Agradecemos Amanda Rychel de assistência no desenvolvimento do lapso de tempo de protocolo e Lynn Pillitteri para a construção de POLAR :: POLAR-eGFP. Agradecemos também a ABRC para fornecer a pm rb-construir. Este protocolo foi desenvolvido através de um suporte da adjudicação PRESTO do Japão Ciência, Tecnologia e Agência. Pesquisa sobre POLAR também foi apoiado pela Universidade de Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) e da National Science Foundation (MCB-0855659). KMP é um NSF graduação Bolseiro de Investigação (DGE-0718124), e KUT é um investigador HHMI-GBMF.

1. Esterilização de sementes <ol><li> Preparar a solução de esterilização de sementes: lixívia 33%, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Coloque as sementes que transportam construção repórter fluorescente desejada (s) e genótipo (s) em 1,7 ml de tubo e aplicar 1 ml da solução de esterilização. Incubar em Nutator durante 15 min. </li><li> Em um capuz estéril, utilizar uma pipeta para remover a solução de esterilização a partir do tubo, deixando atrás de sementes. Enxágüe com 1 ml de água estéril. Repita quatro vezes. </li><li> Incubar a 4 ° C durante dois dias ou mais. </li></ol> 2. Preparação de slides Câmara Mídia <ol><li> Misturar 20 ml de solução a 0,5% de Bacto Agar (agarose não puro) em água, num balão de 200 ml, e de micro-ondas até se dissolver. Seja cauteloso ao ferver a solução. </li><li> Arrefece-se a solução para cerca de 60 ° C. </li><li> Colete 1 ml de solução de agar com um pipetador e lentamente para aplicar a tampa de vidro no interior da câmara de corrediça (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Sistema lamela Alemão). Solução which é muito quente ou muito rapidamente aplicado pode derreter cola ou vidro crack. </li><li> Imediatamente adicionar um segundo ml de solução de agar. Ágar agora deve cobrir completamente o fundo da câmara de slides. Este meio mínimo é suficiente para suportar o desenvolvimento de um dos cotilédones da planta, que contém nutrientes armazenados, durante quatro a cinco dias, mantendo a humidade e permitindo a difusão do gás. </li><li> Slides fresco em bancada com câmara coberta. Se frasco é coberto firmemente, a solução pode ser guardada e reaquecido para uso futuro. </li></ol> 3. Dissecção semente <ol><li> Retire o tubo de sementes estéreis a partir de 4 ° C de armazenagem. </li><li> Colocar um tecido de papel sobre a plataforma de um microscópio de dissecação e humedecer com água. Ajustar o tecido para criar uma superfície lisa. O tecido é utilizado para estabilizar as sementes para dissecção. </li><li> Pipetar 20-30 sementes a partir do tubo para o tecido, tendo o cuidado de os colocar no campo do escopo de dissecação da vista. </li><li> Utilizando uma pinça cortantes (Roboz, # 5 ponta biologia), Remova cuidadosamente o casaco de semente de dentro de mudas. Tegumentos exteriores e interiores, tem de ser removido. </li><li> Quando a imagem de cotilédone, é benéfico para remover o hipocótilo e da radícula. Cotilédones contêm nutrientes suficientes para desenvolver por vários dias sob este protocolo. Se intacto, o hipocótilo irá endireitar e alongar de forma dramática, movendo o cotilédone para fora do campo de visão do lapso de tempo. Usar um bisturi para cortar os cotilédones livres do hipocótilo. </li><li> Segurar cotilédones dissecados imersos em água, em um microtubo ou similar. </li><li> Repita 3,4-3,6 até que o número desejado de cotilédones é atingido. 15-20 dissecções de sucesso são recomendados antes da montagem. </li></ol> 4. Os cotilédones de montagem no slide Câmara <ol><li> Usando uma lamínula pequeno (18 mm 2), cortou os meios de ágar e levantar toda a camada da base até o slide câmara de vidro. </li><li> Pipetar dissecados cotilédones com um mínimo de água de detertubo dentro da câmara de corrediça, por baixo da camada de agar levantada. </li><li> Abaixe cuidadosamente o agar para os cotilédones. Se o excesso de água está presente, mergulhe-o longe com um lenço de papel, tomando cuidado para não perturbar os cotilédones. As amostras não devem mais se mover facilmente