Gostaríamos de agradecer ao Dr. Evan Newell e Dr. Sean Bendall para o gabarito. Gostaríamos também de agradecer a DVS Ciências e Dr. Sean Bendall para uma amostra das contas Multi-lantanídeos contendo poliestireno. Estamos gratos pelo financiamento do NIH concessão 2 U19 AI057229.

Todas as amostras de células para a CyTOF devem ser fixadas e permeabilizadas. Isto permite uma maior entrada do intercalador de ADN contendo irídio, e também evita que a lise das células durante a lavagem com água MilliQ e ressuspensão passos imediatamente antes de proceder à injecção no citómetro de massa. 1. Start-up da Citómetro Massa <ol><li> Abra o programa de software CyTOF. Selecione Configuração do instrumento. Na guia do gabinete, ir para o canto inferior direito e clique aquecedor &quot;ON&quot; botão. Ligar o aquecedor, pelo menos, 15 min antes do momento desejado para permitir tempo suficiente para que o manto da câmara de pulverização para alcançar 200 ° C. </li><li> Substituir o branco Norm Ject-seringa de 3 ml na bomba de seringa, com uma seringa cheia de água fresca MilliQ. </li><li> Limpeza nebulizador. Backflush o nebulizador usando a seringa eo tubo de puxar 5% citranox 2-3 vezes por meio da porta tanto menor a introdução de líquidos e a porta de maior introdução de gás. Repita retrolavagem com água MilliQ to Remover citranox residual. </li><li> Verificar para confirmar que as luzes no painel frontal do CyTOF são iluminadas, como na Figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figura 1. CyTOF luzes do painel antes de inicialização. <ol start="5"><li> Abra argônio válvula do tanque de gás. Isso deve fazer com que o &quot;ARGON&quot; luz na frente para ligar. </li><li> Fixe o nebulizador para make-up de entrada de gás. Desaparafuse o make-up conector tubulação de gás e remover o preto de borracha o-ring ea peça cônica de plástico branco. Note-se a maior &quot;junta&quot; na haste porta gás introdução do nebulizador. Coloque o conector na porta de introdução de gás. Colocar o anel em O preto sobre a extremidade da porta de gás, e forçar o o-ring passado a parte mais larga da haste da porta. Coloque a peça cónica de plástico branco na parte superior com a parte mais estreita apontou, e parafuso para a tubulação de gás make-up. </li><li&gt; Coloque o nebulizador para o tubo de introdução de líquidos. Insira cuidadosamente o tubo pequeno dentro da abertura na extremidade do nebulizador. Haverá duas paradas, semelhantes em sentir as paradas em uma micropipeta. Primeiro, prima até encontrar resistência à luz, a extremidade do tubo deve ser pequeno, no final da secção recta de vidro. Em segundo lugar, pressionar mais difícil de forçar o fim da secção recta de vidro ainda mais no encaixe, e apertar o parafuso de montagem para selar. Inserir a extremidade do nebulizador para a abertura branco no manto de aquecimento. </li><li> No separador Controlador RFG da janela Configuração do Instrumento, pressione &quot;Start Plasma&quot;. Desde o nebulizador já está inserido, pressione &quot;OK&quot;. O software irá ligar o chiller, iniciar o fluxo de gás, e inflamar um plasma. A tensão detector irá aumentar. Haverá uma janela pop-up dizendo &quot;Plasma seqüência de inicialização foi concluído com êxito&quot; quando terminar, pressione &quot;OK&quot;. Novas luzes deve ser em no painel frontal (Figura 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figura 2. Luzes do painel de plasma CyTOF após inflamado e start-up com êxito. <ol start="9"><li> Ligar bomba de seringa. No canto superior direito, pressione o verde &quot;play&quot; para iniciar a bomba de seringa e começar a fluir líquido através do tubo e pulverização fora do nebulizador. As configurações de seringa padrão são de 3 ml de água. Para que amostra a fluindo através do loop de amostra, a bomba de seringa devem ser periodicamente alterada quando ele é executado fora de água. Na parte superior do ecrã, existe um contador que indica a quantidade de líquido fluiu para fora da bomba de seringa. A bomba de seringa parará quando o contador atingir &quot;3,000&quot; ou o êmbolo atinge a extremidade da seringa. Ao recarregar a seringa, você deve clicar em &quot;stop&quot; em vez do azul &quot;pausa&quot; botão para reiniciar o contador. </li></ol>e &quot;&gt; 2 de Calibração. Diário do Citómetro Massa <ol><li> O citômetro de massa vai precisar de aproximadamente 20 minutos para conseguir um plasma quente e estável antes de calibração. O objectivo dos passos de sintonia é maximizar o sinal desejado do Tm169 ou Tb159, mantendo &quot;Gd155&quot; (óxido; La139 + O16) de sinal inferior a 3% do valor mais elevado. Clique na Aquisição botão Configurações para abrir a janela Configurações de Aquisição de Dados. Na guia Parâmetros, clique na tabela periódica para abrir o painel de seleção de isótopo. Selecione os isótopos na solução de ajuste DVS Ciências listados no manual, em seguida, clique em &quot;salvar&quot;. </li><li> Clique nos Isótopos por leitura botão para abrir a Massa (s) por janela de leitura. Selecione &quot;Pulsos Count&quot;, e redimensionar o eixo-y, digitando um novo número e pressionar &quot;enter&quot;. </li><li> Encha uma seringa de 1 ml verde Norm-Ject com solução de sintonia. Rode o selector de porta amostra para &quot;carregar&quot;, injetar 450 ml de solução de sintonia, ligue o selector para &quot;injetar&quot;. Na guia Calibração de Missa do Acquisit Dados<html> íon janela Configurações, pressione &quot;Executar&quot; para monitorar o que as massas estão fluindo por. O lado esquerdo da janela é menor massa, enquanto que o lado direito é mais elevada em massa. Nota: existirão sinais na região de 9400-9800 TOF, devido aos isótopos de xénon no gás árgon (Figura 3). Espere até que os isótopos de soluções de afinação começam a aparecer como faixas neste display (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figura 3. Missa janela da guia de calibragem, mostrando os níveis de fundo para vários isótopos após a solução de lavagem e enxágüe. A região em torno TOF 9400-9800 corresponde a isótopos de xenônio no gás argônio, e deve estar sempre presente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . 4 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg / &quot;/&gt; Figura 4. Missa janela da guia de calibração, mostrando faixas verticais de vários isótopos em DVS solução tuning. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol start="4"><li> Volte para o Massa (s) por leitura janela e pressione o verde botão &quot;Play&quot; no canto superior esquerdo. Cada isótopo seleccionado no passo 2.1 é representada por uma linha de cor diferente. O padrão eixo x é &quot;Time&quot;, em seg. Monitorizar os níveis de isótopos diferentes até que eles são estáveis. </li><li> Sintonia da corrente. Na guia Parâmetros da janela Configurações de Aquisição de Dados, selecione &quot;corrente&quot; no menu drop-down. Vamos começar = 0, acabamento = 10 valor do passo, = 0,5 tempo, estabelecendo-se = 200, e pressione &quot;salvar&quot;. Clique novamente no Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora &quot;atual&quot;. Notar que os sinais de pico de isótopos (Figura 5), e r<html> ECORD. Na guia Configuração do DAC Canais da janela de configuração do instrumento, desça até &quot;atual&quot; e digite o novo valor. Pressione o botão &quot;Definir valor actual&quot;, depois em &quot;salvar&quot;. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figura 5. Perfil ajuste atual. <ol start="6"><li> Sintonia do gás tornar-se-. Alterar menu drop-down para &quot;gás Make-up&quot;. Vamos começar = 0,55 final, = 0,95 valor do passo, = 0,05, tempo de sedimentação = 200. Pressione salvar. Voltar para a Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora &quot;Make-up gás&quot; taxa de fluxo. Gravar em que os sinais de pico de isótopos. Observar o rápido aumento da &quot;Gd155&quot; sinal perto do fim (Figura 6). Voltar para a guia Configuração DAC Canais, desça até &quot;gás Make-up&quot;, e digite o novo valor. Pressione o botão &quot;Definir valor actual&quot;, depois em &quot;salvar&quot;. </li></ol>igura 6 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg / &quot;/&gt; Figura 6. Make-up perfil sintonia gás. <ol start="7"><li> Proporção de gravação desejado isótopo óxido vs. Faça uma injeção de 450 segundo ml de solução de sintonia. Na guia Parâmetros, selecione &quot;Time&quot; a partir do menu drop-down, vamos começar = 0 end, = 10, valor do passo = 1, tempo de repouso = 200. Pressione o botão &quot;salvar&quot;. Hit &quot;play&quot; em Massa (s) por leitura janela. Após as linhas de ter estabilizado (Figura 7), use o cursor para ler o valor nas caixas superior esquerdo para Tm169 ou Tb159 (maior valor) e também o valor &quot;Gd155&quot; (&lt;3% do valor mais elevado). Estes valores também podem ser salvos em um arquivo de ajuste para referência futura. </li></ol><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figura 7. Medição de intensidades de ajuste de sinal solução após a otimização de gás atual e Make-up. <ol start="8"><li> Limpeza de samloop de PLE. Injectar 3 ml de água MilliQ através do laço de amostra, seguido de 500 ul de solução de lavagem DVS. Monitorar o progresso da limpeza pressionando &quot;corrida&quot; na guia Calibração de Massa. Lavar até que a intensidade das estrias (Figura 4) começa a diminuir, siga por 3 ml de água MilliQ e monitor até que a níveis de fundo (Figura 3). </li></ol> 3. Amostras de funcionamento <ol><li> Abrir a janela de aquisição. Configurações padrão: fazer uma análise = On-The-Fly, o sinal para analisar os dados = Dual, calibração de contagem dupla =. Redução de Ruído é selecionado. Qualquer um destes pode ser alterado, se desejado. Digite o nome do arquivo. Todos os arquivos devem ser salvos no :/ E / unidade. </li><li> Definir atrasos de aquisição. Haverá um ligeiro atraso no registo de eventos celulares de cerca de 30 segundos, devido ao comprimento do tubo entre o circuito de amostra e do nebulizador. Portanto, a soma total de &quot;atraso Aquisição&quot; e &quot;st Detectoratraso capacidade &quot;deve ser de pelo menos de 30 seg. atraso estabilidade Detector deve ser pelo menos de 20 seg. </li><li> Definir dados de tempo de coleta. &quot;Tempo de aquisição&quot; é o número de segundos que você