Name: ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1
Uploaded: 2015-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1 at JoVE.com

Agradecemos a Peter Staeheli para a prestação de ratos B6.A2G-MX1 e Semra Özcelik para assessoria técnica. Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa através SFB829 e KN536 / 16, eo Köln Fortune Programa / Faculdade de Medicina da Universidade de Colónia.

Declaração de ética. A preparação de folhas epidérmicas de animais sacrificados é realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz, Renânia do Norte-Vestfália (Alemanha). O estudo foi aprovado pelo LANUV NRW (Número 8.84-02.05.20.13.018). 1. Preparação de Instrumentos e Meios de Cultura <ol><li> Cultivar folhas epidérmicas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / elevado teor de glucose contendo dipéptido glutamina, FCS a 10%, 100 IU / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina (a seguir referido como &quot;DMEM&quot;). </li><li> Para a preparação de folhas epidérmicas, dissolver cuidadosamente dispase II em pó (5 mg / ml) em PBS aquecido (até 37 ° C). Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um e usá-lo directamente para tratamento. </li><li> Para a preparação de toda monta epidérmica 13, preparar o bloqueio lustreer com 0,5% de leite em pó, 0,25% de gelatina de pele de peixe de água fria e 0,5% de Triton X-100 em TBS. Permitir substâncias para dissolver por incubação da mistura durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente num misturador rotativo. Também preparar 0,2% de Tween 20 em PBS como tampão de lavagem. Para a fixação, preparar 3,4% e 4% de formaldeído em PBS. </li><li> Para a imunocoloração de criocortes, preparar tampão de bloqueio com 5% de soro normal de cabra e 0,2% de Tween 20 em PBS. Para a fixação, preparar 0,5% de formaldeído em PBS. </li></ol> 2. Preparação de lâminas de epiderme da pele Murino <ol><li> Preparação da epiderme da pele recém-nascido de volta para os estudos de infecção <ol><li> Coloque um rato decapitados (1 a 3 dias após o nascimento) num prato de dissecação e cortar as extremidades e a cauda perto do tronco para permitir a remoção eficiente da pele do tronco completa. Durante a remoção das extremidades, para tentar manter os cortes tão pequena quanto possível de diâmetro. </li><li> Corrigir o tronco curvado com uma pinça finand mover suavemente tesoura ponta romba debaixo da pele do crânio de caudal ao longo das costas de separar a pele do tronco. Slit a pele ao longo das costas. </li><li> Para a análise FACS, o isolamento dos queratinócitos ou preparação de RNA, retire a pele completa do tronco, utilizando uma pinça para fixar o tecido e as tesouras ponta romba para empurrar o torso. Para a preparação de criosecções ou peças inteiras levar apenas pedaços de pele para trás. </li><li> Pique a pele para trás com um bisturi em 1-2 pedaços de aproximadamente 10 x 10 mm. Coloque as peças em um poço de uma placa de 6 poços com ~ 1 ml de PBS estéril. Certifique-se de que o lado dérmico virado para o fundo. </li><li> Substituir 1,5 ml de PBS por dispase II (5 mg / ml PBS) e incubar durante 30 min quer a 37 ° C (para as peças inteiras) ou O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBS. Remova cuidadosamente a epiderme como uma folha intacta usando uma pinça para fixar a derme subjacente e os outros pinça para levantar a epiderme. Use um binóculo para dar este passo easy. Transferir a folha epidérmica em DMEM com o lado basal para o fundo. Use as folhas imediatamente para experimentos de infecção. NOTA: Utilize a preparação da epiderme da pele recém-nascido, principalmente para análise FACS, o isolamento dos queratinócitos ou preparação de RNA. Por causa da sua fragilidade, a preparação de folhas infectadas para criossecções ou peças inteiras é menos adequado. </li></ol></li><li> Preparação da epiderme de pele da cauda de adulto para estudos de infecção <ol><li> Eutanásia dos ratos com a idade de 1 a 3 meses, por deslocamento cervical. Tome cauda em vez de pele para trás uma vez que os folículos pilosos longo embutidos na parte traseira dificultar a separação de folhas epidérmicas intactas. Corte a cauda de camundongos sacrificados e cortou-o no sentido do comprimento com um bisturi. </li><li> Retire a pele do osso e pique-o com um bisturi em pedaços de cerca de 5 x 5 mm. Coloque até 4 peças em um bem e prosseguir com a incubação em dispase II como descrito em 2.1.5 NOTA: Use tai adultol pele para preparar criocortes ou peças inteiras. Como alternativa à utilização imediata, caudas pode ser armazenado ou transportado para, aproximadamente, 24 h a 4 ° C sem perda significativa de eficiência de infecção. Se caudas são mantidos até 48 horas, folhas epidérmicas poderia ser mal infectados com HSV-1. </li></ol></li><li> A dissociação da epiderme, para a análise por FACS Nota: A detecção da expressão da proteína de superfície por análise de FACS requer técnicas de dissociação de células adequadas que não prejudiquem a superfície da célula e a proteína de interesse. <ol><li> Incubar lâminas de epiderme recém-nascidos em uma placa de 6 poços, com o lado basal em 1,5 mL / poço recombinante solução de dissociação de células de tripsina à base durante 15 min à TA e durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Parar a incubação pela adição de 3 ml de DMEM. Dissociar queratinócitos utilizando uma pinça fina curvadas para mover suavemente a epiderme na placa de 6 poços de modo a que os queratinócitos se dissolvem. Recolha a suspensão de células e repetir este passo 3 vezessempre usando DMEM fresco. NOTA: Este