Agradecemos Philipp Denninger para obter ajuda com o vídeo de preparação e Chaudhuri Bhavna para fornecer linhas de plantas que expressam FRET sensores. Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation (MCB 1021677), o Departamento de Energia (DE-FG02-04ER15542) a WBF, o National Institutes of Health e do Howard Hughes Medical Institute para SRQGG foi apoiada por um longo EMBO prazo comunhão. MM foi apoiado pela Fundação Alexander von Humboldt.

Nota: Execute todas as etapas etapas preparatórias em condições estéreis. 1. Preparação de Cones de plástico para germinação de sementes <ol><li> Encha de 10 cm de placa de Petri com meio de crescimento contendo agar a 1% para uma espessura de 5 mm. Usamos uma força meia modificado Hoagland meio 4, mas a composição do meio deve ser escolhida para se adequar individuais requisitos experimentais. </li><li> Enquanto o meio é ainda líquido, utilizar uma pipeta multi-canal 10 para encher as pontas das pipetas uL com 5 uL de meio a partir da placa de Petri. </li><li> Armazenar as pontas cheias na caixa de ponta de pipeta até que o meio é sólido, então cortada para 4 mm de comprimento e cones de plástico colocado em pé em uma placa de Petri contendo meio de crescimento sólido. </li></ol> 2. Germinação e crescimento de mudas <ol><li> Tona esterilizar sementes em NaOCl a 5% durante 5 min, lavar três vezes com água estéril, em seguida, colocar uma única semente no topo de cada um dos cone meio-cheias. </li><li> Selar a placa com fita micropore (3M) e armazenar a 4 ° C para sincronizar a germinação. </li><li> Após três dias, transferir as placas a uma câmara de crescimento para iniciar a germinação. As nossas condições de crescimento são a 23 ° C com um ciclo de light/8h 16h alta escuro (intensidade de luz: 100 μE m -2 s -1). </li><li> Entre 5 e 7 dias após a germinação, as mudas devem estar prontas para a transferência para o RootChip. Neste momento, pontas de raiz deve estar próximo das saídas inferiores dos cones de plástico. Verifique a saúde de plântulas, comprimento da raiz e, se for o caso, a expressão de um marcador fluorescente sob um microscópio de dissecação. </li><li> Marcar mudas individuais para transferência para o chip. Seleccione dez ou menos no caso de um plântulas é danificada durante a transferência. </li></ol> 3. Transferência de Mudas para a RootChip <ol><li> Para esterilizar o RootChip para experimentos de longa duração, embrulheo dispositivo em papel de seda, lugar numa placa de Petri de vidro, e autoclave. </li><li> Uma vez que o RootChip esfriar, cubra-o com meio de crescimento líquido. O RootChip deve ser completamente imerso, mas o nível do fluido deve ser não mais do que 3 mm acima da superfície RootChip. </li><li> Com uma pipeta 20 uL, puxe médio através da entrada de raiz e saída da câmara para encher a câmara de observação com meio. </li><li> Cones de plástico plug selecionado no passo 2,5 para as entradas RootChip. Os cones deve caber nas entradas. Uma vez que o RootChip é montado sobre uma fina camada de vidro óptico, não se aplicam demasiada pressão para o chip. </li><li> Incubar a RootChip durante a noite em meio líquido. Para evitar flutuante, coloque duas lâminas de vidro para o chip. Adicionar uma barra de agitação magnética e fechar o prato. </li><li> Transferir a montagem de um agitador magnético e agitar suavemente o meio. </li><li> O entradas RootChip de intersecção dos canais a um ângulo de 30 ° para o dispositivo normal para facilitate crescimento da raiz para os canais (Figura 1A). Para apoiar ainda mais o crescimento na direcção desejada, inclinar ligeiramente o conjunto colocando uma lâmina de vidro sob a placa de Petri sobre o lado da frente das saídas de chip. </li><li> Para manter o ciclo de luz / escuro, iluminar as plântulas com uma lâmpada de anel (intensidade de luz: 100 μE m -2 s -1) ligado a um temporizador. </li></ol> 4. Ligar o RootChip ao Transportador <ol><li> No dia seguinte, encher um frasco, selável pressurizable com meio de crescimento líquido (Figura 1B). </li><li> Inverta a transportadora chip e colocá-lo sobre uma superfície estável. Remover o RootChip a partir do meio líquido e inseri-lo lado PDMS para baixo para dentro da abertura inferior do transportador chip. Orientar o chip de modo que o lado que contém as entradas da camada de controlo está virada para o lado da pressão de conectores de linha de tubagem na parede lateral transportador. </li><li> Seca-se a tampa de vidro noinferior do chip suavemente por blotting com papel de seda. Fixe a RootChip à transportadora