Agradecemos RB Tesh para fornecer o mouse policlonal anti-RVFV soro e M. Griffin da UTMB Citometria de Fluxo Núcleo Facilidade para obter ajuda com citometria de fluxo. Este trabalho foi apoiado por cinco U54 AI057156 através do Centro Regional de Excelência Ocidental, NIH concessão R01 AI08764301 e financiamento do Centro de Sealy de Desenvolvimento de Vacinas no UTMB.BK foi apoiado pelo Fundo de W. James McLaughlin Fellowship em UTMB.OL foi apoiado por R. Hilleman Early-Stage Investigator Award Carreira Maurice.

Análise da transcrição por microscopia de fluorescência 1. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE <ol><li> Coloque lamínulas redondas de 12 mm na placa de cultura de tecidos de 12 poços, uma lamela por poço. </li></ol> Nota: Se as células têm dificuldade em aderir a lamelas, casaco com poli-L-lisina (≥ 70.000 MW), antes de colocar em poços. Para este objectivo, lamelas submersas numa solução estéril de 0,1 mg / mL em H2O de poli-L-lisina, durante 5 min. Enxágüe com lamelas estéril H 2 O e ar seco por pelo menos 2 horas. <ol start="2"><li> Para semear as células 293 em lamelas, adicionar 4 de 5 x 10 células em 1 ml de meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina) por poço. Incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 S / N. </li><li> Infectar as células com MP-12 a uma multiplicidade de infecção (moi) de 3. Inclua pelo menos duas<html> poços não infectados: um dos dois poços servirá como controlo não infectado, o outro será tratado com actinomicina D (ActD) no passo 1.5 como um controlo para a supressão transcricional. Remova o meio de crescimento e diluir o estoque de vírus de modo a que o volume total adicionado a cada poço é de 200 ml. Incubar durante 1 hora numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> Nota: Em vez de infectar as células, as células podem também ser transfectadas com ADN de plasmídeo ou de ARN sintetizado in vitro que codifica uma proteína viral específica. Para este objectivo, transfectar células com um reagente apropriado de transfecção química de acordo com as instruções do fabricante e prosseguir para a etapa 1.5 em 16 horas após a transfecção. É aconselhável para otimizar as condições de transfecção e tempo de incubação antes de rotulagem RNA e fixação. <ol start="4"><li> Remover inoculo e adicionar 1 ml de meio de crescimento fresco por poço. Incubar a 37 ° C durante 15 horas. </li></ol>ove_content &quot;&gt; Nota:. Se adaptar este protocolo para utilização com um outro vírus, é aconselhável realizar uma experiência de evolução no tempo para determinar o ponto de tempo óptimo para a rotulagem de RNA e fixação Definir este curso de tempo, de modo que os tempos de infecção são escalonados e todos As amostras podem ser marcados, fixadas e coradas no mesmo tempo. <ol start="5"><li> Aos 15 horas pós-infecção (hpi), substitua meio de crescimento com meio contendo 1 mM UE. Para um dos poços infectadas falsas, também adicionam-se 5 ug / ml de ActD. Isto servirá como controle para a supressão da transcrição, como ActD inibe a síntese de ARN dependente de ADN. Retorno células na incubadora. </li><li> Aos 16 hpi, remover o meio e lava-se as lamelas uma vez com 1 ml de PBS (KCI 0,20 g / l, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl a 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / l, pH 7,4) por poço. Fixar as células por adição de 1 ml de 4% de paraformaldeído (PFA) por poço e incubando durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li></ol>Nota: Para preparar a solução de fixação PFA a 4%, dissolver 10 g de paraformaldeído em 150 ml de H2O aquecida a 60 ° C num agitador magnético aquecido. Adicionar 500 mL de NaOH 1M e continue a mexer até que a solução se torna claro. Filtrar a solução através de um filtro de PFA de papel para remover partículas e adicione 62,5 ml de tampão fosfato (77 mM de NaH 2 PO 4, 287 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,4). Adicionar H 2 O para um volume total de 250 ml. Congelar a -20 ° C em alíquotas de uso único. <ol start="7"><li> Lavar uma vez com 1 ml de PBS por poço. Sem o tempo de incubação é necessário para este e todos os passos de lavagem subsequentes. Proceder de imediato para o passo 2. </li></ol> Nota: É importante a proceder imediatamente à reacção clique, como o RNA degenera se manteve nesta fase, por períodos prolongados de tempo, uma perda do sinal de fluorescência do RNA já pode ser observado se as células são mantidas durante 1 hora a 4 ° C, . De igual modo, se porformando um experimento de evolução no tempo, não se esqueça de etiqueta, corrigir e mancha todas as amostras ao mesmo tempo. 