procedimento de dissociação é adequado para detectar Nectin-1 na superfície de queratinócitos. </li><li> Alternativamente, as folhas epidérmicas incubar em solução de dissociação de células sem enzima (CDS) durante 15 min à temperatura ambiente e 15 min a 37 ° C. Incubar mais 15 minutos à temperatura ambiente para limpar suavemente os queratinócitos pipetando CDS cima e para baixo. </li><li> Recolha a suspensão de células e repita o passo de lavagem 3 vezes com DMEM fresco. NOTA: Esta dissociação é adequado para detectar a expressão de superfície de HVEM. A desvantagem da solução CDS é que menos células são dissociadas com uma solução de dissociação de células recombinante baseado em tripsina. Além disso a superfície de expressão, expressão citoplasmática ou nuclear, tais como expressão ICP0 podem ser analisados ​​por SCAF após a dissociação das folhas epidérmicas infectadas com o recombinante solução de dissociação de células de tripsina à base. </li></ol></li><li> A dissociação da epiderme para isolar queratinócitos ou exRNA trato <ol><li> Coloque folhas epidérmicas recém-nascidos em uma placa de 6 poços, com o lado basal para o fundo do prato que contém 1,5 ml / poço solução de dissociação de células recombinante baseado em tripsina. Incubar durante 30 min à TA. Adicionar 3 ml de DMEM e dissociar queratinócitos utilizando uma pinça fina curvadas para mover suavemente a epiderme do prato. </li><li> Recolha a suspensão de células e repetir este passo 3 vezes usando fresco DMEM. Utilizar esta suspensão de células para extrair ARN ou aos queratinócitos murinos cultura primária. </li></ol></li></ol> 3. A infecção das lâminas epidérmicas com HSV-1 <ol><li> Prepara-se uma solução de HSV-1 estirpe 17 11 em peso, em não menos de 500 ul de DMEM e substituir o meio por a solução de vírus em que as folhas epidérmicas são flutuante. Este ponto de tempo é definido como o tempo 0 12. Execute infecção de uma folha epidérmica em um poço de uma placa de 24 poços a 37 ° C. O cálculo do título do vírus é baseada no número estimadode células na camada basal da epiderme por folha (de aproximadamente 2 x 10 5 células por folha de 5 x 5 mm). </li><li> Infect com o HSV-1 em cerca de 100 unidades formadoras de placas (PFU) / célula e substituir o meio contendo vírus por DMEM a 1 hr pi NOTA: No caso de folhas epidérmicas de pele recém-nascido, tenha em mente que as folhas começam a dissociar durante a incubação. </li></ol> 4. Visualização de células infectadas <ol><li> Epidérmica Whole Mounts 13 <ol><li> Fix folhas epidérmicas com 3,4% de formaldeído, quer durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Lavar duas vezes com PBS e bloquear com 0,5% de leite em pó, 0,25% de gelatina de pele de peixe de água fria e 0,5% de Triton X-100 em TBS durante 1 hora à TA 14. </li><li> Incubar as folhas de O / N com murganho anti-ICP0 (anticorpo monoclonal 11060) 15 diluída 1:60 em tampão de bloqueio à temperatura ambiente. Para a visualização da rede intermédia de filamentos simultaneamente incubar com anticorpo policlonal de coelho anti-rato queratina 14 (100 ng / mL). </li><li> Lavar 4 a 5 vezes com PBS-Tween 20 a 0,2% durante 4 horas à temperatura ambiente. Incubar O / N com AF488-conjugado anti-IgG de ratinho (1 mg / ml), AF555-conjugado anti-IgG de coelho (1 ug / ml), e DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng / ml) em tampão de bloqueio à temperatura ambiente. </li><li> Lavar com PBS-0,2% de Tween 20, durante 4 h à TA. Folhas epidérmicas Monte com o seu lado basal em cima de uma lâmina de amostra, incorporar no meio de montagem fluorescente e cobrir com lamelas. </li></ol></li><li> Epidérmica Cortes congelados <ol><li> Folhas epidérmicas mediana foram fixadas em formaldeído a 4% em PBS durante 20 min à temperatura ambiente e lavou-se 2 vezes com PBS. Folhas fixas Incorporar em tecido de congelação médio e congelamento em nitrogênio líquido. Corte 8-10 mm seções com um cryomicrotome. </li><li> Fixar as secções mais uma vez com 0,5% de formaldeído em PBS durante 10 min à temperatura ambiente, lava-se 2 vezes com PBS, bloco com 5% de soro normal de cabra e 0,2% de Tween 20 em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, e em seguida corar durante 60 min com mouse anti-ICP0 (anticorpo monoclonal 11060) 15 diluída 1:60 em tampão de bloqueio, seguido por lavagem 3 vezes com tampão de bloqueio. </li><li> Em seguida incubar com anti-IgG de ratinho conjugado com AF488 (1 ug / ml) e DAPI (100 ng / ml) em tampão de bloqueio durante 45 minutos à temperatura ambiente e lava-se 3 vezes. Seções incorporar em meio de montagem fluorescente e cobrir com lamelas. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Koelle, D. M., Corey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex:+insights+on+pathogenesis+and+possible+vaccines.">Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines.</a> Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+Viruses.">Herpes simplex Viruses.</a> Fields Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Syrj&#228;nen, S., Mikola, H., Nyk&#228;nen, M., Hukkanen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+establishment+of+lytic+and+nonproductive+infection+by+herpes+simplex+virus+type+1+in+three-dimensional+keratinocyte+culture.">In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture.</a> J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).</li><li>Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+and+replication+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+an+organotypic+epithelial+culture+system.">Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system.