quando montagem está completa. </li><li> Coloque a tampa no slide câmara e slides mudança para estágio do microscópio. </li></ol> 5. Time Lapse imagem <ol><li> Configurar microscópio confocal invertido para o fluoróforo imagem desejada (s). LSM700 parâmetros utilizados: para GFP, excitação a 488 nm e de recolha com um filtro passa banda de 440-530 nm; para RFP, excitação a 555 nm e de recolha com um filtro passa banda de 570-610 nm. </li><li> Inspecione espécimes montados por danos. Programar os locais de intacta, devidamente montado cotilédones em software microscópio. No Zen 2009: foco em um cotilédone com 20x objetivo e mover objetivo de centro de slide câmara. Em Modo de Aquisição, mudar o zoom para 0,5 e tamanho &lt;/&gt; Em que 48x48 pixels. Selecione Posições caixa e imagem de digitalização visão geral ... botão sob Posições, em seguida, aumentar o número de telha Horizontal e Vertical para 30-35. Quando a digitalização estiver concluída, clique no botão Posições sob a guia Dimensões e mira lugar em cada cotilédone para observar. </li><li> Configure z série abrangendo a epiderme dos cotilédones de tudo Zen samples.In 2009: Clique na caixa Z-Stack. Selecione cada posição em Lista de posição e clique no botão Mover para. Concentre-se no plano mais alto da epiderme dos cotilédones e clique no botão Definir Primeiro sob Z-Stack. Concentre-se na posição mais baixa na qual epiderme é útil visível e clique no botão Definir passado. Clique no botão ao lado Optimal, que mostra melhor a espessura z-slice, para definir. Verifique cada cotilédone para confirmar que essas configurações abranger todas as amostras, os parâmetros z não pode ser definido por indivposições idual em 2009 zen. </li><li> Configure série de tempo na resolução desejada e comprimento. Intervalos de 15-30 min, durante três dias são eficazes para a dinâmica das proteínas na divisão de células da epiderme. Este intervalo pode ser alterado conforme necessário. No Zen 2009: Clique na caixa de Séries Temporais. Sob série de tempo, definir Ciclos para o número de imagens desejadas usando o controle deslizante ou digitando no campo de texto. Definir Intervalo a 30 e use o menu suspenso para selecionar min. </li><li> Comece xyzt verificação multi-posição. Note-se que o número de posições deverá ser limitada pelas especificações de verificação, se o tempo de verificação total é maior do que o intervalo desejado, os pontos de tempo não será correcta. Um máximo de seis posições simultâneas são possíveis quando imagens GFP e RFP em 59 z fatias em um intervalo de 30 min usando nosso sistema. No Zen 2009: Tamanho do Quadro de Mudança para a resolução desejada e clique em Iniciar Experimento. </li></ol> 6. Edição de Vídeo <ol><li> A partir do arquivo de dados confocal, faça uma intensidade máxima z projeção de cada combinação de tempo / posição e exportação como arquivos de imagem em um formato sem perdas como TIFF. Os nomes dos arquivos devem estar em uma série por posição (por exemplo, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc, não POLAR-GFP_0001_pos1) para o software para combiná-los em um filme. No Zen 2009: Copiar Uso: Subconjunto sob a guia Processamento de dividir posições em arquivos separados, em seguida, projeção de intensidade máxima. Finalmente, exportar como TIFF (Arquivo: Exportação, janela de imagem Resolução completa - série). </li><li> Use FIJI 7,8 para alinhar imagens sucessivas executando a macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Inscrição: bUnwarpJ). Alterar o modo de registo para Mono. Todas as opções avançadas podem usar valores padrão. Para as seqüências longo lapso de tempo, baixar e instalar o macro &quot;Affine + Registro de imagem consistente elástica 2D&quot;, que vai aplicar bUnwarpJ a uma série de imagens automaticamente, e y abertonossos dados usando arquivo: Importar: Seqüência de imagens para usá-lo. Desmarque MOPS extração de pontos de referência e de execução. </li><li> Use FIJI / ImageJ ou QuickTime Pro para abrir a seqüência de imagens alinhadas e salvar no formato de vídeo desejado (AVI é uma boa escolha). </li></ol>