deseja executar a sua amostra. Enchendo toda a malha 450 ul de amostra seria necessário para completar 600 sec. Sugere-se que 50-100 seg ser adicionado ao fim do tempo de execução para minimizar amostra carry-over. </li><li> A ressuspensão das amostras. Para minimizar a acumulação de sais na máquina, sugere-se que, pelo menos, duas lavagens em água MilliQ ser feito no final da coloração das células, seguida por uma re-suspensão final em água MilliQ. O volume de água MilliQ utilizado para ressuspender o sedimento de células variará dependendo do número de células que começaram com a recuperação de células e, após o procedimento de coloração inteiro. Um bom ponto de partida é 10 6 (partida) células / ml. Após ressuspensão, filtrar através de um filtro celular para remover agregados. </li><li> Inicial da amostra executado. Digite um novo nome para a amostra.<html> Mudar a válvula de loop de amostra para &quot;carregar&quot;, injectar a amostra, voltar para &quot;injetar&quot;, depois clique em &quot;Run&quot; na janela de Aquisição. </li><li> Registo de eventos celulares. As células serão representados na janela do instantâneo como coleções horizontais de marcas em cada canal isótopo / marcador vertical (Figura 8). Enquanto o citómetro de massa podem registar-1000 células / s, melhor resolução entre os eventos celulares é geralmente obtida a 300-500 células / seg. Isto corresponde a uma média de ~ 1 atualização celular / tela. Pode levar até 30 seg antes do contador de eventos celular começa a subir. Isto é devido ao &quot;On-the-fly&quot; de processamento de dados, sem informações sobre o evento celular é perdido. </li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Figura 8. Janela Acquisition amostra durante funcionamento, mostrando as linhas horizontais de pontos correspondentes aos elementos associados com três eventos celulares separados.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. <ol start="7"><li> Qualidade de eventos celulares. Notar qualquer fundo faixas em cada canal de isótopos, bem como a taxa do evento de células. O citómetro de massa reconhece um &quot;evento de células&quot;, como um certo aumento no sinal acima do fundo, de modo de sinal de fundo a partir de metal livre ou não ligada do anticorpo pode alterar a &quot;célula&quot; evento de contagem. Além disso, as células funcionando em uma concentração demasiado elevada pode provocar um aumento do número de eventos de gibão. O fundo pode ser diminuída por lavagens adicionais ou de diluição maior de células. Dupletos podem ser minimizados através da diluição maior de células, com o custo de maior tempo de execução. </li><li> Acabamento de aquisição de dados de amostra. Quando o tempo de aquisição tenha sido alcançado, a recolha de dados irá terminar. Haverá um pouco de atraso antes de uma janela pop-up com um botão &quot;OK&quot; aparece, novamente, isso é devido ao &quot;On-the-fly&quot; processamento de dados. Aquisição da amostra também pode ser parado Prematurely por bater o botão &quot;Stop&quot;. Neste caso, todos os eventos celulares já registados serão contados e transformados em arquivos de saída. </li><li> Injecção de pelo menos 500 ul de água MilliQ entre cada uma das amostras também ajuda a minimizar a mistura de amostras. </li></ol> 4. Limpeza da máquina após o uso <ol><li> Lave solução. Após a amostra final é executado eo loop de amostra lavada com água, injetar 450 ml de solução de lavagem para o loop de amostra. Monitorar o lançamento de metal livre na guia Calibração de Massa da janela Configurações de Aquisição de Dados como no Passo 2,8 (Figura 9). Quando o sinal de metal livre começa a diminuir, lave com 3 ml de água MilliQ e monitorar os níveis de fundo até que sejam alcançados. </li></ol><img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figura 9. Missa janela da guia de calibração, durante o pós-run limpeza com solução DVS Wash. As listras verticais em TOF região 9800-11000 são anticorpos rótulo isótopos sendo limpos para fora da máquina. As estrias verticais ao redor TOF 11.500 correspondem aos dois isótopos intercalador IR. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . 5. Desligar a máquina <ol><li> No separador Controlador RFG da janela Configuração do instrumento, selecione &quot;Stop Plasma&quot;. Quando o procedimento estiver concluído, haverá uma janela pop-up pedindo que você retire o nebulizador. Pressione o botão &quot;OK&quot;. Na aba do gabinete, desligue o aquecedor. Fechar a válvula da fonte de árgon. </li><li> A remoção do nebulizador. Remover o nebulizador a partir da câmara de pulverização por puxar cuidadosamente para trás. Desaparafuse o tubo de introdução de amostra de 1,6 passo e colocar de lado. Desaparafuse o make-up de conexão introdução de gás para soltar um pouco, em seguida, puxe o nebulizador fora. Deixando o encaixe aparafusada irá reduzir as chances de losing a borracha preta o-ring e peça cónica de plástico branco. </li><li> Limpeza nebulizador. Backflush ambas as portas do nebulizador com citranox 5% utilizando a seringa e tubo como no Passo 1.3. Loja, coberto, no citranox 5% até a próxima utilização. </li></ol>

