Agradecemos a Aida de la Cruz para desenvolver e ensinar o protocolo original em que esta versão é baseada 10. Trabalho no Buttitta Lab é financiado pelo NIH conceder GM086517.

1. Fly Pecuária <ol><li> Cruz voa de genótipos desejados em frascos de plástico estreitas com 10 ml de levedura-Glucose Médio 3 ou outros meios de comunicação ricos em proteínas de sua escolha. As extensas Drosophila transgénicas ferramentas disponíveis para a expressão específica de tecido e da linhagem de rastreio com a expressão da proteína fluorescente in vivo estão descritos em detalhe noutro local 4,5. Transfira os pais frascos frescos diariamente para obter série de 24 coleções de progênie RH ou para o estadiamento mais preciso, coletar embriões em placas de ágar e transferir larva recém eclodida para frascos, conforme descrito 10. Para garantir condições uniformes de experimentos e evitar a aglomeração, o número total de descendência F1 num frasco deve ser não mais do que 100. Dependendo da estrutura genética do experimento, manter os frascos num incubador adequada até que o estádio de desenvolvimento desejado. </li><li> Coletar animais experimentais: você vai precisar larvas maduras no 3 º larvalinstar (L3) em cerca de 110-120 horas de desenvolvimento para dissecções larvas ou branco prepupa (WPP) para o preparo de pupa preciso. Alterações do ciclo celular dramáticas, incluindo uma mudança para um estado não-proliferativa ocorrer em instantes distintos durante a metamorfose 12,13. Portanto preparo correto de pupa (dentro de 1 hr de desenvolvimento) é essencial para os dados do ciclo celular reprodutíveis durante a metamorfose. WPP corresponde a 0 horas depois da formação de crisálidas (0 hr APF), como mostrado na Figura 1, o painel I. Recolha WPP em de 35 mm sobre uma placa de Petri Kimwipe desistiu molhado com 2,5 ml de água para manter uma certa humidade. Idade pupa até o estágio (horário APF) desejado em temperatura adequada. Note-se que o desenvolvimento prossegue, 1,2 vezes mais rápida a 29 ° C e 2,2 vezes mais lentamente a 18 ° C do que no padrão de 25 ° C 14. </li><li> Animais de choque térmico para ativar choque térmico flipase (hs-flp) induzida por recombinação de clones linhagem de rastreamento, se necessário 9,11. Para o choque térmico de larva, mergulhefrascos em um banho de água (a 37 ° C) e garantir larvas são totalmente submerso. Para o choque térmico de pupa, selar a placa de Petri com Parafilm e mergulhe-o em banho-maria por completo. Certifique-se de remover Parafilm após o choque térmico, para permitir a troca de oxigênio suficiente para a sobrevivência animal. A duração do choque de calor depende da actividade do transgene flipase utilizado e do número de clones desejados. Rotineiramente usamos 7-8 min para induzir &quot;Flipout&quot; linhagem rastreamento clones 15 em larvas com o hs-flp transgene no primeiro cromossomo e 2-4 min por choque térmico de pupas em 35 milímetros pratos, enquanto o hs-flp transgene em o segundo cromossoma requer de 20 minutos. choque térmico para se obter um número semelhante de clones. </li></ol> A taxa de divisão celular e de sincronização de dissecção determina o tamanho do clone em cada tecido. Em condições normais, nós achamos que clones induzido na asa larval com 20 min de choque térmico (usando o hs-flp transgene no segundo cromossomo) e dissecçãoted 48 horas mais tarde, contêm cerca de 20-30 clones bem separados, com tamanhos que variam de 10 células por clone de duas células por clone, com uma média de cerca de quatro células por clone. Em contraste, a 7 minutos de choque de calor com a mesma hs-flp transgene de pupas numa placa de Petri, a 0 hr APF dissecados 36 horas mais tarde, os rendimentos de clones bem separadas (aproximadamente 15-25), variando de um a quatro células, com uma média de 2,2 células por clone. Tais dados podem ser utilizados para determinar o tempo de duplicação médio de célula para o tecido em estudo. 2. Dissecação <ol><li> Gentilmente transferir as larvas / pupas de uma clara dissecação prato de vidro contendo 1X PBS. </li><li> Usando um microscópio e muita luz dissecando, segure suavemente a larva pelo abdômen com um Inox afiada º 5 pinça, corte do terço anterior com micro-tesoura, e inverter a terceira anterior, empurrando para dentro área da boca em direção ao posterior, mantendo a larval cutícula constante (Figura 1A). Remova cuidadosamente opaque gordura corporal e qualquer intestino remanescente para aumentar a visibilidade dos tecidos desejados, tais como asa, olho ou cérebro. Dissecar os tecidos desejados; limpa remoção asas da traquéia e cutícula com uma pinça, os olhos da boca-ganchos, ou cérebro dos olhos (Figura 1G). </li><li> Para dissecar pupa; utilizar uma pinça para agarrar uma pupa suavemente pela ponta anterior da pupa caso em que existe uma bolha de ar, para evitar danificar a pupa dentro (Figura 1C). Pinça ou micro-tesouras no lado oposto pode ser utilizada para ajudar a posicionar a pupa flutuante para agarrar apropriada. Cleanly cortar a ponta posterior da pupa com micro-tesoura. Este corte transversal deve ser feita em um pequeno ângulo para a parte dorsal do animal, para liberar a pressão interna sem forçar a gordura histolyzed nos