com fita adesiva e direito a congregação inteira. </li><li> Conectores da tubulação são feitas por cortar tubos microboro plástico flexível (TYGON, 0,20 &quot;ID x 0,060&quot; OD) em 5 centímetros de comprimento e conectá-los ao aço inoxidável microboro tubos (New England Tubo Pequeno, 0,025 &quot;OD x 0,013&quot; ID x 0,75 &quot; de comprimento). Encha os conectores de tubos com água utilizando uma seringa e ficha cada ligador de tubagem para dentro da entrada correspondente de controle da camada no chip. A água será mais tarde preencher os canais camada de controle e ser usado para transmitir a pressão para as válvulas micromecânicos. </li><li> Ligar as extremidades opostas das linhas em mídia / frasco de solução (s). Aplicar pressão para o frasco de solução com uma seringa de ar. A pressão de ar aumentada dentro do frasco solução irá forçar o líquido para as linhas. </li></ol> 5. Montagem do RootChip ao microscópio <ol><li> Coloque a transportadora para a Microscfase ope. Para reduzir a possibilidade de o conjunto deslocando sobre o decurso da experiência, devido a vibrações na sala, o transportador deve encaixam perfeitamente os entalhes do inserto fase. </li><li> As válvulas de chip e do fluxo de meio através do chip são controlados por pressão de ar. Duas linhas com os reguladores são ramificadas fora de uma linha de pressão principal - um é utilizado para controlar o fluxo médio através dos canais, eo outro está ligado a válvulas de solenóide de ar que accionar os válvulas push-up da camada de controlo. As válvulas solenóides são operados a partir do computador através da válvula controladora USB (desenvolvido por Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Feche ambos os reguladores de pressão antes de ligar o chip. </li><li> Adicionar alguns mililitros de água para os reservatórios do veículo para manter a umidade alta dentro do conjunto. Esta etapa deve ser repetida ao longo do curso dos experimentos mais longos para manter as plantas sequem. Mantenha o volume baixo para minimizar tele quantidade de líquido que pode ser derramado sobre o microscópio. Para experimentos de longa duração, a saída das tomadas de chips pode ser guiado para os reservatórios da transportadora, ligando os pontos de venda de chips para os reservatórios com microboro tubulação (veja o passo 4.4). Alternativamente, o fluxo de saída que se acumula na superfície do chip pode ser recolhido por pipetagem. </li><li> Prepare folhas quadrados de plástico transparente de protetores da folha (C-Line). Fixe o plástico transparente para o transportador por fita dupla face para manter a umidade elevada na montagem. </li><li> Posicione o anel de luz sobre o chip e manter o ciclo de claro / escuro. A luz anel deve ser desligado antes do início de cada experiência que utiliza marcadores fluorescentes, como a iluminação directa irá interferir com a recolha de imagem. </li></ol> 6. Operação do RootChip usando a Interface LabView A interface do controlador RootChip para a plataforma de software LabVIEW podeser baixado do nosso site <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> As válvulas no chip são fechados por aplicação de pressão para a camada de controlo, neste caso, abrindo as válvulas de ar de solenóide. A interface do controlador permite acionamento das válvulas, clicando no botão abaixo do número da válvula. Verde brilhante indica aplicação de pressão e de fecho de uma válvula de chip (Figura 2B). Ative todas as três válvulas de entrada solução na interface do controlador antes de abrir os reguladores de pressão. Nota: A interface controlador dispõe de um ciclo de feedback, que permite a monitorização do estado do sistema. Esse recurso pode ser ativado clicando no botão &quot;cotejamento&quot; na interface do controlador. </li><li> Abra o regulador de pressão para a camada de controle e, inicialmente definido para 15 psi, em seguida, abra o regulador para a camada de fluxo e, inicialmente definido para 5 psi. DepenDing sobre a taxa de fluxo desejada, as pressões podem ser ajustada mais tarde. </li><li> Abra a válvula de entrada para o meio de crescimento de escolha para lavar as câmaras com o meio. </li><li> Verificar caminhos de fluxo sob o microscópio. Tipicamente, o ar é retido nos canais de fluxo e deve ser removido. Além disso, os canais de a camada de controle ainda conter ar que deve ser forçado para fora e substituído por a água dos conectores tubo (sem saída enchimento). Ambas as tarefas são alcançados através de lavagem cada uma das oito câmaras várias vezes (5 psi) até que