Gostaríamos de reconhecer a NSF para financiamento (CBET-0846259).

Consulte a Tabela 1 para a preparação de todos os suportes, tampões e soluções referenciadas neste protocolo. 1. Produção de Aha-Rotulado Adenovírus <ol><li> Preparar onze 100-mm pratos de cultura de tecidos de células de rim embrionário humano (HEK 293) mantidas em meio de crescimento HEK 293 célula (ver Tabela 1) a 37 ° C até terem atingido os 80 - 90% de confluência. (Nota:. As culturas com mais de 90% de confluência pode ser difícil de infectar e podem não produzir vírus como desejado) </li><li> Soltar as células em um dos pratos removendo primeiro o meio de crescimento, enxaguamento uma vez com 5 ml de tampão de TD, em seguida, incubando as células durante um min em 1 ml de tripsina-EDTA (1 ×). </li><li> Adicionar 9 ml de meio de crescimento HEK 293 célula, e usar um hemocitómetro para contar o número de células HEK 293 colhida a partir de este prato. Use esse número para calcular a quantidade de adenovírus tipo 5 (Ad5) necessária para a infecção usando um multiplicity de infecção valor (MOI) de 10 PFU / célula. Conta para o facto de, para Ad5 normal, o índice de infecciosidade (razão de partículas infecciosas para o número total de partículas) é tipicamente de 1:20. </li><li> Preparar 10 ml de tampão de infecção. </li><li> Lentamente remover o HEK 293 meio de crescimento de células a partir dos dez pratos de cultura restantes, em seguida, lava-se com 5 ml de tampão de TD. Adicionar 1 ml de tampão de infecção para cada prato e incubar a 37 ° C durante 1 hora. Durante este período de infecção, agite cada lado prato de cultura para o lado de 15 min de intervalo. </li><li> Após a infecção, adicionar 9 ml de meio de crescimento fresco HEK 293 célula e incubar a 37 ° C durante 18 hr. </li><li> Preparar 100 ml de meio de rotulagem Aha (ou Met meio de controlo para o controlo). Certifique-se de filtrar as soluções de concentrados com um filtro de seringa de 0,2 mM estéril antes de preparar os meios de comunicação de rotulagem. </li><li> Cuidadosamente (de modo a não lavar as células infectadas) remover o HEK 293 meio de crescimento celular após 18 hr umnd lavar cada prato de cultura com 5 ml de tampão de TD. </li><li> Remover a solução de lavagem TD tampão e adicionar 10 ml de meio Aha rotulagem para cada prato de cultura. Para um controle, meio de controlo de metionina deve ser utilizado em vez do meio de rotulagem Aha nesta etapa. </li><li> Incubar as células infectadas em meio de rotulagem, a 37 ° C durante 6 hr. Rotulagem pode ser realizada a qualquer momento entre 12-24 hr pós-infecção, mas não deve ser superior a 6 horas de duração. Este intervalo foi determinado para maximizar a sobreposição com a tradução de proteínas virais estruturais, enquanto assegurando a infecciosidade não é significativamente diminuída. 7 </li><li> Cuidadosamente remover o meio de rotulagem de modo a não perturbar as células. Adicionar 10 ml de meio de crescimento fresco HEK 293 células para cada prato e incubar as células a 37 ° C durante outra hora 18. Para minimizar a perda de células infectadas durante este passo, não é necessário para remover a solução de rotulagem inteiramente. O HEK 293 meio de crescimento de células contém um excesso de Met qual irá outcompete qualquer Aha residual. </li><li> Prossiga para a etapa 3 para a purificação. </li></ol> 2. Produção de Adenovirus azido-açúcar-Rotulado <ol><li> Seguir o procedimento intitulado Produção de Adenovírus Aha-Labeled até e incluindo passo 1,5. </li><li> Preparar 100 ml de azido-açúcar meio de