2. Clique reação para detectar RNA Rotulado <ol><li> Permeabilizar células por adição de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS. Incubar durante 10 minutos à RT. </li></ol> Nota: Todas as soluções usadas nos passos 2.1 e 2.3 devem ser livre de nuclease. <ol start="2"><li> Lavar três vezes com 1 ml de PBS por poço. </li><li> Remover lamelas placa de 12 poços e para dentro da câmara de transferência de humidade. Cobrir cada lamela com 50 - solução de coloração clique 100 ul (100 mM Tris pH 8,5, CuSO4 1 mM, 20 mM de azida fluorescente [excitação / emissão máximo: 590/617 nm], ácido ascórbico a 100 mM) a cada. Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Para montar a câmara húmida, a linha inferior de uma cultura de células ou de uma placa de Petri com um diâmetro de 10 cm com uma película de plástico de parafina. Forrar o interior da borda da dish com toalhas de papel úmidas. Coloque as lamelas sobre a película de plástico de parafina. Nota: Tenha cuidado para não deixar que as lamelas secar durante este ou qualquer outro passo no protocolo. É melhor adicionar a solução de coloração para cada lamela directamente depois de ter sido colocado na câmara de humidade. Nota: Preparar a solução de coloração clique fresco imediatamente anterior a esta etapa. As soluções de reserva de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, e 500 mM de ácido ascórbico pode ser armazenado a 4 ° C. No entanto, descartar qualquer solução de ácido ascórbico, que tornou-se amarelo. Nota: Certifique-se de selecionar um fluoróforo que coincide com os filtros em seu microscópio fluorescente. <ol start="4"><li> Remover lamelas de câmara úmida e coloque em uma placa de 12 poços fresco e lavar três vezes com 1 ml de PBS por poço. </li></ol> Nota: Se nenhum deprotecção das proteínas virais é desejada, lamelas pode ser montado e fotografada após este passo (avançar para o passo 3.3.) 3. Imunofluorescência para detectar a expressão de proteínas virais <ol><li> Adicionar 1 ml de tampão de bloqueio (3% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS) a cada poço e incubar durante 30 min à RT, no escuro. </li><li> Remover lamelas placa de 12 poços, a transferência para a câmara húmida e cobrir com 50-100 jul de anticorpo primário (anti-RVFV, uma simpática oferta do Dr. RB Tesh, UTMB), diluídas em tampão (1:500) de bloqueio. Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Quando este protocolo de adaptação para o uso com um vírus diferente, determinar a diluição óptima para o seu primeiro anticorpo primário. Observação: Como alternativa, este passo pode ser realizado de O / N a 4 ° C no escuro. <ol start="3"><li> Remover lamelas de câmara úmida e coloque de volta na placa de 12 poços e lavartrês vezes com 1 ml de PBS por poço. </li><li> Remover lamelas de 12 poços lugar, o local em câmara húmida e cobrir com 50-100 uL de anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho conjugado com corante fluorescente [excitação / emissão máximo: 495/519 nm]) diluído em tampão de bloqueio (1: 500). Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Certifique-se de selecionar um anticorpo secundário que pode reconhecer o seu anticorpo primário e coincide com os filtros em seu microscópio fluorescente. Nota: Se for desejado, 200 ng / ml de DAPI podem ser adicionados à diluição do anticorpo secundário para visualizar núcleos. <ol start="5"><li> Remover lamelas da câmara húmida e local de volta para placa de 12 poços e lava-se três vezes com 1 ml de PBS por poço. </li><li> Monte lamelas, colocando uma gota (ca. 15 mL) de Fluoromount-G em uma lâmina de microscópio. Mergulhar o lamela em H2O, remover o excesso de H 2 O, tocando thlado e contra uma toalha de papel e coloque do lado do celular para dentro da gota de Fluoromount-G. Secar ao ar durante 5 min. </li></ol> Nota: Se a imagem em um microscópio invertido, permitir Fluoromount-G para solidificar a 4 ° CO / N ou apor as lamelas para a lâmina de microscópio, selando a borda com unha polonês transparente. Nota: As lâminas podem ser visualizados de imediato ou armazenados a 4 ° C no escuro até uma semana. 