</a> Virology. 230, 236-243 (1997).</li><li>Hukkanen, V., Mikola, H., Nyk&#228;nen, M., Syrj&#228;nen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+infection+has+two+separate+modes+of+spread+in+three-dimensional+keratinocyte+culture.">Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture.</a> J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).</li><li>Gescher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+viral+adsorption+and+penetration+by+an+aqueous+extract+from+Rhododendron+ferrugineum+L.+as+antiviral+principle+against+herpes+simplex+virus+type-1.">Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1.</a> Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).</li><li>Petermann, P., Haase, I., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Rac1+and+Cdc42+signaling+during+early+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+keratinocytes.">Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes.</a> J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).</li><li>Everett, R. D., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+IE+protein+Vmw110+causes+redistribution+of+PML.">HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML.</a> EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).</li><li>Chrostek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+is+crucial+for+hair+follicle+integrity+but+is+not+essential+for+maintenance+of+the+epidermis.">Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).</li><li>Petermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+mechanisms+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+into+murine+epidermis:+Involvement+of+nectin-1+and+HVEM+as+cellular+receptors.">Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors.</a> J. Virol. 89, 262-274 (2015).</li><li>McGeoch, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+DNA+sequence+of+the+long+unique+region+in+the+genome+of+herpes+simplex+virus+type+1.">The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1.</a> J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).</li><li>Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+exhibits+a+tropism+for+basal+entry+in+polarized+epithelial+cells.">Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells.</a> J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130, 5241-5255 (2003).</li><li>Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-M&#246;rsdorf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+pathways+of+herpes+simplex+virus+type+1+into+human+keratinocytes+are+dynamin-+and+cholesterol-dependent.">Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent.</a> PLoS One. 6, e25464 (2011).</li><li>Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+form+of+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+is+expressed+in+a+cell+type+dependent+manner.">A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner.</a> Virology. 197, 751-756 (1993).</li><li>Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+induces+a+unique+protein+in+mouse+cells+bearing+a+gene+for+resistance+to+influenza+virus.">Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).</li><li>Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cyclodextrins+for+manipulating+cellular+cholesterol+content.">Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content.</a> J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).</li><li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cholesterol+depletion+by+cyclodextrin+on+the+sphingolipid+microdomains+of+the+plasma+membrane.">Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane.</a> Biochem. J. 335, 433-440 (1998).</li><li>Yancey, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+cholesterol+efflux+mediated+by+cyclodextrins:+Demonstration+of+kinetic+pools+and+mechanism+of+efflux.">Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux.</a> J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).</li><li>Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus-1+entry+into+cells+mediated+by+a+novel+member+of+the+TNF/NGF+receptor+family.">Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family.</a> Cell. 87, 427-436 (1996).</li><li>Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+alphaherpesviruses+mediated+by+poliovirus+receptor-related+protein+1+and+poliovirus+receptor.">Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor.</a> Science. 280, 1618-1620 (1998).</li><li>Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+entry+receptors+for+herpes+simplex+virus+and+their+roles+in+disease.">Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease.</a> Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).</li><li>Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+adhesion+molecule+nectin-1+is+critical+for+normal+enamel+formation+in+mice.">The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).</li><li>Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+herpesvirus+entry+mediator+as+a+negative+regulator+of+T+cell-mediated+responses.">The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses.</a> J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Quando as folhas epidérmicas da pele de um adulto de ratinhos C57BL / 6 são infectadas com HSV-1 em cerca de 100 PFU / célula, observa-se infecção em quase todas as células da camada basal da epiderme interfoliculares enquanto que doses de vírus mais baixos correlacionam-se com as células menos infectados e um mais lento o progresso da infecção. Em geral, os folículos de cabelo mostram um número variável de células infectadas; enquanto a maioria dos queratinócitos bastante pequenas que revestem os folícu...