rotulagem. </li><li> Cobrir as células com 10 ml de meio fresco rotulagem azido-açúcar e incubar a 37 ° C durante 44 hr. </li></ol> 3. Purificação de azida identificadas partículas adenovirais <ol><li> Remover os meios de comunicação, juntamente com as células infectadas de cada prato de cultura e transferência para tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de TD (usando 8 ml de tampão de TD por 10 pratos). </li><li> Lisar as células infectadas por repetidas (3 ou mais) ciclos de congelamento-descongelamento utilizando um frasco Dewar de azoto líquido e um banho de água a 37 ° C. Centrifugar a 2.000 g durante 10 mina 4 ° C para separar detritos de células a partir do sobrenadante. </li><li> Prepara-se uma densidade de CsCl tubo de centrífuga de gradiente por pipetagem primeira 2,5 ml de solução 1,25 g / ml de CsCl em um tubo de centrífuga Ultra Clear. Em seguida, utilizar uma pipeta com a sua ponta posicionada no fundo do tubo para adicionar lentamente 2,0 ml de 1,4 g / ml de solução de CsCl, tomando cuidado para não perturbar a interface do gradiente. </li><li> Pipetar o sobrenadante do passo 3,2 na parte superior do tubo de gradiente de densidade de CsCl, e se necessário adicionar tampão de TD para encher o tubo. Centrifugar as amostras num rotor balde oscilante em 125.000 g durante 1 hora a 15 ° C em uma ultracentrífuga. </li><li> Após a conclusão da ultracentrifugação, as partículas de vírus deve ser visível como uma banda espessa branca na interface das duas soluções de CsCl. Fazer uma pequena perfuração no fundo do tubo com uma agulha estéril para permitir que a solução escorra gota a gota. </li><li> Coletar a banda espessa e branca, que deve conter os rotulados Ad5 partículas, tomandocuidado para excluir g solução de CsCl em excesso. Evitar recolha proteínas celulares que irá banda acima da camada de vírus. Além disso excluir cápsides de viriões vazios, que formam uma camada mais leve ligeiramente acima da banda de vírus branco espesso. </li><li> Opcionalmente, executar uma purificação final sobre as rotulados Ad5 partículas. Adicionar a fracção recolhida a partir do passo 3,6 para um tubo de ultracentrifuga 4-ml e encher o tubo com 1,35 g / ml de solução de CsCl. Centrifugar a 125.000 g durante 18 hr a 15 ° C, e recolher o banda espessa branca que forma no meio do tubo, tal como descrito nos passos 3.5 e 3.6. (Note-se que se o título virai é baixo, uma faixa branca pode não ser visível após a segunda centrifugação, e não será possível recuperar o vírus rotulada). </li><li> Para o armazenamento das partículas de vírus durante longos períodos de tempo, a diálise do extracto vírus colhido deve ser realizada contra tampão de armazenamento de vírus. Armazenar as amostras de vírus dialisados ​​a -80 ° C. </li></ol> 4. Ligação de partículas adenovirais modificados com Sondas alcino utilizando a estirpe-Promovido cicloadição Azida-alcino (SPAAC) <ol><li> A uma solução de 50 ul de azida de Ad5-modificado em tampão de armazenamento de vírus, adicionar 0,25 ul de solução SPAAC rotulagem. (Consulte a tabela de reagentes para uma lista de vendedores de produtos comercialmente disponíveis alcinos tensas). </li><li> Permitir que a reacção de cicloadição estirpe promovidos-prosseguir durante a noite à temperatura ambiente. Se uma sonda sensível à luz (por exemplo, TAMRA) é usado, cobrir o vaso de reacção com folha de alumínio. </li><li> Purificar o vírus rotulada de acordo com a etapa 6. </li></ol> 5. A ligadura de Modificados Partículas adenovirais com Probes alcino usando cobre (I)-Catalisado cicloadição Azida-alcino (CuAAC) em atmosfera desoxigenado <ol><li> Mg lugar 7,2 de cobre (I), brometo de pó (CuBr) em um tubo de Eppendorf, coberto com folha de alumínio. </li><li> Pipeta de 1 ml de DMSO num tubo de Eppendorf segundo. </li><li> Preparar50 uL de solução de rotulagem CuAAC num tubo de Eppendorf terceiro. Cubra com papel alumínio se a sonda alcino é sensível à luz (por exemplo TAMRA-alcino). </li><li> Colocar os três tubos de Eppendorf, não nivelado, num saco de luva desoxigenada durante 6 horas. Todas as amostras devem permanecer no interior do saco de luvas até à conclusão da reacção CuAAC. </li><li> Preparar uma solução-mãe 50 × de CuBr por adição de 1 ml de DMSO a 7,2 mg de CuBr em pó, ambos os quais têm sido desoxigenada acordo com o passo 5.4. </li><li> Iniciar a reacção CuAAC pipetando 1 uL desta solução de reserva de CuBr a 50 uL da solução de rotulagem CuAAC, que foi desoxigenada acordo com o passo 5.4. Permitir que a reacção prosseguir durante 12 hr no interior do saco de luvas. </li><li> Purificar o vírus rotulada de acordo com a etapa 6. </li></ol> 6. Purificação e Armazenamento de partículas virais identificadas <ol><li> Purifique as amostras de vírus rotulados com Centri-Sep filtração em gel centrifugação columns equilibrada com tampão de armazenamento de vírus, seguindo as orientações do fabricante. </li><li> Alternativamente, a purificação pode ser realizada por diálise contra tampão de armazenamento de vírus. </li><li> As partículas de vírus com a etiqueta deve ser armazenada a -80 ° C. </li></ol> 7. SDS-PAGE de Adenovirus rotulada e Leitura Gel Fluorescente <ol><li> Adicionar 20 ul de tampão de amostra Laemmli (2 ×) a 20 ul de vírus purificado rotulados e ferver durante 10 min. Centrifugar as amostras durante 30 segundos para remover qualquer precipitados insolúveis. Se o cobre residual está presente após purificação, fervendo a amostra pode resultar em estrias de espessura de proteína sobre o gel de SDS-PAGE, causando dificuldades durante a visualização. Neste caso, renunciar de ebulição da amostra nesta etapa. </li><li> Anexar a cassete de gel de electroforese para a célula e adicionar tampão de corrida. Carregar o número necessário de poços com as amostras de proteína virais. Use um bem para carregar pré-stained moleculares marcadores de peso. Executar o gel durante 1 hora a 200 V. Manter a célula electroforese coberto com folha de alumínio durante todo o período de reduzir fotobranqueamento do rótulo fluoróforo. </li><li> Para uma melhor resolução e para remover todos fluoróforo livre, permitem que o corante de rastreamento para correr para fora do gel durante a eletroforese. Parar a electroforese e transferir rapidamente o gel para um digitalizador de gel fluorescente e digitalizar o gel para a emissão de fluorescência no comprimento de onda apropriado (574 nm para TAMRA). </li><li> O número de moléculas de corante conjugados a cada partícula viral pode ser quantificada através da medição da fluorescência de várias concentrações de Tamra padrão e comparando com a amostra a partir do passo 7.3. </li></ol> 8. Os resultados representativos Os resultados observados de SDS-PAGE e digitalização gel fluorescente de TAMRA conjugados Ad5 são mostrados na Figura 3. Embora estas verificações de gel fluorescentes foram realizados em amostras modicadas através CuAAC, os resultados devem ser comparáveis ​​quando as sondas são ligados via SPAAC. Esses exames gel indicam que os resultados de rotulagem AHA em modificação das três proteínas do capsídeo (Ad5 hexon, Penton, e Fibra), enquanto rotulagem açúcar modifica