4. Aquisição de Dados <ol><li> Imagem usando um microscópio fluorescente. </li></ol> Nota: Certifique-se de selecionar fluorophores adequadas que podem ser visualizadas através de seu microscópio. Para referência, são os seguintes os fluoróforos e conjuntos de filtros usados ​​para adquirir as imagens apresentadas nesta publicação. DAPI: Filtro de excitação: BP 330-385 Dichromatic espelho: 400 DM Filtro de emissão: LP 420 Filtro de excitação: BP 460-490 Dichromatic espelho: 505 DM Filtro de emissão: LP 510 Fluoróforo com uma excitação / emissão máxima de 590/617: Filtro de excitação: BP 545-580 Dichromatic espelho: 600 DM Filtro de emissão: LP 610 Análise de citometria de fluxo por transcrição 5. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE <ol><li> Semente de células 293 em placas de cultura de tecidos de 6 poços em meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2, até que as células tenham atingido 80 - 100% de confluência. </li><li> Infectar as células com MP-12 a uma moi de 3. Incluir pelo menos dois dos poços não infectados: um dos dois poços servirão como controlo não infectado, o outro será tratado com ActD no passo5.4. Remova o meio de crescimento e diluir o estoque de vírus de modo a que o volume total adicionado a cada poço é de 400 uL. Incubar durante 1 hora numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Remover inoculo e adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco por poço. Incubar a 37 ° C durante 12 horas. </li></ol> Nota: Se a adaptação deste protocolo para utilização com um outro vírus, é aconselhável realizar uma experiência de evolução no tempo para determinar o ponto de tempo óptimo para a rotulagem e colheita. Estabelecer esta evolução no tempo de modo a que os tempos de infecção são escalonados e todas as amostras podem ser marcados, colhidas e coradas ao mesmo tempo. <ol start="4"><li> Aos 12 hpi, substitua meio de crescimento com meio contendo UE 0,5 mM. Para um dos poços infectadas falsas, também adicionam-se 5 ug / ml de ActD. Isto servirá como controle para a supressão da transcrição, como ActD inibe a síntese de ARN dependente de ADN. Retorno células na incubadora. </li><li> Aos 13 hpi, lave as células uma vez a sagacidadeh PBS e colheita das células por tripsinização. Lave as células colhidas três vezes com PBS contendo EDTA a 1 mM (PBS-EDTA). </li></ol> Nota: Durante este e os passos subsequentes, não centrifugar células mais rápido do que 500 - 1000 xg para evitar a ruptura da célula. Centrifugar células para 1 - 2 min de sedimentos. Nota: Se um immunostaining superfície está prevista após a reação click, colheita usando um policial de borracha ou raspador de células descartáveis ​​vez. <ol start="6"><li> Fixar as células por ressuspensão em 1 ml de 4% de PFA e incubar durante 30 min à TA. Consulte o passo 1.6 para obter instruções sobre como preparar PFA 4%. </li><li> Lavar uma vez com 1 ml de PBS-EDTA por cavidade. Prossiga imediatamente para a etapa 6. </li></ol> Nota: É importante a proceder imediatamente à reacção clique, como o RNA degenera se manteve nesta fase, por períodos prolongados de tempo. Do mesmo modo, se executar um tempo cexperiência ourse, não se esqueça de etiquetar, corrigir e mancha todas as amostras ao mesmo tempo. 6. Clique reação para detectar RNA Rotulado <ol><li> Permeabilizar células por ressuspensão em 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS. Incubar durante 10 minutos à RT. </li></ol> Nota: Todas as soluções usadas nos passos 6,1-6,3 necessidade de ser livre de nuclease. Nota: Se as células não sedimentos adequadamente durante esta etapa, aumenta o tempo de centrifugação de 5 min. Comportamento de sedimentação irá melhorar quando as células são suspensas em tampão FACS (passo 6.4). <ol start="2"><li> Lavar uma vez com 1 ml de PBS. </li></ol> Nota: Não use EDTA nesta etapa, pois isso quelar o Cu 2 + íons necessária para a reação clique. <ol start="3"><li> Ressuspender as células em 200 ul de solução de coloração clique (Tris 100 mM pH 8,5, CuSO4 1 mM, azida de 200nM marcado com corante fluorescente [excacreditação / emissão máximo: 650/665 nm], ácido ascórbico a 100 mM). Incubar durante 1 h à RT, no escuro. </li></ol> Nota: Preparar a solução de coloração clique fresco imediatamente