

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

36.9K visualizações.  University of California, Los Angeles. Descreve-se um método relativamente rápido (30 min) e, simultaneamente, realista para medição da condutância hidráulica folha ( K

Vídeo: Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Biologia

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Um método inovador para exossomo Quantificação e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.

Relacionando condutância estomática a Folha atributos funcionais

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac Pressão-Volume Análise loop usando Conductance Cateteres em Ratos

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...