Entender a eficácia das drogas em modelos animais é custo e trabalho intensivo. Nosso protocolo que utiliza um modelo ex vivo de ex-plantas de tecido é significativamente menor tanto em termos de custo quanto de pessoal científico necessário para conduzir o estudo. A principal vantagem dessa técnica é o uso de olhos suínos, que têm anatomia e fisiologia muito semelhantes aos olhos humanos em oposição a alguns outros pequenos modelos animais.
Quando testamos drogas in vitro, elas podem mostrar eficácia que pode estar ausente em modelos animais ou humanos. Sistemas de tecidos ex vivo são a melhor maneira de entender se nossos sistemas in vitro podem ou não ser traduzidos em testes em animais e humanos. O sistema de córnea suína, embora menos intensivo em mão-de-obra, requer habilidades capacitáveis para isolar, manter, infectar e tratar com as drogas, especialmente o processo de isolamento da córnea de todo o olho suíno é complicado de expressar em palavras, mas requer demonstração visual.
Ao receber olhos suínos de um fornecedor adequado, armazene os tecidos no gelo até o processamento e coloque os equipamentos de proteção pessoal adequados. Desinfete a área de trabalho com 70% de etanol e garanta uma cobertura de banco no espaço de trabalho. Quando a área de trabalho estiver pronta, coloque os olhos em um pedaço de gaze de 50 milímetros e use a gaze para agarrar a seção posterior com uma mão.
Usando uma agulha de calibre 30, faça cuidadosamente uma única punção no centro da superfície epitelial do olho, tomando cuidado para não danificar o estroma, e use uma lâmina esterilizada afiada para fazer uma pequena incisão na esclera a um milímetro de distância da córnea. Usando uma ação rotativa rápida e suave da mão e tomando cuidado para que o humor vítreo não vaze, corte a borda da córnea e segurando a córnea na borda da córnea-esclera com uma pinça plana, use a lâmina para cortar as membranas de amarração restantes. À medida que cada córnea é isolada, coloque os tecidos voltados para poços individuais de uma placa de 12 poços contendo dois mililitros de meio de córnea por poço e adicione cinco microliters de cinco vezes 10 à quinta unidade formadora de placas de 17 soluçãos de vírus GFP para o local desbridado em cada superfície córnea.
Quando todas as córneas tiverem sido coletadas, coloque a placa em 37 graus Celsius, incubadora de dióxido de carbono de 5% por 72 horas e pulverize quaisquer olhos adicionais não utilizados no experimento com alvejante 10% para seu descarte seguro em sacos de risco biológico. Todos os dias antes da adição de drogas, coloque a placa de córneas sob um microscópio estéreo e selecione o filtro GFP e um tempo de exposição de 500 microsegundos. Capture as imagens na menor ampliação antes de imaginar as córneas em uma série de ampliações crescentes até que toda a propagação viral e formação de dendrito possa ser visualizada claramente.
Quando todas as córneas tiverem sido imagens, devolva a placa à incubadora de cultura tecidual. Um dia antes da infecção, lave uma cultura celular vero confluente duas vezes com 10 mililitros de PBS por lavagem, e trate as células com um mililitro de 0,05% de trippsina por poço por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, use nove mililitros de meio inteiro para garantir que as células se desalojam completamente da superfície do frasco e transfiram a suspensão celular resultante para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Adicione 300 microliters de células a cada poço de um novo poço de seis poços, seguido pela adição de dois mililitros de médio a cada poço, em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular durante a noite. Na manhã seguinte, para coletar o vírus de cada córnea para quantificação, mergulhe pontas de cotonete estéreis em 500 microliters de meio sem soro por cotonete em vários tubos de microcentrifuuge em um armário de biossegurança por pelo menos cinco minutos. No final da incubação, coloque cuidadosamente as culturas de córnea suína infectada no armário.
Usando os cotonetes de algodão molhado, faça três revoluções no sentido horário e três revoluções no sentido anti-horário cinco milímetros do centro de cada córnea suína infectada sem aplicar pressão excessiva. No final da série de revoluções, gire cada cotonete em seu tubo de microcentrifuge médio sem soro no sentido horário e no sentido anti-horário cinco vezes antes de cortar os cotonetes para que as pontas se encaixem dentro de cada tubo com a tampa fechada. Quando todas as córneas foram limpas, vórtice os tubos em alta velocidade por um minuto.
Para quantificar a quantidade de vírus coletada de cada córnea, prepare uma diluição de 10 vezes do vírus em meio livre de soro em tubos de microcentrifuuge até que uma diluição de uma vez 10 para os oito negativos seja alcançada. Depois de aspirar o meio de crescimento de cada poço de células, transfira um mililitro de cada diluição do vírus a partir de uma vez 10 para os três negativos para as monocamadas celulares banhadas e coloque as células infectadas na incubadora de cultura celular por duas horas. No final da incubação, lave suavemente cada poço duas vezes com PBS antes de adicionar dois mililitros de meio carregado de metilcelulose para cada poço para uma incubação de 72 horas ou até que a formação de placas possa ser observada.
Após a observação da placa, adicione lentamente um mililitro de metanol ao canto de cada poço para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, aspira lentamente o conteúdo de cada poço sem perturbar a monocamada celular. Em seguida, rotule cada poço com um mililitro de solução de trabalho cristal violeta, tomando cuidado para que todas as células estejam cobertas para uma incubação de 30 minutos protegida da luz.
Ao final da incubação, descarte a solução e seque os poços em uma folha de papel absorvente, em seguida, conte o número de placas no poço de diluição mais alto para quantificar o conteúdo total do vírus na solução inicial três vezes. Como observado nesta análise de imagem de fluorescência estereoscópica, a eficácia antiviral do BX795 é semelhante à do TFT no controle da propagação viral, enquanto as córneas tratadas com veículo só demonstram a propagação do vírus da zona central de infecção para a periferia por seis dias após a inoculação viral inicial. Da mesma forma, os cotonetes oculares retirados nos dias dois e quatro pós-infecção apresentam uma inibição completa do vírus no controle positivo e amostras tratadas com BX795, enquanto um aumento acentuado no taças vírus infeccioso é observado nas amostras de controle negativo.
O isolamento da córnea suína de todo o olho suíno é o passo mais importante. As etapas 2.3 a 2.6 são as mais cruciais nesse processo. Nosso modelo pode ser usado para entender a propagação dendrítica do vírus em córneas suínas.
Este método também pode ser estendido para infecções bacterianas e fúngicas. Este método tem ajudado na visualização da propagação dendrítica do vírus em córneas fora de um modelo humano. Este modelo é útil para testar a eficácia das drogas antes de se mover para testes em animais e humanos.
