Gostaríamos de reconhecer a NSF para financiamento (CBET-0846259).

Consulte a Tabela 1 para a preparação de todos os suportes, tampões e soluções referenciadas neste protocolo. 1. Produção de Aha-Rotulado Adenovírus <ol><li> Preparar onze 100-mm pratos de cultura de tecidos de células de rim embrionário humano (HEK 293) mantidas em meio de crescimento HEK 293 célula (ver Tabela 1) a 37 ° C até terem atingido os 80 - 90% de confluência. (Nota:. As culturas com mais de 90% de confluência pode ser difícil de infectar e podem não produzir vírus como desejado) </li><li> Soltar as células em um dos pratos removendo primeiro o meio de crescimento, enxaguamento uma vez com 5 ml de tampão de TD, em seguida, incubando as células durante um min em 1 ml de tripsina-EDTA (1 ×). </li><li> Adicionar 9 ml de meio de crescimento HEK 293 célula, e usar um hemocitómetro para contar o número de células HEK 293 colhida a partir de este prato. Use esse número para calcular a quantidade de adenovírus tipo 5 (Ad5) necessária para a infecção usando um multiplicity de infecção valor (MOI) de 10 PFU / célula. Conta para o facto de, para Ad5 normal, o índice de infecciosidade (razão de partículas infecciosas para o número total de partículas) é tipicamente de 1:20. </li><li> Preparar 10 ml de tampão de infecção. </li><li> Lentamente remover o HEK 293 meio de crescimento de células a partir dos dez pratos de cultura restantes, em seguida, lava-se com 5 ml de tampão de TD. Adicionar 1 ml de tampão de infecção para cada prato e incubar a 37 ° C durante 1 hora. Durante este período de infecção, agite cada lado prato de cultura para o lado de 15 min de intervalo. </li><li> Após a infecção, adicionar 9 ml de meio de crescimento fresco HEK 293 célula e incubar a 37 ° C durante 18 hr. </li><li> Preparar 100 ml de meio de rotulagem Aha (ou Met meio de controlo para o controlo). Certifique-se de filtrar as soluções de concentrados com um filtro de seringa de 0,2 mM estéril antes de preparar os meios de comunicação de rotulagem. </li><li> Cuidadosamente (de modo a não lavar as células infectadas) remover o HEK 293 meio de crescimento celular após 18 hr umnd lavar cada prato de cultura com 5 ml de tampão de TD. </li><li> Remover a solução de lavagem TD tampão e adicionar 10 ml de meio Aha rotulagem para cada prato de cultura. Para um controle, meio de controlo de metionina deve ser utilizado em vez do meio de rotulagem Aha nesta etapa. </li><li> Incubar as células infectadas em meio de rotulagem, a 37 ° C durante 6 hr. Rotulagem pode ser realizada a qualquer momento entre 12-24 hr pós-infecção, mas não deve ser superior a 6 horas de duração. Este intervalo foi determinado para maximizar a sobreposição com a tradução de proteínas virais estruturais, enquanto assegurando a infecciosidade não é significativamente diminuída. 7 </li><li> Cuidadosamente remover o meio de rotulagem de modo a não perturbar as células. Adicionar 10 ml de meio de crescimento fresco HEK 293 células para cada prato e incubar as células a 37 ° C durante outra hora 18. Para minimizar a perda de células infectadas durante este passo, não é necessário para remover a solução de rotulagem inteiramente. O HEK 293 meio de crescimento de células contém um excesso de Met qual irá outcompete qualquer Aha residual. </li><li> Prossiga para a etapa 3 para a purificação. </li></ol> 2. Produção de Adenovirus azido-açúcar-Rotulado <ol><li> Seguir o procedimento intitulado Produção de Adenovírus Aha-Labeled até e incluindo passo 1,5. </li><li> Preparar 100 ml de azido-açúcar meio de