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Os autores trabalho, tanto no centro de monitoramento imunológico humano, um centro de serviços na Universidade de Stanford, que cobra taxas de utilização apenas para recuperar o custo de ensaios, incluindo a citometria de massa.

Para as últimas décadas, a citometria de fluxo de fluorescência tem sido um método laborioso para a análise de células individuais, quer em termos de expressão de superfície e em ensaios funcionais. No entanto, os problemas de sobreposição espectral dos corantes fluorescentes tem limitado o número de marcadores em simultâneo. Embora experimentos com mais de 12 marcadores simultâneos têm sido relatados, o montante da compensação necessária torna esta tecnicamente difícil. Em...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CyTOF TM massa citómetro </td><td> DVS Ciências </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lave solução </td><td> DVS Ciências </td><td> 201071 </td><td> 0,05% de ácido fluorídrico em água </td></tr><tr><td> Ajustando solução </td><td> DVS Ciências </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, traço de ácido nítrico </td></tr><tr><td> Ue contêm esferas de poliestireno </td><td> DVS Ciências </td><td> 201073 </td><td> Contém isótopos naturais abundância UE; contas fornecidos em aproximadamente 1 milhão / mL </td></tr><tr><td> Multi-lantanídeos contendo (La / Pr / Tb / TM / Lu) - esferas de poliestireno </td><td> DVS Ciências </td><td> Ainda não disponível comercialmente </td><td> Contém natural abundância de isótopos de lantanídeos listadas </td></tr><tr><td> Ácido nítrico (concentrado) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima-trace metal puro ICP-MS grau </td></tr><tr><td> Tubo de fundo redondo de poliestireno com células coador-cap-5ml </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> usado para filtrar amostras de células antes da injecção </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin seringa-1mL </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010-200V0 </td><td> sem silicone, sem látex </td></tr><tr><td> Norm-Ject-seringa de 3 mL </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010.000V0 </td><td> sem silicone, sem látex </td></tr><tr><td> Água MilliQ </td><td></td><td></td><td> 18 MQ água pura, não deve ser armazenado em garrafas de vidro ou de plástico que foram lavados com detergente comercial (devido a seus altos níveis de presente de bário). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> detergente ácido </td></tr><tr><td> O gás argônio </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% de pureza ultra-elevada </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