tecidos desejados no tórax e na cabeça. Corte cuidadosamente ao longo da mediana dorsal, evitando as asas e do complexo olho-cérebro anterior. Remova cuidadosamente a pupa da pupacaso, segurando a borda posterior da epiderme pupa e puxando-o para fora do caso de pupa (Figura 1D). Picar um pequeno buraco no anterior cutícula ao complexo olho-cérebro com uma pinça. Usando um vidro Pasteur pipeta com uma pêra de borracha, lave delicadamente solução dissecção PBS através da pupa parcialmente dissecado para remover a gordura histolyzed e qualquer tecido do intestino remanescente. Isto também eficazmente lubrifica a pipeta de vidro com lípidos e proteínas, o que reduz a incidência de tecidos dissecados de furar para o interior da pipeta de vidro posterior. </li><li> Para obter asas de pupa, a cutícula envolvendo o ala e da própria ala deve ser erguida a partir da pupa (Figura 1E). Isto pode ser feito segurando a pupa por baixo da cabeça com uma pinça, enquanto utilizando uma outra pinça para agarrar a ponta ou mais posterior da cutícula da asa e puxar para fora ou manobrar o fórceps sob a asa perto da dobradiça antes desalojando-o do lado de a carcaça (Figura 1E). A asa pode então ser cortada ou rasgada na dobradiça para removê-la a partir do corpo e colocado numa pilha de distância das carcaças e outros materiais. </li><li> Para obter olhos pupa ou cérebro, lave a pupa até o complexo olho-cérebro torna-se desalojado e livre da pupa (Figura 1F, 1H). Usando uma pinça, puxe o olho pupal longe do cérebro e salvar o tecido desejado. </li><li> Não demorar mais de 45 minutos para dissecar cada amostra, os resultados torna-se menos precisa das células maiores são deixados em PBS após a abertura dos animais. </li></ol> 3. A dissociação de tecidos e de DNA de Coloração <ol><li> Usando uma pipeta Pasteur lubrificado, transferir cuidadosamente os tecidos dissecados em 0,5 ml de solução de coloração de ADN vivo num tubo de 5 ml de poliestireno (Figura 1G). Transferência tão pouco quanto possível de PBS (menos do que 300 ul) à solução corante de ADN, como a diluição de tripsina irá inibir a dissociação de tecidos. </li><li> Incubar os tubos com shaking a 23 ° C a 500 rpm (usamos um Thermomixer de Eppendorf). </li><li> Incubar por 70 min, em seguida, vortex suavemente durante 5 segundos a uma velocidade média (criação de 5). Vórtex excessiva causará ruptura celular e detritos forma, enquanto que sob-vórtex conduzirá a aglomerados de células. Retorno as amostras a agitação a 23 ° C a 500 rpm durante mais 15 a 20 minutos antes de vórtex se mais uma vez durante 5 segundos na velocidade 5. </li><li> Para cérebros e olhos pupa mais de 36hAPF, é necessário um protocolo modificado. Separar os tecidos em solução de coloração de ADN a 23 ° C a 500 rpm durante 45-60 min em tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Em seguida, um-a-um dissociar manualmente grandes pedaços de tecido, transferindo para prato de dissecação, juntamente com cerca de 50 mL da solução de DNA de manchas e rápido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de Pasteur, desenhada manualmente 16 (abertura de cerca de 100-150 um). Transferir cada espécime dissociados com o resto do 0,5 ml da solução de coloração de ADN para um tubo de 5 ml. Incubar mais 45-30 Min (até 90 minutos do tempo total de incubação) a 23 ° C com agitação a 500 rpm até aglomerados já não são visíveis. </li><li> Totalmente amostras dissociados deve ter muito poucas grandes pedaços visíveis de tecido, embora note que o acelular transparente cutícula asa pupa não se dissociam. </li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Ligue o citômetro Attune e abrir o software Attune. Os lasers citómetro deve ser ligada através do menu de inicialização, e um teste de desempenho diário deve ser realizado com os grânulos acompanhamento de desempenho com pontuações adequadas antes de cada dia de aquisição de dados. Níveis de fluido deve ser pelo menos meio cheio e resíduos esvaziado antes do teste de performance. Detalhes para inicialização, calibração adequada e operação do Attune podem ser encontradas no Guia do Usuário do Attune ( <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ) </li><li> Projetar uma nova template criando quatro gráficos de pontos e dois histogramas em um espaço em branco com os parâmetros indicados no item 4.3, ou selecionar um modelo previamente elaborado adequado para o experimento, e indicar o número de amostras a serem coletadas. Temos desde modelos sintonizar (arquivos em formato. Obter) para análise ao vivo do ciclo celular Drosophila com Vybrant DyeCycle Violeta e GFP ou expressão RFP no Apêndice I. </li><li> Os modelos fornecidos incluem quatro gráficos de pontos e dois histogramas com os parâmetros indicados na Figura 2. Canais para detecção incluem: FSC e SSC - dispersão para a frente e dispersão lateral indica o tamanho e complexidade da membrana celular, VL1 altura (H), largura (W) e área (A) - indicando excitação laser violeta de coloração violeta DyeCycle o DNA, e BL1 -A - Azul Canal 1 Área de laser, que indica fluorescência da GFP. O molde fornecido para análise RFP é idêntico ao modelo de análise de GFP, excepto que se utiliza o canal de laser azul 3 (BL3-A), que é optimized para detecção de RFP. </li><li> Os gráficos de pontos nos modelos têm portas de análise de restrição para as populações pretendidas e para limitar e detritos de células aglomerados a partir de análise (Figura 2). Portão 1 exclui detritos e aglomerados baseados em FSC vs SSC (Figura 2A). Gate 2 exclui células não coradas, as células em apoptose G1 sub e aglomerados de células com base em identificação de singlets (VL1Area vs VL1Width) (Figura 2B). Portão 3 é derivada de um portão, as células que engloba dentro portões 1 e 2, e identifica a GFP (ou RFP), células negativas contra o conteúdo de ADN com base em VL1Height (Figura 2C). Portão 4 é um derivado do portão, as células que engloba dentro portões 1 e 2, e identifica a GFP (ou RFP) células positivas versus conteúdo de DNA (Figura 2C). Os gráficos de pontos de tamanho de célula medido por GFP (ou RFP) versus dispersão frontal (FSC), são usados ​​para gerar portões 5 e 6 (Figura 2D). O conteúdo de DNA trama dois histogramas no eixo X e contagem de células no Y-axis para as populações definidas pelo portão 3 e Portão 4. (Figura 2E e 2F) histogramas pode também ser incluído para se desejado, o tamanho da célula (não mostrado). Para histogramas tamanho da célula, as populações devem ser definidos para portões 5 e 6, traçando FSC no eixo X e conta com o eixo-y. </li><li> Conjunto de gravação para parar a 10.000 GFP ou RFP eventos positivos (este será Gate 4, o Portão derivado de Portão 1, Portão 2 eo portão positivo GFP ou RFP). Varia de 6000 - 10.000 GFP eventos positivos têm sido tradicionalmente o objetivo de perfis de qualidade de publicação 9,11. Sugerimos utilizar um mínimo de 15 asas ou olhos, que são aproximadamente 50% GFP positivo para obter Portão suficiente 4 eventos para 10 perfis de alta qualidade. No entanto, temos obtido êxito dados claros para a análise do ciclo celular preliminar de tão poucos como seis asas (Figura 3A). Defina o volume de aquisição de 300 ml, este irá utilizar cerca de 460 mL do total de 0,5 ml da amostra. Tatabela 2 mostra as definições de limiar e tensão adequadas previstas no molde para o exemplo na Figura 2. </li><li> Executar amostras a sensibilidade padrão ou de alta sensibilidade de 100 mL / min e registro. Encontramos pouca ou nenhuma diferença em nossa análise com os diferentes níveis de sensibilidade. Devido à acústica foco de células, este citômetro pode medir com precisão amostras em altas taxas de fluxo. Ao contrário cytometers tradicionais, encontramos nenhum compromisso com a aquisição de dados em velocidades de até 1.500 eventos por segundo. Os ficheiros de dados gravados gerados pelo software Attune estão no formato. FCS, que é compatível com a maioria dos softwares de modelagem de ciclo celular. </li></ol> 5. Análise de Dados <ol><li> Os histogramas do tamanho das células e o conteúdo de DNA para GFP (ou RFP) populações positivas e negativas podem ser comparados. Eles podem ser colocados em camadas manualmente copiando e colando usando o software Adobe Photoshop. Se o eixo-y é definido como automático, o eixo Y será ampliado com a highest contagem para cada amostra. Sobreposição de dois gráficos com o conjunto do eixo Y para autoscale cria uma sobreposição de histogramas com os eixos definidos para o máximo global para cada população. Isto permite a comparação fácil visual para modificações relativas na faseamento do ciclo celular, mesmo quando o número total de células de GFP positivas e negativas GFP populações não são equivalentes (exemplo na Figura 3B). Alternativamente, um costume eixo y (opção manual eixo y) pode ser ajustado para um valor fixo para os histogramas. Neste caso, podem ser comparados aos números de células relativos de duas populações. Como o Attune utiliza um volume definido de amostra de cada corrida, a quantificação absoluta de células para cada experiência, em cada porta, com percentagens do total da população, pode ser obtida a partir da tabela de estatísticas gerado automaticamente, durante o funcionamento, no espaço de trabalho (exemplo na Figura 3F ). Gráficos de pontos e histogramas também podem ser facilmente em camadas no software Attune, simplesmente arrastando e soltando diferentes amostras a partir de diamenu de arquivo de amostra e à direita para o gráfico desejado de uma amostra aberta para comparação. No entanto, para sobrepor subpopulações de dentro de uma única amostra (isto é, a GFP e GFP positivo negativa dentro da mesma amostra), usamos Photoshop. </li><li> Dois métodos podem ser usados ​​para encontrar a percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular de uma população. O método de aproximação baseia-se em regiões definidas pelo usuário para delinear os limites do G1, S, G2 e G2&gt; picos. Este método permite que as estimativas rápidas e fáceis de percentagens nas regiões definidas pelo usuário (Figura 3E). Montamos nossas regiões com base em um teste direto com células Kc Drosophila, marcado para a fase S com etinil-deoxiuridina (UDE) incorporação. O segundo método usa o software de modelagem de terceiros para a estimativa da distribuição do ciclo celular. Nós usamos software ModFitLT (Verity Software House), por exemplo, na Figura 3F. </li></ol>