anterior a esta etapa. As soluções de reserva de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO 4, e 500 mM de ácido ascórbico pode ser armazenado a 4 ° C. No entanto, descartar qualquer solução de ácido ascórbico, que tornou-se amarelo. Nota: Se as células se agregam durante esta etapa, ressuspender pipetando cima e para baixo várias vezes. Nota: Certifique-se de selecionar um fluoróforo que pode ser detectado pelo citômetro de fluxo. Nota: se preparar também uma amostra de células não infectadas que são submetidos ao processo de coloração clique, estes irão ser necessários para a calibração do citómetro de fluxo. Ou utilizar metade das células infectadas, ou incluir um poço adicional infectadas no passo 5.2. Estes controlo células serão imunocoradas no passo 7.1. <ol start="4"><li> Lavar duas vezes com tampão FACS (PBS contendo EDTA 1 mM e 0,5% (w / v) BSA). </li></ol> Nota: Se nenhum imunomarcação de proteínas virais é desejado, as células podem ser analisadas imediatamente (prosseguir para o passo 8). 7. Imunofluorescência para detectar a expressão de proteínas virais <ol><li> Ressuspender as células em 200 ul do anticorpo primário (anti-RVFV) diluído em tampão de SCAF (1:10.000) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li></ol> Observação: Como alternativa, este passo pode ser realizado de O / N a 4 ° C no escuro. Nota: se preparar também uma amostra de células não infectadas, que foram submetidas ao procedimento de coloração clique, mas não vai ser corada, estes irão ser necessários para a calibração do citómetro de fluxo. Ou utilizar metade das células infectadas por simulação ou incluir um poço adicional não infectadas empasso 5.2. Nota: Quando este protocolo de adaptação para o uso com um vírus diferente, determinar a diluição óptima para o seu primeiro anticorpo primário. <ol start="2"><li> Lave as células duas vezes em tampão de SCAF. </li><li> Ressuspender as células em 200 uL de anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho conjugado com corante fluorescente [excitação / emissão máximo: 495/519 nm]) diluído em tampão de SCAF (1:1.000) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as células uma vez em tampão de FACS. </li></ol> Nota: Neste ponto, as células podem ser armazenadas O / N a 4 ° C no escuro. 8. Aquisição de Dados <ol><li> Ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS, transferência para tubos de 5 ml e analisam poliestireno, utilizando um citómetro de fluxo. Utilize-12 MP células infectadas (nenhum clique reacção, só a coloração anti-RVFV) e células infectadas simuladas (click reacção apenas) para calibrar o instrumento. </li></ol> Nãoe: Não se esqueça de selecionar fluorophores adequadas que podem ser detectados por seu instrumento. Para referência, são as seguintes as linhas de laser e conjuntos de filtros utilizados para obter os dados mostrados nesta publicação. Com um fluoróforo de excitação / emissão de espectro de 495/519: Laser: 488 nm Filtro: 530/30 Com um fluoróforo de excitação / emissão de espectro de 650/665: Laser: 640 nm Filtro: 670/20

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	<li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus.">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li><li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies.">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(i)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+promotes+posttranslational+downregulation+of+the+TFIIH+subunit+p62.">NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li><li>Kalveram, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+NSs+inhibits+host+transcription+independently+of+the+degradation+of+dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR.</a> Virology. , (2012).</li><li>Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Rift+Valley+fever+virus+NSs+encoding+a+partial+truncation.">Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation.</a> PLoS One. 7, e45730 (2012).</li><li>Lihoradova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rift+Valley+Fever+Virus+MP-12+Strain+Encoding+NSs+of+Punta+Toro+Virus+or+Sandfly+Fever+Sicilian+Virus.">Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus.</a> PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).