todo o ar é forçado a partir dos canais para a PDMS (&quot;desgaseificação&quot;). Nota: O controlador interface pode ser programado para automatizar experimentos. Tais rotinas podem também ser utilizados para desgaseificar o chip. </li></ol> 7. Os resultados representativos O objectivo principal da RootChip é combinar uma plataforma de imagem e um sistema de perfusão em um único dispositivo com um elevado nível de integração. Para demonstrar a manipulaçãodo microambiente das raízes que corou as câmaras com corante alimentar escuro (1:4 diluição em meio hidropônico) e medida a troca de fluido no interior das câmaras. À pressão recomendada de 5 psi, medimos a uma troca completa dentro de 10 segundos, a uma taxa de fluxo calculado de aproximadamente 1,5 uL / min (Figura 3). Observou-se também o crescimento das raízes das plântulas, neste caso cultivadas no escuro e fornecido com 10 mM de glucose como fonte de energia externa (Figura 4). Dependendo das condições de crescimento, tais como luz e composição do meio, as plantas podem ser observados no RootChip por até três dias. O RootChip tem sido utilizado para monitorizar a glucose intracelular e os níveis de galactose em raízes que expressam nanosensores codificados geneticamente, com base no Förster Transferência de Energia de Ressonância (FRET) 5-7. Raízes no chip foram perfundidos com pulsos quadrados de glucose ou galactose solução ( <strong&gt; Figura 5). Os níveis intracelulares de açúcares foram monitorizados e são mostrados aqui expresso como uma razão entre a intensidade do Citrino fluoróforo aceitador para a intensidade da ECFP doador. O aumento da proporção indica acumulação de açúcar. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Princípio RootChip. <ol class="ualpha"><li> O RootChip apresenta oito câmaras de observação para o crescimento e de imagem de raízes. As primeiras sementes germinam em cones de plástico - fabricado a partir de pontas de pipeta de plástico - que são preenchidos com meio sólido. A ponta de raiz cresce através do meio e atinge a câmara onde um fluxo contínuo de meio líquido mantém as condições na câmara constante. Válvulas micromecânica (vermelho) controlar o fluxo. O chip é montado sobre uma tampa de vidro óptico. Desenho sem escala. (Adaptado com permissão de Grossmann et al., 2011 Plant Cell.) </li><li> Scheme de um frasco de solução pressurizable com diafragma (vermelho). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Ligar e montagem do RootChip. <ol class="ualpha"><li> Vista de cima da RootChip totalmente conectado e transportadora montada em um microscópio invertido. </li><li> Esquema ilustrando o sistema de válvulas e do controlador de interface. Um exemplo para uma válvula de fixação para guiar o fluxo de fluido para uma única câmara é mostrado. Embora as válvulas de 4 a 8 actuam como válvulas, válvulas individuais de 0 a 3 ato em grupos. Com este sistema de uma câmara de indivíduo pode ser tratada através da activação de uma combinação de válvulas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Troca de soluções no ch observaçãoambers. visualização da troca de fluido em uma câmara de observação utilizando uma solução de corante. A imagem é uma sobreposição de campo brilhante e falsa cor-de-intensidade do sinal de coloração. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. No chip crescimento das raízes. A observação de uma única raiz crescente expressando uma fluorescente FRET nanosensor para a glucose / galactose ao longo de 20 h. Formato da hora: hh: mm; barra de escala: 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> Figura 5. Medindo os níveis de açúcar intracelulares usando FRET nanosensores. <ol class="ualpha"><li> A quantidade de sensor é mostrado como citrino intensidade dentro da extremidade da raiz (à esquerda). A resposta do intracelular FRET nanosensor para a aplicação de glucose ou galactose solução é mostrado como imagens raciométrica. (Adaptado com permissão de Grossmann et al., 2011 Plant Cell) Barra de escala:. 