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	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. 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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui descrito permite a análise do ciclo celular, o tamanho da célula relativo e número relativo de células em tecidos de Drosophila vivo em vários estágios de desenvolvimento. Quando esta análise é acoplado com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula ou linhagem rastreamento, informações detalhadas podem ser obtidas sobre respostas celulares ao ciclo celular discreta ou perturbações de crescimento. Como prova de princípio, interrompido quietude no cérebro da...

A citometria de fluxo pode ser usado para as medições de viabilidade celular, o tamanho da célula relativo, teor de ADN e expressão de proteína fluorescente em populações de células vivas. Devido à replicação do ADN nuclear durante a fase S, as informações sobre o conteúdo de ADN numa população de células pode ser usada para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular 1-3. Este método tornou-se um elemento fundamental da análise do ciclo celular, em sistemas modelo de leveduras aos mamíferos. A mosca da fruta Drosophila melanogaster, tornou-se um sistema modelo excelente para a análise in vivo genética de regulação do ciclo celular. As extensas ferramentas genéticas disponíveis em moscas permitir manipulações tecido elegante específicas e temporalmente regulada de reguladores do ciclo celular, juntamente com a linhagem baseada em proteína fluorescente vivo rastreamento 4-6. A citometria de fluxo foi utilizado para estudar o conteúdo de DNA numa série de tipos de células de Drosophila, incluindo endoreple células mitóticas cultivadas icating 7,8. Um avanço importante para estudos do ciclo celular in vivo foi realizada por de la Cruz e Edgar, com o desenvolvimento de um protocolo de análise por citometria de fluxo directo diplóides 9,10 discos imaginais de Drosophila, um protocolo que foi usado e adaptado por muitos laboratórios. Esta técnica, quando acoplado com material genético in vivo linhagem rastreio através da expressão da proteína fluorescente indutível e rotulagem tecido específico, permite a obtenção de informações sobre os efeitos de manipulação de genes no tempo de duplicação celular em geral, o tamanho das células e determinar a temporização precisa de fases do ciclo celular in vivo 9 , 11. No entanto, este método tem, até agora, baseou-se no uso da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante ao manchar e quantificar o DNA em células vivas, o que tem limitado a utilizadores citómetros de fluxo com um laser de UV capaz de excitar o corante de Hoechst. Estes são geralmente encontradas apenas em classificadores (ou seja BD FACS Vantage, BD FACSAria) ou caro multicolor sistemas de bancada (ou seja BD LSR), geralmente necessitando de apoio institucional por instalações do núcleo de fluxo. Nós modificamos o protocolo baseado em Hoechst usar um corante de DNA de células vivas de novo Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violeta. Este é compatível com o corante violeta de 405 nm, um laser, mais comum em analisadores de bancada menores e disponíveis no analisador de bancada pequena auto-contido, o acústico Attune Focando Citómetro. Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a análise do ciclo celular, que pode ser acoplado com o tipo de célula, o tamanho da célula, o número de células e a análise da linhagem de uma variedade de tecidos de Drosophila durante várias fases de desenvolvimento, utilizando o violeta e DyeCycle Attune. Este protocolo expande o número de citómetros adequados para esta análise com os tecidos de Drosophila e fornece exemplos de como este tipo de análise de ciclo de células vivas pode ser modificado para tipos adicionais dos tecidos e estágios de desenvolvimento.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