Nos últimos anos, a análise rápida de células individuais tem sido normalmente realizadas utilizando a citometria de fluxo por fluorescência e anticorpos marcados. No entanto, a questão da sobreposição espectral de emissões fluoróforo tem limitado o número de sondas simultâneas. Em contraste, o citómetro de nova massa CyTOF por casais DVS Sciences um sistema de introdução de líquido de uma única célula de um ICP-MS. Uma vez de fluoróforos, os polímeros de quelação que contenham os isótopos de metal altamente enriquecidas são acopladas a anticorpos ou outras sondas específicas. 2-5 Devido à pureza do metal e resolução de massa do citómetro de massa, não existe nenhum &quot;sobreposição espectral&quot; de isótopos vizinhos, e, portanto, não há necessidade de matrizes de compensação. Além disso, devido ao uso de metais lantanídeos, não há biológico e, por conseguinte, qualquer equivalente de autofluorescência. Com uma janela de massa estendida massa atómica 103-203, teoricamente até 100 etiquetas podem ser distinguidos simultaneamente. Atualmente, Mais de 35 canais estão disponíveis usando os reagentes quelante disponível a partir de DVS Sciences, permitindo a dissecção sem precedentes do perfil imunológico de amostras. 6-7 Desvantagens para citometria de massa incluem o requisito estrito para um isótopo de metal separado por sonda (nenhum equivalente de dispersão frontal ou lateral), e o facto de que é uma técnica destrutiva (sem possibilidade de separação de recuperação). A actual configuração do citómetro de massa também tem uma taxa de transmissão de células de apenas ~ 25%, o que requer um maior número de células de entrada. Desempenho diário ideal do citômetro de massa requer várias etapas. O objectivo básico da optimização é maximizar a intensidade de sinal de medição dos isótopos de metal desejados (M) ao mesmo tempo minimizando a formação de óxidos (M 16), que irá diminuir a intensidade do sinal M e interferir com qualquer sinal desejado em M 16. O primeiro passo é aquecer a máquina para um quente, eu estávelCP plasma foi estabelecida. Segundo, as definições para a taxa atual e make-up de fluxo de gás deve ser otimizada em uma base diária. Durante a recolha de amostra, a taxa máxima de células evento é limitada pela eficiência do detector e a velocidade de processamento de 1000 células / segundo. No entanto, dependendo da qualidade da amostra, uma taxa mais lenta do evento de células (300-500 células / segundo), é usualmente desejável para permitir uma melhor resolução entre os eventos de células e, assim, maximizar singlets intactas sobre doublets e detritos. Por fim, a limpeza adequada da máquina no fim do dia, ajuda a minimizar o sinal de fundo, devido ao metal livre.

Seguindo o protocolo acima deve realizar quatro coisas. Em primeiro lugar, permitindo que o tempo de aquecimento adequado para o citômetro de massa irá produzir um plasma quente e estável necessário para o sinal ótima e formação de óxido mínimo. Lavagem, segundo adequada do citómetro de massa com MilliQ água e solução de lavagem DVS (Figura 9) vai ajudar a reduzir os níveis de metal de adsorção para a tubagem e outras partes da máquina, ajudando a reduzir o fundo durante a aquisição d...

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Os passos necessários para a sintonização diária e optimização do desempenho de um citómetro de massa CyTOF são descritos. Comentários sobre a preparação da amostra ideal e vazão são discutidos

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K visualizações.  Stanford University. Os passos necessários para a sintonização diária e optimização do desempenho de um citómetro de massa CyTOF são descritos. Comentários sobre a preparação da amostra ideal e vazão são discutidos

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Bioengenharia

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Largo-campo microscopia de fluorescência e citometria de fluxo fluorescente de imagens em um telefone celular

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Amostra Estratégias Preparação para Mass Spectrometry imagem da cultura celular 3D Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, known as the Aristotle's lantern, is a compelling source of bioinspiration with an intricate network of musculature and calcareous teeth that can scrape, cut, chew food and bore holes into rocky substrates. We describe the bioinspiration process as including animal observation, specimen characterization, device fabrication and mechanism bioexploration. The last step of bioexploration allows for a deeper understanding of the initial biology. The design architecture of the Aristotle's lantern is analyzed with micro-computed tomography and individual teeth are examined with scanning electron microscopy to identify the microstructure. Bioinspired designs are fabricated with a 3D printer, assembled and tested to determine the most efficient lantern opening and closing mechanism. Teeth from the bioinspired lantern design are bioexplored via finite element analysis to explain from a mechanical perspective why keeled tooth structures evolved in the modern sea urchins we observed. This circular approach allows for new conclusions to be drawn from biology and nature.

A protocol for bioinspired design is described for a sampling device based on the jaws of a sea urchin. The bioinspiration process includes observing the sea urchins, characterizing the mouthpiece, 3D printing of the teeth and their assembly, and bioexploring the tooth structure.

Um protocolo para Bioinspirada Projeto: Um Sampler terra Baseado em Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Um protocolo para múltiplo knockout de genes em ratos Organoids Intestinal Pequeno Usando um CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...