Herpes simplex vírus (HSV) pode causar uma série de doenças em humanos de lesões mucocutâneas sem complicações leves a infecções potencialmente fatais. HSV tipo 1 (HSV-1) é predominantemente associada com infecções orofacial e encefalites, enquanto o HSV tipo 2 (HSV-2), mais provavelmente provoca infecções genitais 1. Embora haja progressos significativos na compreensão de como HSV entra nas células em cultura, inicia a infecção e produz progênie viral, sabemos pouco sobre a via de invasão viral (s) no tecido no nível celular 2. Para os estudos de HSV pele ou infecções das mucosas, ratinhos, coelhos e porquinhos da índia foram utilizados como modelos animais. Infecção da pele foi estabelecida por injecção intradérmica ou por raspagem da pele, na presença de vírus, e o desenvolvimento da doença foi correlacionada com a produção de vírus. Estes métodos ajudou a compreender vários aspectos da patogénese da doença, e são usados ​​para avaliar as drogas antivirais. Para estudar a infecção por HSV na tissunível e, organotípicas modelos de pele humana foram aplicados. À medida que a taxa de infecção é restrita nestas culturas jangadas, apenas um número limitado de estudos que investigam a infecção, propagação virai e os efeitos dos componentes antivirais foram publicados 3-6. A fim de caracterizar determinantes celulares que desempenham um papel durante a infecção por HSV-1 no epitélio intacto, foi estabelecido um protocolo ex vivo para estudos de infecção de epiderme 7 de murídeo. A pele foi preparada a partir de recém-nascidos ou da cauda de camundongos adultos. Uma vez que o HSV-1 não pode infectar amostras de pele completos, que foram submersas em meio contendo vírus, que separada da epiderme da derme por tratamento com dispase II. Após flutuação das folhas epidérmicas em meio contendo vírus, as células infectadas podem ser visualizados na camada basal da epiderme vários momentos após a infecção em (PI) 7. Para visualizar a iniciação da infecção em células individuais antes da replicação de um vírusND produção de vírus, é corada com um anticorpo contra a proteína de célula infectada 0 (ICP0), que é uma das primeiras proteínas expressas durante a infecção por HSV-1. A localização celular de ICP0 passa por fases distintas durante a infecção inicial. Enquanto ICP0 está presente em focos nucleares durante a fase inicial da expressão de genes virais, relocalização de ICP0 para o citoplasma indica uma fase posterior da infecção 8. Utilizou-se o ensaio ex vivo infecção de folhas epidérmicas a partir de diferentes modelos de ratinho para testar o papel potencial de vários factores celulares durante a infecção. Para lidar com o impacto da Rac1 como um regulador chave da dinâmica de actina, que infectou os epiderme de camundongos portadores de deleção específicas de queratinócitos do gene rac1 9. Este modelo permitiu-nos estudar as consequências da deficiência Rac1 na eficiência de infecção por HSV-1 em camadas epidérmicas de queratinócitos. A comparação com epiderme infectadas da mesma ninhada de controle revealed nenhuma diferença significativa, indicando que a falta de Rac1 não teve nenhum efeito sobre o início da infecção na camada basal da epiderme 7. O uso de mais modelos de ratos nos permitiu abordar quais os receptores celulares mediar entrada para a epiderme. Infectar folhas epidérmicas a partir de qualquer Nectin-1- ou murganhos deficientes em HVEM com o HSV-1 revelou que a entrada viral inicial no tecido depende fortemente da presença de Nectin-1 10. Além disso, os nossos resultados demonstram que o HVEM pode também servir como receptor de epiderme em murinos, embora de forma menos eficiente do que Nectin-1 10. Para abordar a distribuição espacial de células infectadas nas camadas epidérmicas, que ICP0 visualizar a expressão em secções de tecido e as peças inteiras da epiderme (Figura 1). Em criocortes de pele completa, não há células que expressam ICP0 são detectados (Figura 1). Em contraste, criocortes de folhas epidérmicas demonstrar citoplasmáticaICP0 expressão na camada basal às 3 horas já pi (Figura 1). Em tempos mais recentes, a propagação viral camadas suprabasais pode ser visualizado. A distribuição espacial de células infectadas na camada basal pode ser facilmente seguido de pele epidérmicos em montagens inteiras (Figura 1). Após a infecção com HSV-1 a 100 UFP / célula, aproximadamente 50% dos queratinócitos basais interfoliculares na epiderme mostram expressão ICP0 em 1,5 h pi Neste ponto de tempo a maioria das células infectadas expressam ICP0 nuclear. A relocalização da ICP0 para o citoplasma, indicando uma fase posterior de expressão do gene precoce está presente em quase todas as células a 3 hr pi (Figura 1). Estes modos de visualizar as células infectadas ex vivo após a infecção por HSV-1 proporcionam um ensaio poderoso para estudar o efeito de inibidores ou de excluídos / componentes celulares mutadas para a entrada virai e disseminação no tecido.