A citometria de fluxo foi utilizada para obter informação sobre o conteúdo de ADN numa população de células, para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular. Esta técnica tem sido aumentado com sucesso para os tecidos mitóticas do organismo-modelo de Drosophila melanogaster para estudos genéticos de regulação do ciclo celular in vivo. Quando combinada com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula e manipulações genéticas, pode-se obter informações detalhadas sobre os efeitos sobre o número de células, o tamanho da célula e do ciclo celular phasing in vivo. No entanto, este método de células vivas foi contado com a utilização da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante, limitando aos utilizadores citómetros de fluxo equipado com um laser de UV. Nós modificamos este protocolo para usar uma tintura nova célula viva DNA, Vybrant DyeCycle Violet, compatível com o violeta do laser 405nm mais comum. O protocolo aqui apresentado permite a análise do ciclo celular eficiente juntamente com célulastipo, o tamanho relativo da célula e informação do número de células, em uma variedade de tecidos de Drosophila. Este protocolo estende a técnica útil para a análise do ciclo celular de tecidos vivos de Drosophila para um pequeno analisador de bancada, a Focagem Citómetro Attune acústica, o que pode ser executado e mantidas numa escala de um único laboratório.

A Figura 2 mostra resultados representativos para uma amostra de larvas de asa, expressando GFP na metade posterior do tecido, utilizando o modelo previsto a GFP. Resultados semelhantes são obtidos com o mesmo tipo de tecido e padrão de expressão para a RFP, utilizando o modelo de RFP fornecida (Figura 3A). Os modelos e voltagens fornecidas (Tabela 2) são adequados para análise de olhos larvais (Figura 3B), cérebros e asas, assim como os olhos, cérebros pupa <str...

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Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Um protocolo para a análise do ciclo celular viva<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos utilizando o Attune Acústico Cytometer Foco é descrito. Este protocolo prevê, simultaneamente, informações sobre o tamanho da célula familiar, número de celular, conteúdo de DNA e tipo de célula via linhagem traçado ou expressão específica de tecido de proteínas fluorescentes<em&gt; In vivo</em&gt;.

Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

13.5K visualizações.  University of Michigan. Um protocolo para a análise do ciclo celular viva Drosophila Tecidos utilizando o Attune Acústico Cytometer Foco é descrito. Este protocolo prevê, simultaneamente, informações sobre o tamanho da célula familiar, número de celular, conteúdo de DNA e tipo de célula via linhagem traçado ou expressão específica de tecido de proteínas fluorescentes In vivo.

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Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Realizando lavado vaginal, Crystal coloração violeta, e avaliação citológica vaginal para Rato Identificação ciclo estral Staging

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...