rotulagem. </li><li> Cobrir as células com 10 ml de meio fresco rotulagem azido-açúcar e incubar a 37 ° C durante 44 hr. </li></ol> 3. Purificação de azida identificadas partículas adenovirais <ol><li> Remover os meios de comunicação, juntamente com as células infectadas de cada prato de cultura e transferência para tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de TD (usando 8 ml de tampão de TD por 10 pratos). </li><li> Lisar as células infectadas por repetidas (3 ou mais) ciclos de congelamento-descongelamento utilizando um frasco Dewar de azoto líquido e um banho de água a 37 ° C. Centrifugar a 2.000 g durante 10 mina 4 ° C para separar detritos de células a partir do sobrenadante. </li><li> Prepara-se uma densidade de CsCl tubo de centrífuga de gradiente por pipetagem primeira 2,5 ml de solução 1,25 g / ml de CsCl em um tubo de centrífuga Ultra Clear. Em seguida, utilizar uma pipeta com a sua ponta posicionada no fundo do tubo para adicionar lentamente 2,0 ml de 1,4 g / ml de solução de CsCl, tomando cuidado para não perturbar a interface do gradiente. </li><li> Pipetar o sobrenadante do passo 3,2 na parte superior do tubo de gradiente de densidade de CsCl, e se necessário adicionar tampão de TD para encher o tubo. Centrifugar as amostras num rotor balde oscilante em 125.000 g durante 1 hora a 15 ° C em uma ultracentrífuga. </li><li> Após a conclusão da ultracentrifugação, as partículas de vírus deve ser visível como uma banda espessa branca na interface das duas soluções de CsCl. Fazer uma pequena perfuração no fundo do tubo com uma agulha estéril para permitir que a solução escorra gota a gota. </li><li> Coletar a banda espessa e branca, que deve conter os rotulados Ad5 partículas, tomandocuidado para excluir g solução de CsCl em excesso. Evitar recolha proteínas celulares que irá banda acima da camada de vírus. Além disso excluir cápsides de viriões vazios, que formam uma camada mais leve ligeiramente acima da banda de vírus branco espesso. </li><li> Opcionalmente, executar uma purificação final sobre as rotulados Ad5 partículas. Adicionar a fracção recolhida a partir do passo 3,6 para um tubo de ultracentrifuga 4-ml e encher o tubo com 1,35 g / ml de solução de CsCl. Centrifugar a 125.000 g durante 18 hr a 15 ° C, e recolher o banda espessa branca que forma no meio do tubo, tal como descrito nos passos 3.5 e 3.6. (Note-se que se o título virai é baixo, uma faixa branca pode não ser visível após a segunda centrifugação, e não será possível recuperar o vírus rotulada). </li><li> Para o armazenamento das partículas de vírus durante longos períodos de tempo, a diálise do extracto vírus colhido deve ser realizada contra tampão de armazenamento de vírus. Armazenar as amostras de vírus dialisados ​​a -80 ° C. </li></ol> 4. Ligação de partículas adenovirais modificados com Sondas alcino utilizando a estirpe-Promovido cicloadição Azida-alcino (SPAAC) <ol><li> A uma solução de 50 ul de azida de Ad5-modificado em tampão de armazenamento de vírus, adicionar 0,25 ul de solução SPAAC rotulagem. (Consulte a tabela de reagentes para uma lista de vendedores de produtos comercialmente disponíveis alcinos tensas). </li><li> Permitir que a reacção de cicloadição estirpe promovidos-prosseguir durante a noite à temperatura ambiente. Se uma sonda sensível à luz (por exemplo, TAMRA) é usado, cobrir o vaso de reacção com folha de alumínio. </li><li> Purificar o vírus rotulada de acordo com a etapa 6. </li></ol> 5. A ligadura de Modificados Partículas adenovirais com Probes alcino usando cobre (I)-Catalisado cicloadição Azida-alcino (CuAAC) em atmosfera desoxigenado <ol><li> Mg lugar 7,2 de cobre (I), brometo de pó (CuBr) em um tubo de Eppendorf, coberto com folha de alumínio. </li><li> Pipeta de 1 ml de DMSO num tubo de Eppendorf segundo. </li><li> Preparar50 uL de solução de rotulagem CuAAC num tubo de Eppendorf terceiro. Cubra com papel alumínio se a sonda alcino é sensível à luz (por exemplo TAMRA-alcino). </li><li> Colocar os três tubos de Eppendorf, não nivelado, num saco de luva desoxigenada durante 6 horas. Todas as amostras devem permanecer no interior do saco de luvas até à conclusão da reacção CuAAC. </li><li> Preparar uma solução-mãe 50 × de CuBr por adição de 1 ml de DMSO a 7,2 mg de CuBr em pó, ambos os quais têm sido desoxigenada acordo com o passo 5.4. </li><li> Iniciar a reacção CuAAC pipetando 1 uL desta solução de reserva de CuBr a 50 uL da solução de rotulagem CuAAC, que foi desoxigenada acordo com o passo 5.4. Permitir que a reacção prosseguir durante 12 hr no interior do saco de luvas. </li><li> Purificar o vírus rotulada de acordo com a etapa 6. </li></ol> 6. Purificação e Armazenamento de partículas virais identificadas <ol><li> Purifique as amostras de vírus rotulados com Centri-Sep filtração em gel centrifugação columns equilibrada com tampão de armazenamento de vírus, seguindo as orientações do fabricante. </li><li> Alternativamente, a purificação pode ser realizada por diálise contra tampão de armazenamento de vírus. </li><li> As partículas de vírus com a etiqueta deve ser armazenada a -80 ° C. </li></ol> 7. SDS-PAGE de Adenovirus rotulada e Leitura Gel Fluorescente <ol><li> Adicionar 20 ul de tampão de amostra Laemmli (2 ×) a 20 ul de vírus purificado rotulados e ferver durante 10 min. Centrifugar as amostras durante 30 segundos para remover qualquer precipitados insolúveis. Se o cobre residual está presente após purificação, fervendo a amostra pode resultar em estrias de espessura de proteína sobre o gel de SDS-PAGE, causando dificuldades durante a visualização. Neste caso, renunciar de ebulição da amostra nesta etapa. </li><li> Anexar a cassete de gel de electroforese para a célula e adicionar tampão de corrida. Carregar o número necessário de poços com as amostras de proteína virais. Use um bem para carregar pré-stained moleculares marcadores de peso. Executar o gel durante 1 hora a 200 V. Manter a célula electroforese coberto com folha de alumínio durante todo o período de reduzir fotobranqueamento do rótulo fluoróforo. </li><li> Para uma melhor resolução e para remover todos fluoróforo livre, permitem que o corante de rastreamento para correr para fora do gel durante a eletroforese. Parar a electroforese e transferir rapidamente o gel para um digitalizador de gel fluorescente e digitalizar o gel para a emissão de fluorescência no comprimento de onda apropriado (574 nm para TAMRA). </li><li> O número de moléculas de corante conjugados a cada partícula viral pode ser quantificada através da medição da fluorescência de várias concentrações de Tamra padrão e comparando com a amostra a partir do passo 7.3. </li></ol> 8. Os resultados representativos Os resultados observados de SDS-PAGE e digitalização gel fluorescente de TAMRA conjugados Ad5 são mostrados na Figura 3. Embora estas verificações de gel fluorescentes foram realizados em amostras modicadas através CuAAC, os resultados devem ser comparáveis ​​quando as sondas são ligados via SPAAC. Esses exames gel indicam que os resultados de rotulagem AHA em modificação das três proteínas do capsídeo (Ad5 hexon, Penton, e Fibra), enquanto rotulagem açúcar modifica