100 mm. </li><li> Rastreio FRET relação muda em resposta a três pulsos repetidos quadrados de glucose (verde) e galactose (vermelho). </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As principais vantagens do RootChip sobre os métodos de crescimento convencionais são a preparação minimamente invasiva para a microscopia, a capacidade de reversivelmente e repetidamente alterar o ambiente de raiz, e da capacidade de observação contínua de tecido developmentally competente e fisiologicamente saudável durante um período de vários dias. Anteriormente, as plantas foram cultivadas em meios gelificados verticalmente e transferidos para um sistema de perfusão imediatamente antes da experiência, o que permitiu medir apenas raízes de cada vez 8. Ferramentas microfluídicos têm sido utilizados para Arabidopsis, mas a um nível baixo de integração 9 ou sem controlo de perfusão 10. O RootChip combina um alto nível de integração com a capacidade de automatizar experimentos através de orientação de fluxo preciso. Outra vantagem desta plataforma, característica de todos os dispositivos microfluídicos 11, é que apenas quantidades mínimas de líquido são necessárias para fornecer a raiz com a porca necessáriorients, mesmo para experimentos que abrangem vários dias. O RootChip está concebido como um dispositivo de uso único, mas desde que os custos de produção de chips estão baixos, as pequenas quantidades de reagentes consumidos faz o chip ainda é muito rentável. Existem alguns passos críticos que devem ser tomadas para garantir a saúde das mudas: O volume nos cones de plástico é apenas uL 3-4, que vai começar a secar quando exposta ao ar. Por isso, é crítico que os cones são transferidos para o chip de forma rápida e de humidade é mantida elevada até que as raízes tenham atingido as câmaras de observação, o que irá fornecer-lhes água suficiente. Passos 4.2 para 4.5 deve ser realizada rapidamente e sem interrupção para evitar o ressecamento das mudas. Passos de 3,5 - 3,8 descrever a incubação do chip em meios líquidos durante o qual as raízes crescem para dentro das câmaras de observação. Este passo pode ser ignorada pela montagem do chip no carrier imediatamente e iniciando a perfusão constante com meio de crescimento. No entanto, é recomendável imersão em meio de crescimento durante a noite, uma vez que tem algumas vantagens: 1) cria um ambiente húmido de modo as plântulas são menos provável que se torne dessecado à medida que crescem para dentro da câmara de observação, 2), o chip é embebido em líquido, de modo desgaseificação (passo 6,4) será mais rápido. É importante a utilização de meios de comunicação com baixas concentrações de soluto. As soluções mais concentradas podem precipitar e entupir os canais, especialmente se o chip é usado em vários dias. Uma vez que o dispositivo está conectado à linha de pressão de ar, o fluxo de meio é controlado alterando a pressão hidráulica nas válvulas. Para garantir o correcto encerramento das válvulas micromecânicos, é importante escolher uma pressão de comando que é cerca de três vezes maior do que a pressão de fluxo. A pressão de fluxo não deve exceder 15 psi como o fluido vai ser empurrado para fora das entradas de raiz. Altas pressões may também causar delaminação do chip, o que torna o inutilizável chip. Uma limitação do RootChip é que o PDMS é porosa e hidrofóbico. Enquanto o material é praticamente inerte a soluções aquosas, que podem absorver compostos orgânicos 12. Isso pode interferir com uma troca rápida de soluções como compostos orgânicos podem vazar a partir do material, mesmo quando o fornecimento deste composto foi parado na entrada. Devido à porosidade, a utilização de solventes orgânicos podem causar inchaço do PDMS 12. Continuamos a optimizar a RootChip e alargar a sua utilidade, por exemplo, com raízes de plantas de cultivo. Acreditamos que melhorando o acesso à raiz para o tratamento e observação, ferramentas microfluídicos como a RootChip vai abrir novas dimensões de pesquisa raiz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Itens </td><td> Fonte </td><td> Informações </td></tr><tr><td> Chip transportadora, software e outras informações. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> CAD e CNC arquivos para a fabricação transportadora, software controlador e mais informações estão disponíveis para download no site da <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS</a> Portadores também podem ser encomendados a partir deste site. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Fundição </td><td> Máscara projetos e protocolos de fabricação estão disponíveis mediante solicitação. Ready-to-use RootChips pode ser encomendado a partir de <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Controlador de Chip </td><td> -Home built-</td><td> O sistema controlador automático de válvula foi originalmente desenvolvido por Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab. Uma instrução detalhada de como construir o seu próprio controlador de válvula atuada pode ser encontrada em <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