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development.">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449 (1995).</li><li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inz&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis.">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).</li><li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta técnica de lapso de tempo confocal permite estudos longitudinais de expressão da proteína fluorescente etiquetado e localização em células individuais da epiderme cotilédone Arabidopsis, que, no caso de proteínas e de outros POLARES dinamicamente variáveis ​​é fundamental para uma boa compreensão da sua função. Anteriormente, sustentado de tempo de imagem lapso foi utilizado para examinar a infecção fúngica da raiz de Arabidopsis 11 e meristema 5,12 cresci...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Uma câmara-de slides </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Ou duas câmaras (155.379) </td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Software Zen 2009 </td></tr><tr><td> 20x lente objetiva </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0,8, Plano-Apochromat </td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Benz (Nacional) </td><td> 431TBL </td><td> Acende-se a partir de baixo </td></tr><tr><td> º 5 fórceps, biologia ponta </td><td> Roboz instrumento cirúrgico </td><td> RS-4978 </td><td> Dicas muito finassão críticas </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

Imagiologia in vivo na dinâmica do comportamento celular ao longo de uma sequência de desenvolvimento pode ser uma técnica eficaz para a compreensão dos mecanismos da padronização do tecido. Durante o desenvolvimento do animal, a proliferação celular e os eventos chave padronização ocorrer muito rapidamente. Por exemplo, em Caenorhabditis elegans todas as divisões celulares necessários para o plano do corpo larval são concluídas dentro de seis horas após a fertilização, com sete ciclos mitóticos 1; as mitoses 16 ou mais de embriogênese Drosophila ocorrer em menos de 24 horas 2. Em contraste, as divisões celulares durante o desenvolvimento da planta é lenta, tipicamente da ordem de um dia 3,4,5. Isso impõe um desafio único e uma necessidade de longo prazo de imagem ao vivo para documentar comportamentos dinâmicos de divisão celular e diferenciação eventos durante a organogênese planta. Epiderme Arabidopsis é um sistema excelente modelo para sinalização de investigação, o destino de células e desenvolvimento em plantas. No cotilédone, este tecido é constituída por ar e as células resistentes à água do pavimento intercalados com estômatos uniformemente distribuída, válvulas que abrem e fecham para controlar as trocas gasosas e a perda de água. O espaçamento adequado dos estomas estes é crítico para a sua função, e o seu desenvolvimento segue uma sequência de divisão assimétrica e etapas de diferenciação de células da epiderme para produzir organizada (Fig. 1). Este protocolo permite a observação de células e proteínas na epiderme ao longo de vários dias de desenvolvimento. Este intervalo de tempo permite a documentação precisa de células-tronco divisões e diferenciação das células epidérmicas, incluindo estômatos e células epidérmicas pavimento. As proteínas fluorescentes podem ser fundidos com proteínas de interesse para avaliar a sua dinâmica durante a divisão celular e processos de diferenciação. Esta técnica permite compreender a localização de uma nova proteína, POLAR 6, durante a fase de proliferação de células da linhagem estomática-in the Arabidopsis epiderme cotilédone, onde é expresso em células de eventos anteriores de divisão assimétricos e move-se para uma área característica do córtex célula ocorre pouco antes da divisão. As imagens podem ser registrados e vídeo simplificada facilmente produzida usando o software de domínio público para visualizar localização de proteínas dinâmica e tipos celulares como eles mudam com o tempo.

<html> Um conjunto de pontos de tempo recolhidos informativos com este método é apresentado na Figura 3. As membranas celulares são marcados com RFP (pm-rb) e GFP é fundido com a proteína POLAR sob seu promotor nativo (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Na escala de tempo de 30 min, vemos as divisões celulares, juntamente com as mudanças na localização de proteínas precedendo eles. Assimétricos divisões celulares na forma linhagem estomática em células-tronco como precursores estomat...

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Nós descrevemos um protocolo com lâminas de câmara e de mídia para imobilizar cotilédones de plantas para imagem confocal da epiderme durante vários dias de desenvolvimento, documentação diferenciação estomática. Proteínas fluoróforo com a tag pode ser monitorado de forma dinâmica por expressão e localização subcelular, aumentando a compreensão de seus possíveis papéis durante a divisão celular e diferenciação do tipo de célula.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K visualizações.  University of Washington. Nós descrevemos um protocolo com lâminas de câmara e de mídia para imobilizar cotilédones de plantas para imagem confocal da epiderme durante vários dias de desenvolvimento, documentação diferenciação estomática. Proteínas fluoróforo com a tag pode ser monitorado de forma dinâmica por expressão e localização subcelular, aumentando a compreensão de seus possíveis papéis durante a divisão celular e diferenciação do tipo de célula.

Vídeo: Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, um método para montagem de larva drosophila para imagem de lapso de tempo de longo prazo

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...