apenas a proteína da cápside Fibra. Além disso, um aumento da concentração do Aha (4 mM vs 32 mM) resulta em um maior grau de incorporação Aha, mas também tem sido mostrado para diminuir a infectividade. Resultados anteriores indicam que 7 para Ad5 produzido em 4 mM Aha, cerca de 5% de expostos sítios de metionina são TAMRA-modificado, com este número aumentando para 10% quando 32 mM Aha é usado. Isto corresponde a cerca de 280 e 510, respectivamente, de corantes-rotulados sítios por Ad5 partícula. Análise de açúcar rotulagem-1 indicou que cerca de 22 dos 36 locais de glicosilação em Ad5 são ocupados por um açúcar azido e, subsequentemente, rotulado com TAMRA. Se dez placas de cultura de tecidos são usados ​​para produzir a azida modificado Ad5, tal como descrito<html> neste protocolo, 200 - 300 ul de azida modificado vírus deve ser obtido a partir da faixa branca recolhidos no passo 3.6, com um título de aproximadamente 1,5 x 10 12 partículas / ml. Uma dificuldade comum deste procedimento é a ausência de uma banda viral neste passo de purificação, o que pode ser atribuída a título virai baixa. Este é geralmente o resultado de infectar células que estão acima ou sub-confluentes, ou por lavagem para retirar células - que tornam-se soltou da placa após a infecção - enquanto enxaguar durante a etapa 1. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Protocolo panorâmica. Azida contendo Aha ou GalNAz é primeiro incorporado em partículas de adenovírus. Ligadura com uma sonda fluorescente alcino é então realizada através de &quot;click&quot; química. Finalmente, a SDS-PAGE é usado para demonstrar a ligadura da sonda fluorescente. igura 2 &quot;/&gt; Figura 2. A ligadura de sonda alcino para azida-vírus modificado através de (a) SPAAC, (b) sob CuAAC de-oxigenado e (c) atmosfera oxigenado. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Scans fluorescentes de SDS-PAGE de azida marcado com adenovírus tipo 5 (Ad5) após conjugação com CuAAC TAMRA-alcino. (A) Aha-rotulado Ad5, utilizando duas concentrações de Aha. Rotulagem parece ocorrer em hexon adenovírus, Penton e proteínas da cápside de fibra, com a extensão da rotulagem aumentando com a concentração Aha aumentada. (B) Ac adenovírus 4 GalNAz-rotulado parece ser rotulados apenas sobre a proteína da cápside de fibra. <table border="1"><tbody><tr><td> Solução </td><td> Preparação </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Ad5 tampão de armazenamento </td><td> 5 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 0,5 mM de MgCl2, 50 mM de NaCl, 25% (v / v) de glicerol, e 0,05% (w / v) albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ad5 tampão infecção </td><td> 2% (v / v) de soro de vitelo bovino, 1 × solução de TC, Ad5 em tampão de armazenamento (volume determinado utilizando uma MOI de 10 PFU / célula e um índice de infecciosidade de 1:20). Levar a solução ao volume final usando TD tampão </td><td> Ad5 concentração pode ser determinada por meio de absorção de UV. </td></tr><tr><td> TC solução (200 ×) </td><td> 136 mM de CaCl2, 100 mM de MgCl2 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TD tampão </td><td> 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,07 mM de Na 2 HPO 4, e 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293 meio de crescimento de células </td><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro de vitelo bovino (BCS) e 1% (v / v) Pen Strep </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Solução estoque Cys (100 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 200 mM de L-cisteína </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Aha solução estoque (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 100 mM de L-Azidohomoalanine </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Aha rotulagem médio </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 10% de BCS, Aha solução stock (1 ×), 2 mM de L-cisteína </td><td> Preparar uma solução fresca antes do uso. Isto corresponde a uma 4 mM cONCENTRAÇÃO de Aha, embora diferentes concentrações podem ser utilizados (ver resultados representativos). </td></tr><tr><td> Met solução estoque (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 100 mM de L-Metionina </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Met meio controle </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 10% de BCS, Met solução stock (1 ×), 2 mM de L-cisteína </td><td> Preparar uma solução fresca antes do uso. </td></tr><tr><td> Ac 4 A solução estoque GalNAz (1.000 ×) </td><td> 50 mM peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) em metanol </td><td> Armazenar a 4 ° C. Ac 4 GalNAz é um precursor metabólico para GlcNAz. </td></tr><tr><td> Azido-açúcar de médio rotulagem </td><td> 100 ul de solução stock Ac 4 GalNAz, 100 ml de HEK 293 meio de crescimento de células </td><td> Permitir que a evaporar-se metanol antes da adição de HEK 293 meio de crescimento celular. </td></tr><tr><td> Soluções de cloreto de césio </td><td> CsCl dissolvido em tampão de TD: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml de H2O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml de H2O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml de H2O) </td><td> Gradientes de densidade de ultracentrifugação </td></tr><tr><td> Tampão de armazenamento vírus </td><td> Salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, contendo 0,5 mM de CaCl2, 0,9 mM de MgCl2, e 10% (v / v) de glicerol </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN solução rotulagem (SPAAC) </td><td> TAMRA-BCN em DMSO: <ol><li> Use UV absorbance (OD Ensaio 260) para determinar o título de vírus da solução no passo 4,1 </li><li> Determinar o número total de partículas virais na alíquota 50 ul (N Ad5) </li><li> A molaridade TAMRA-BCN (em M) é determinada utilizando: c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) N = 6,022 Avo × 10 23 (De modo que a mistura de reacção preparada no Passo 4 contém 100 sondas alcino por virião) </li></ol></td><td> Strain-promovido sonda alcino Para SDS-PAGE, uma título virai de aproximadamente 10 12 partículas / ml é sugerido </td></tr><tr><td> TAMRA-alcino solução rotulagem (CuAAC) </td><td> 50 ul de azida de Ad5-modificado em tampão de armazenamento de vírus (N Ad5 determinada como acima), 1,5 mM Batho<html> fenantrolina dissulfonato (isto é, 1,5 × concentração CuBr final), TAMRA-alcino. TAMRA-alcino molaridade (em M) é determinada utilizando: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (De modo que a mistura de reacção preparada no Passo 5 contém 100 sondas alcino por virião) </td><td> Tampão Tris é conhecido por ser um ligando competitivo e inibidora de cobre. 8 </td></tr><tr><td> Tampão de amostra Laemmli (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) de SDS, 20% de glicerol (v / v), 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, e 0,004% (w / v) de azul de bromofenol </td><td></td></tr><tr><td> O tampão de corrida </td><td> 187 mM de glicina, 19 mM de Tris-HCl, 3,5 mM de SDS em H2O </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tabela 1. Preparação dos tampões e soluções exigidas por este protocolo.