</li><li>Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toscana+Virus+NSs+Protein+Promotes+Degradation+of+Double-Stranded+RNA-Dependent+Protein+Kinase.">Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).</li><li>Le May, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TFIIH+transcription+factor,+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus.">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li><li>Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagen-directed+attenuation+of+Rift+Valley+fever+virus+as+a+method+for+vaccine+development.">Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development.</a> J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).</li><li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+infectious+Rift+Valley+fever+virus+entirely+from+cDNA,+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene,+and+expression+of+a+foreign+gene.">Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li><li>Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+RNA+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH).">Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. , e4002 (2012).</li><li>Reich, E., Goldberg, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+and+nucleic+acid+function.">Actinomycin and nucleic acid function.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).</li><li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies.">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo fornecido descreve um método para medir o efeito da infecção virai em transcrição da célula hospedeira através da incorporação do análogo de uridina UE em ARN nascentes. Este método possui várias vantagens sobre os métodos anteriores: é rápido, sensível e que não contam com a utilização de isótopos radioactivos. Além disso, o método pode ser adaptado para se obter dados qualitativos através de microscopia de fluorescência ou de dados quantitativos através de citometria de fluxo, util...

<html> Tradicionalmente, a actividade de transcrição foi medida através da incorporação de qualquer radioactivos (3 H-uridina) 1 ou halogenados (BRU) em dois nucleósidos de ARN nascentes. Estes análogos de uridina são absorvidos pelas células, convertida em uridina-trifosfato (UTP), através da via de recuperação de nucleósido, e subsequentemente incorporada no ARN recém-sintetizado. 3H-uridina pode ser detectada por auto-radiografia, o que pode ser demorado, ou cintilação de contagem, o que requer equipamento especializado. Além disso, a utilização de isótopos radioactivos podem não ser prático em um certo número de configurações de laboratório, incluindo os de alta laboratórios biossegurança contenção. BrU pode ser detectada através de coloração imunológica com anticorpos anti-Bru, que podem exigir a permeabilização duras para garantir o acesso do anticorpo ao núcleo parcial ou desnaturação do ARN, com a estrutura secundária do ARN pode ser um impedimento estereoquímico à ligação de anticorpos. _content &quot;&gt; O protocolo aqui descrito utiliza a recentemente desenvolvida clique química 3 para medir a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12. Instruções química baseia-se num cobre altamente selectivo e eficiente (I) catalisada por reacção de cicloadição entre um e alcino uma porção de azida de 4,5. Neste protocolo, o ARN nascentes em células infectadas é rotulado pela primeira vez através da incorporação de uridina analógico UE. Num segundo passo, o UE incorporado é detectado por meio de reacção com um azeto fluorescente. As principais vantagens deste método são (1) que não requerem a utilização de isótopos radioactivos e (2), que não requer a permeabilização dura ou desnaturação do ARN. Com um peso molecular de menos de 50 Da, o acesso da azida fluorescente não é impedida por insuficiente estrutura secundária permeabilização ou RNA. Além disso, os pesquisadores não estão limitadas na sua escolha de anticorpos primários ao combinar a detecção de ARN com uma classeimmunostaining iCal para proteínas virais. Dois métodos diferentes são descritas neste protocolo: uma para a visualização de transcrição através de microscopia de fluorescência (passos 1-4), e uma para quantificar a transcrição através de citometria de fluxo (passos 5-8). Ambos os métodos combinam rotulagem de ARN nascentes com uma imunocoloração intracelular para as proteínas virais, o que permite estabelecer uma correlação entre a actividade de transcrição e infecção viral numa base célula-por-célula. Os autores usaram com sucesso o protocolo aqui descrito para determinar a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12 6, as células infectadas com diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, e as células infectadas com o vírus da Toscana (TOSV) 10. O protocolo aqui descrito pode ser facilmente adaptado para ser utilizado com vírus diferentes e tem o potencial de ser modificado para incluir a coloração por imunofluorescência de proteínas virais ou celulares específicos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-uridine</td>