As funções de raiz como a âncora físico da planta e é o órgão responsável pela captação de água e nutrientes minerais, como nitrogênio, fósforo, sulfato e oligo-elementos que as plantas adquirem a partir do solo. Se queremos desenvolver abordagens sustentáveis ​​para a produção de alta produtividade da cultura, nós precisamos entender melhor como a raiz se desenvolve, ocupa um amplo espectro de nutrientes, e interage com organismos simbiontes e patogênicos. Para alcançar esses objetivos, precisamos ser capazes de explorar as raízes em detalhes microscópicos ao longo de períodos que variam de minutos a dias. Nós desenvolvemos o RootChip, um polidimetilsiloxano (PDMS) - dispositivo micro based, o que nos permite crescer e raízes de imagem de mudas de Arabidopsis, evitando qualquer esforço físico às raízes durante a preparação para a imagem 1 (Figura 1). O dispositivo contém uma estrutura de canal bifurcada com válvulas micromecânicos para guiar o fluxo do fluidoa partir de entradas de solução para cada um dos oito câmaras de observação 2. Este sistema de perfusão permite que o microambiente de raiz para ser controlado e modificado com precisão e rapidez. O volume das câmaras é de aproximadamente 400 nl, exigindo assim apenas quantidades mínimas de solução de teste. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o estudo da biologia raiz no RootChip utilizando imagens baseadas em abordagens com a resolução em tempo real. Raízes pode ser analisada ao longo de vários dias usando microscopia lapso de tempo. Raízes podem ser perfundidos com soluções nutritivas ou inibidores, e até oito plântulas podem ser analisados ​​em paralelo. Este sistema tem o potencial para uma vasta gama de aplicações, incluindo a análise do crescimento das raízes na presença ou ausência de produtos químicos, de fluorescência baseada em análise da expressão do gene, ea análise de biossensores, por exemplo, FRET nanosensores 3.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip at JoVE.com

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.

Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.5K visualizações.  Carnegie Institution for Science. Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.

Vídeo: Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

Demonstrar os usos do Spectrometer Novel Força Gravitacional para esticar e Medida Proteínas fibrosas

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Bioengenharia

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

Correção Deriva de exemplo a seguir 4D confocal tempo-lapso

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Replicação biomimética da microestrutura da superfície raiz usando alteração da litografia macia

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imagem de fluxo sanguíneo com Doppler Ultrarrápido

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...