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	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. 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Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O desenvolvimento de reacções clique quimiosselectivas e bioorthogonal, incluindo os de azidas, é uma área em rápida evolução da investigação e, subsequentemente, há um número crescente de estas reacções a escolher para aplicações bioconjugação. Temos restringiu o âmbito deste protocolo para incluir apenas dois métodos, que foram escolhidos por causa de sua utilidade em nosso laboratório próprio e disponibilidade comercial de todos os reagentes. Na primeira via, tais - e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Adenovírus tipo 5 (Ad5) contendo um transgene GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Rim de embrião humano (HEK 293) células </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), glucose elevada </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Modificação de Dulbecco Eagle Médium, não Metionina, não Cisteína (DMEM-Met /-Cys), glucose elevada </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Soro de vitelo </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicilina - estreptomicina 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% de tripsina-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 milímetros prato de cultura de células, cultura de tecidos de poliestireno tratada </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> De cultura de células incubadora de CO 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biossegurança gabinete </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estéril filtro de seringa (0,2 um, acetato de celulose) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti centrífuga JE </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Tubos cónicos (50 ml, esterilizada) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga equipado com um 41 SW e SW 60 rOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf biopur Safe-Lock tubos, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrífuga 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep rotação gel colunas de filtração </td><td> Separações Princeton </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Agulha estéril, calibre 18 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saco de nitrogênio luva (se CuAAC desoxigenada deve ser realizado) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Frasco de Dewar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nitrogênio líquido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Célula de eletroforese </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Scanner de gel fluorescente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pronto Gel de Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (At 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Batofenantrolina dissulfónico (BDA) sal dissódico </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base Tris (tris (hidroximetil) aminometano) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato dissódico (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> HCl 1M </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecilsulfato de sódio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De cloreto de césio (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Brometo de cobre (I) (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (MgCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alcino sonda para * CuAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA alcino </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Sonda alcino tensa para * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO alcino </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Os vendedores notáveis ​​de reagentes e kits de química clique incluem Invitrogen, Jena Biociências, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, clique em Ferramentas Química e Baseclick. Uma variedade de corantes alcino e ligandos de segmentação podem ser encontrados em catálogos estes fornecedores.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

A modificação de partículas de vírus tenha recebido uma quantidade significativa de atenção para a sua enorme potencial para influenciar a terapia génica, as aplicações oncolíticos e desenvolvimento de vacinas. 1,2,3 As abordagens actuais para modificar superfícies virais, que são na sua maioria genética-based, geralmente sofrem de atenuação transdução de produção de vírus infeccioso, e celular. 4,5 Usando química clique quimiosselectiva, desenvolvemos uma abordagem alternativa simples que evita esses problemas, mantendo ao mesmo tempo altamente flexível e acessível. 1,2 O objectivo deste protocolo é demonstrar a eficácia da utilização de química do clique bioorthogonal para modificar a superfície do adenovírus tipo 5 partículas. Este processo de dois passos pode ser utilizado tanto terapeuticamente 1 ou analiticamente, 2,6, pois permite a ligadura quimiosselectiva de moléculas alvo, corantes ou outras moléculas de interesse para as proteínaspré-marcados com marcas de azida. As três principais vantagens deste método são que (1) marcação metabólica demonstra pouco ou nenhum impacto sobre a aptidão viral, 1,7 (2) uma vasta gama de ligandos efectoras podem ser utilizados, e (3) é extremamente rápido, fiável e de fácil acesso. 1,2,7 No primeiro passo deste procedimento, as partículas de adenovírus são produzidos tendo quer azidohomoalanine (Aha, um substituto de metionina) ou o açúcar não natural O-ligada N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos dos quais contêm a azida (-N 3) funcional grupo. Após a purificação das partículas de azida-vírus modificado, uma sonda contendo a porção alcino TAMRA fluorescente é ligada de uma maneira quimiosselectiva para as proteínas pré-marcados ou glicoproteínas. Finalmente, uma análise de SDS-PAGE é realizada para demonstrar a ligadura bem sucedida da sonda para as proteínas da cápside viral. Incorporação Aha é mostrado a rotular todos capsídeo viralproteínas (hexon, Penton e fibra), enquanto os resultados O-GlcNAz incorporação na rotulagem de fibra única. Neste campo em evolução, vários métodos para azida-alcino ligadura foram desenvolvidos com sucesso, no entanto apenas os dois que temos encontrado para ser mais conveniente são demonstrados aqui - estirpe promovido cicloadição azida-alcino (SPAAC) e cobre-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC) sob atmosfera desoxigenado.

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Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar azido<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. O grupo azida de cada um é quimiosselectivamente ligado via &quot;clique&quot; reações químicas, como forma de modificação da superfície viral.

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K visualizações.  Stony Brook University. Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar azido O-GlcNAz. O grupo azida de cada um é quimiosselectivamente ligado via "clique" reações químicas, como forma de modificação da superfície viral.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...