<table><tbody><tr><td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966047</td><td>needed for cultivation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>dispase II powder</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>has to be solved in heated PBS</td></tr><tr><td>enzyme-free cell dissociation solution</td><td>Sigma</td><td>C5914</td><td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>TrypLE select cell dissociation solution</td><td>Life Technologies</td><td>12563-029</td><td>needed for dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>chelex 100 resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td></tr><tr><td>gelatin from cold water fish skin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td></tr><tr><td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-21429</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (conc.: 0.1 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>36670</td><td>used to counterstain the nucleus</td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

Para introduzir o seu hospedeiro humano, vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) tem de ultrapassar a barreira de superfícies mucosas, pele e córnea. HSV-1 alvos os queratinócitos durante a entrada inicial e estabelece uma infecção primária no epitélio, que é seguida por uma infecção latente de neurónios. Após a reativação, o vírus pode tornar-se evidente em locais mucocutâneas que aparecem como vesículas ou úlceras cutâneas mucosas. Como o HSV-1 invade pele ou mucosa e atinge os seus receptores é mal compreendida. Para investigar a via de invasão de HSV-1 no tecido epidérmico, ao nível celular, estabelecemos um modelo ex vivo de infecção epiderme murino, que representa o local da infecção primária e recorrente da pele. O ensaio inclui a preparação de pele de murino. A epiderme é separada da derme por tratamento com dispase II. Depois de as folhas epidérmicas flutuante em meio contendo vírus, o tecido é fixa e a infecção pode ser visualizado em vários momentos após a infecção pelacoloração de células infectadas com um anticorpo contra o HSV-1 de proteína precoce imediata ICP0. ICP0 células que expressam podem ser observados na camada basal dos queratinócitos já em 1,5 h após a infecção. Com vezes mais longo da infecção, as células infectadas são detectados nas camadas suprabasais, indicando que a infecção não se limita aos queratinócitos basais, mas o vírus propaga-se para outras camadas no tecido. Utilizando folhas epidérmicas de vários modelos de ratinho, o protocolo de infecção permite a determinação do envolvimento de componentes celulares que contribuem para o HSV-1 no tecido invasão. Além disso, o ensaio é adequado para testar inibidores em tecidos que interferem com os passos iniciais de entrada, disseminação célula-a-célula e produção de vírus. Aqui, descrevemos o protocolo ex vivo infecção em detalhes e apresentar os nossos resultados utilizando camundongos Nectin-1- ou HVEM deficiente.