			<td>Berry &amp; Associates</td>
			<td>PY 7563</td>
			<td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-mm round coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D (ActD)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9415</td>
			<td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8027</td>
			<td>dissolve in H2O for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>dissolve in H2O for 5 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10270</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>dissolve in H2O for 500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper filter</td>
			<td>VWRbrand</td>
			<td>28333-087</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine (MW &ge; 70000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. Olympus IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

Muitos vírus RNA evoluíram a capacidade para inibir a transcrição da célula hospedeira como um meio para contornar as defesas celulares. Para o estudo destes vírus, é, por conseguinte, é importante ter uma forma rápida e fiável de medir a actividade de transcrição em células infectadas. Tradicionalmente, a transcrição foi medida quer por incorporação de nucleótidos radioactivos tais como 3 H-uridina seguido por detecção através de autoradiograf ia ou contagem de cintilações, ou incorporação de análogos de uridina derivados halogenados tais como 5-bromouridine (BRU), seguido por detecção por imunocoloração. O uso de isótopos radioactivos, no entanto, exige equipamento especializado e não é viável em um certo número de configurações de laboratório, ao passo que a detecção de BrU pode ser complicado e pode sofrer de uma baixa sensibilidade. A química clique recentemente desenvolvidos, o que envolve uma formação de triazole catalisada por cobre a partir de uma azida e um alcino, proporciona agora uma rápida e highly alternativa sensíveis a estes dois métodos. Instruções química é um processo de dois passos em que ARN nascentes é rotulado pela primeira vez por incorporação do análogo de uridina 5-etiniluridina (UE), seguido de detecção do rótulo com uma azida fluorescente. Estas azidas estão disponíveis como vários fluoróforos diferentes, permitindo uma grande variedade de opções para visualização. Este protocolo descreve um método para medir a supressão de transcrição em células infectadas com o vírus da febre de Rift Valley (RVFV) estirpe MP-12, utilizando química do clique. Ao mesmo tempo, a expressão de proteínas virais nestas células é determinada por imunocoloração intracelular clássica. Etapas de 1 a 4 detalhar um método para visualizar supressão transcricional via microscopia de fluorescência, enquanto os passos 5 a 8 pormenor um método para quantificar a supressão da transcrição via citometria de fluxo. Este protocolo é facilmente adaptável para utilização com outros vírus.

A protea de NSS RVFV (Bunyaviridae família, género Phlebovírus) 11 inibe a transcrição geral da célula hospedeira através de dois mecanismos distintos: (i) por sequestrar a subunidade p44 do factor de transcrição basal TFIIH 11 e (ii), promovendo a degradação da p62 proteossômica subunidade de TFIIH 6. O RVFV MP-12 estirpe 13 de vacina tem sido usada para os experimentos descritos neste protocolo, desde MP-12 estirpe pode ser tratado em nível de ...

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Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K visualizações.  University of Texas Medical Branch. Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

O efeito sinérgico da luz visível e no Gentamicina<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microorganismos

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...