apenas a proteína da cápside Fibra. Além disso, um aumento da concentração do Aha (4 mM vs 32 mM) resulta em um maior grau de incorporação Aha, mas também tem sido mostrado para diminuir a infectividade. Resultados anteriores indicam que 7 para Ad5 produzido em 4 mM Aha, cerca de 5% de expostos sítios de metionina são TAMRA-modificado, com este número aumentando para 10% quando 32 mM Aha é usado. Isto corresponde a cerca de 280 e 510, respectivamente, de corantes-rotulados sítios por Ad5 partícula. Análise de açúcar rotulagem-1 indicou que cerca de 22 dos 36 locais de glicosilação em Ad5 são ocupados por um açúcar azido e, subsequentemente, rotulado com TAMRA. Se dez placas de cultura de tecidos são usados ​​para produzir a azida modificado Ad5, tal como descrito<html> neste protocolo, 200 - 300 ul de azida modificado vírus deve ser obtido a partir da faixa branca recolhidos no passo 3.6, com um título de aproximadamente 1,5 x 10 12 partículas / ml. Uma dificuldade comum deste procedimento é a ausência de uma banda viral neste passo de purificação, o que pode ser atribuída a título virai baixa. Este é geralmente o resultado de infectar células que estão acima ou sub-confluentes, ou por lavagem para retirar células - que tornam-se soltou da placa após a infecção - enquanto enxaguar durante a etapa 1. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Protocolo panorâmica. Azida contendo Aha ou GalNAz é primeiro incorporado em partículas de adenovírus. Ligadura com uma sonda fluorescente alcino é então realizada através de &quot;click&quot; química. Finalmente, a SDS-PAGE é usado para demonstrar a ligadura da sonda fluorescente. igura 2 &quot;/&gt; Figura 2. A ligadura de sonda alcino para azida-vírus modificado através de (a) SPAAC, (b) sob CuAAC de-oxigenado e (c) atmosfera oxigenado. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Scans fluorescentes de SDS-PAGE de azida marcado com adenovírus tipo 5 (Ad5) após conjugação com CuAAC TAMRA-alcino. (A) Aha-rotulado Ad5, utilizando duas concentrações de Aha. Rotulagem parece ocorrer em hexon adenovírus, Penton e proteínas da cápside de fibra, com a extensão da rotulagem aumentando com a concentração Aha aumentada. (B) Ac adenovírus 4 GalNAz-rotulado parece ser rotulados apenas sobre a proteína da cápside de fibra. <table border="1"><tbody><tr><td> Solução </td><td> Preparação </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Ad5 tampão de armazenamento </td><td> 5 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 0,5 mM de MgCl2, 50 mM de NaCl, 25% (v / v) de glicerol, e 0,05% (w / v) albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ad5 tampão infecção </td><td> 2% (v / v) de soro de vitelo bovino, 1 × solução de TC, Ad5 em tampão de armazenamento (volume determinado utilizando uma MOI de 10 PFU / célula e um índice de infecciosidade de 1:20). Levar a solução ao volume final usando TD tampão </td><td> Ad5 concentração pode ser determinada por meio de absorção de UV. </td></tr><tr><td> TC solução (200 ×) </td><td> 136 mM de CaCl2, 100 mM de MgCl2 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TD tampão </td><td> 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,07 mM de Na 2 HPO 4, e 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293 meio de crescimento de células </td><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro de vitelo bovino (BCS) e 1% (v / v) Pen Strep </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Solução estoque Cys (100 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 200 mM de L-cisteína </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Aha solução estoque (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 100 mM de L-Azidohomoalanine </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Aha rotulagem médio </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 10% de BCS, Aha solução stock (1 ×), 2 mM de L-cisteína </td><td> Preparar uma solução fresca antes do uso. Isto corresponde a uma 4 mM cONCENTRAÇÃO de Aha, embora diferentes concentrações podem ser utilizados (ver resultados representativos). </td></tr><tr><td> Met solução estoque (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 100 mM de L-Metionina </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Met meio controle </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 10% de BCS, Met solução stock (1 ×), 2 mM de L-cisteína </td><td> Preparar uma solução fresca antes do uso. </td></tr><tr><td> Ac 4 A solução estoque GalNAz (1.000 ×) </td><td> 50 mM peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) em metanol </td><td> Armazenar a 4 ° C. Ac 4 GalNAz é um precursor metabólico para GlcNAz. </td></tr><tr><td> Azido-açúcar de médio rotulagem </td><td> 100 ul de solução stock Ac 4 GalNAz, 100 ml de HEK 293 meio de crescimento de células </td><td> Permitir que a evaporar-se metanol antes da adição de HEK 293 meio de crescimento celular. </td></tr><tr><td> Soluções de cloreto de césio </td><td> CsCl dissolvido em tampão de TD: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml de H2O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml de H2O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml de H2O) </td><td> Gradientes de densidade de ultracentrifugação </td></tr><tr><td> Tampão de armazenamento vírus </td><td> Salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, contendo 0,5 mM de CaCl2, 0,9 mM de MgCl2, e 10% (v / v) de glicerol </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN solução rotulagem (SPAAC) </td><td> TAMRA-BCN em DMSO: <ol><li> Use UV absorbance (OD Ensaio 260) para determinar o título de vírus da solução no passo 4,1 </li><li> Determinar o número total de partículas virais na alíquota 50 ul (N Ad5) </li><li> A molaridade TAMRA-BCN (em M) é determinada utilizando: c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) N = 6,022 Avo × 10 23 (De modo que a mistura de reacção preparada no Passo 4 contém 100 sondas alcino por virião) </li></ol></td><td> Strain-promovido sonda alcino Para SDS-PAGE, uma título virai de aproximadamente 10 12 partículas / ml é sugerido </td></tr><tr><td> TAMRA-alcino solução rotulagem (CuAAC) </td><td> 50 ul de azida de Ad5-modificado em tampão de armazenamento de vírus (N Ad5 determinada como acima), 1,5 mM Batho<html> fenantrolina dissulfonato (isto é, 1,5 × concentração CuBr final), TAMRA-alcino. TAMRA-alcino molaridade (em M) é determinada utilizando: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (De modo que a mistura de reacção preparada no Passo 5 contém 100 sondas alcino por virião) </td><td> Tampão Tris é conhecido por ser um ligando competitivo e inibidora de cobre. 8 </td></tr><tr><td> Tampão de amostra Laemmli (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) de SDS, 20% de glicerol (v / v), 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, e 0,004% (w / v) de azul de bromofenol </td><td></td></tr><tr><td> O tampão de corrida </td><td> 187 mM de glicina, 19 mM de Tris-HCl, 3,5 mM de SDS em H2O </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tabela 1. Preparação dos tampões e soluções exigidas por este protocolo.