O desafio do método é o de preparar as folhas epidérmicas em que o HSV-1 pode penetrar a partir da camada basal. O passo crítico é a separação da epiderme da derme por tratamento com dispase II, que, dependendo da estirpe de ratinho, deve ser adaptado. A concentração de dispase II pode variar de 2.5 a 5 mg / ml, e o tempo de incubação de 20 a 45 min. A coloração da proteína de filamento intermediário queratina 14 permite prever prontamente se a camada basal da epiderme pode ser infectado ou se irá mostra...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1 at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

ex-vivo-infection-of-murine-epidermis-with-herpes-simplex-virus-type-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.1K visualizações.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Vídeo: Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Imunologia e Infecção

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Ceratite herpética recorrente Estroma em camundongos, um modelo para estudar HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Ex Vivo modelo organotípico córnea de Agudos Herpes simplex vírus tipo epiteliais eu Infecção

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Neurociência

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

eletroporação siRNA para modular a autofagia em herpes simplex vírus tipo 1 infectado monocyte derivados células dendríticas

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a seroprevalence that ranges from 60-90% worldwide, the Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) commonly causes mucocutaneous lesions of the orofacial region which also manifest as lesions and infection-associated blindness. While current antiviral drugs are effective, emergence of resistance and persistence of toxic side-effects necessitates development of novel antivirals against this ubiquitous pathogen. Although in vitro assessment provides some functional data regarding an emerging antiviral, they do not demonstrate the complexity of ocular tissue in vivo. However, in vivo studies are expensive and require trained personnel, especially when working with viral agents. Hence ex vivo models are efficient yet inexpensive steps for antiviral testing. Here we discuss a protocol to study infection by HSV-1 using porcine corneas ex vivo and a method to treat them topically using existing and novel antiviral drugs. We also demonstrate the method to perform a plaque assay using HSV-1. The methods detailed may be used to conduct similar experiments to study infections that resemble the HSV-1 pathogen.

We describe the use of a porcine cornea to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Explante de tecido córnea porcina para estudar a eficácia do vírus Herpes Simplex-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Plaquing de Vírus Herpes Simplex

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

siRNA-Based Inhibition of Autophagy in Herpes Simplex Virus-Infected Immature Dendritic Cells

Source: D&#252;thorn, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60190">siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a small interfering RNA (siRNA)-based technique to interfere with autophagic flux. A siRNA targeting FIP200 mRNA is introduced into monocyte-derived immature dendritic cells (iDCs) using electroporation, causing the knockdown of FIP200 expression and leading to the inhibition of nuclear lamin disruption via autophagy. Upon adding herpes simplex virus (HSV), the nuclear egress of viral progeny is inhibited due to the absence of lamin disruption via autophagic flux.

Inibição da autofagia baseada em siRNA em células dendríticas imaturas infectadas pelo vírus Herpes Simplex

Monocyte-derived DCs were generated from leukapheresis products of healthy donors. For this, a positive vote from the local ethics committee has been ...