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	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. 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Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O desenvolvimento de reacções clique quimiosselectivas e bioorthogonal, incluindo os de azidas, é uma área em rápida evolução da investigação e, subsequentemente, há um número crescente de estas reacções a escolher para aplicações bioconjugação. Temos restringiu o âmbito deste protocolo para incluir apenas dois métodos, que foram escolhidos por causa de sua utilidade em nosso laboratório próprio e disponibilidade comercial de todos os reagentes. Na primeira via, tais - e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Adenovírus tipo 5 (Ad5) contendo um transgene GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Rim de embrião humano (HEK 293) células </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), glucose elevada </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Modificação de Dulbecco Eagle Médium, não Metionina, não Cisteína (DMEM-Met /-Cys), glucose elevada </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Soro de vitelo </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicilina - estreptomicina 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% de tripsina-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 milímetros prato de cultura de células, cultura de tecidos de poliestireno tratada </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> De cultura de células incubadora de CO 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biossegurança gabinete </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estéril filtro de seringa (0,2 um, acetato de celulose) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti centrífuga JE </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Tubos cónicos (50 ml, esterilizada) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga equipado com um 41 SW e SW 60 rOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf biopur Safe-Lock tubos, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrífuga 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep rotação gel colunas de filtração </td><td> Separações Princeton </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Agulha estéril, calibre 18 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saco de nitrogênio luva (se CuAAC desoxigenada deve ser realizado) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Frasco de Dewar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nitrogênio líquido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Célula de eletroforese </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Scanner de gel fluorescente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pronto Gel de Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (At 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Batofenantrolina dissulfónico (BDA) sal dissódico </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base Tris (tris (hidroximetil) aminometano) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato dissódico (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> HCl 1M </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecilsulfato de sódio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De cloreto de césio (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Brometo de cobre (I) (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (MgCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alcino sonda para * CuAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA alcino </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Sonda alcino tensa para * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO alcino </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Os vendedores notáveis ​​de reagentes e kits de química clique incluem Invitrogen, Jena Biociências, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, clique em Ferramentas Química e Baseclick. Uma variedade de corantes alcino e ligandos de segmentação podem ser encontrados em catálogos estes fornecedores.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

A modificação de partículas de vírus tenha recebido uma quantidade significativa de atenção para a sua enorme potencial para influenciar a terapia génica, as aplicações oncolíticos e desenvolvimento de vacinas. 1,2,3 As abordagens actuais para modificar superfícies virais, que são na sua maioria genética-based, geralmente sofrem de atenuação transdução de produção de vírus infeccioso, e celular. 4,5 Usando química clique quimiosselectiva, desenvolvemos uma abordagem alternativa simples que evita esses problemas, mantendo ao mesmo tempo altamente flexível e acessível. 1,2 O objectivo deste protocolo é demonstrar a eficácia da utilização de química do clique bioorthogonal para modificar a superfície do adenovírus tipo 5 partículas. Este processo de dois passos pode ser utilizado tanto terapeuticamente 1 ou analiticamente, 2,6, pois permite a ligadura quimiosselectiva de moléculas alvo, corantes ou outras moléculas de interesse para as proteínaspré-marcados com marcas de azida. As três principais vantagens deste método são que (1) marcação metabólica demonstra pouco ou nenhum impacto sobre a aptidão viral, 1,7 (2) uma vasta gama de ligandos efectoras podem ser utilizados, e (3) é extremamente rápido, fiável e de fácil acesso. 1,2,7 No primeiro passo deste procedimento, as partículas de adenovírus são produzidos tendo quer azidohomoalanine (Aha, um substituto de metionina) ou o açúcar não natural O-ligada N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos dos quais contêm a azida (-N 3) funcional grupo. Após a purificação das partículas de azida-vírus modificado, uma sonda contendo a porção alcino TAMRA fluorescente é ligada de uma maneira quimiosselectiva para as proteínas pré-marcados ou glicoproteínas. Finalmente, uma análise de SDS-PAGE é realizada para demonstrar a ligadura bem sucedida da sonda para as proteínas da cápside viral. Incorporação Aha é mostrado a rotular todos capsídeo viralproteínas (hexon, Penton e fibra), enquanto os resultados O-GlcNAz incorporação na rotulagem de fibra única. Neste campo em evolução, vários métodos para azida-alcino ligadura foram desenvolvidos com sucesso, no entanto apenas os dois que temos encontrado para ser mais conveniente são demonstrados aqui - estirpe promovido cicloadição azida-alcino (SPAAC) e cobre-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC) sob atmosfera desoxigenado.

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Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar azido<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. O grupo azida de cada um é quimiosselectivamente ligado via &quot;clique&quot; reações químicas, como forma de modificação da superfície viral.

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K visualizações.  Stony Brook University. Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar azido O-GlcNAz. O grupo azida de cada um é quimiosselectivamente ligado via "clique" reações químicas, como forma de modificação da superfície viral.