Name: live confocal imaging of developing arabidopsis flowers
Uploaded: 2017-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

O autor gostaria de agradecer a Prof. Elliot M. Meyerowitz por seu apoio e comentários sobre o manuscrito, assim como Ann Lavanway no Dartmouth College e Dr. Andres Collazo no Facility Imagem Biológica em Caltech por sua ajuda na resolução de problemas técnicos com o imagem confocal ao vivo. O trabalho de Nathanaël Prunet é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, através Grant R01 GM104244 para Elliot M. Meyerowitz.

1. Mídia e pratos de preparação <ol><li> Prepare dissecando pratos preenchendo caixas rodada de plástico (aproximadamente 6 cm de largura, 2 cm de profundidade) de 0,5 cm de altura com 2% de agarose. </li><li> Prepare imagiologia pratos. <ol><li> Para um microscópio confocal vertical, encher plástico rectangular articulada caixas (cerca de 7 cm de comprimento, 4,5 cm de largura, 3 cm de profundidade) de 0,5 cm com meio de imagem (ver secção 1.3, &quot;meio de imagem&quot;; Figura 1F). </li><li> Para um microscópio confocal invertido: encher pequena placa de Petri (aproximadamente 3,5 cm de largura, 1 cm de profundidade) exactamente até a borda com meio de imagem (ver secção 1.3, &quot;meio de imagem&quot;; Figura 1G). </li></ol></li><li> Prepare meio de imagem. <ol><li> Para imagem de ponto único, usar 1% de agarose. </li><li> Para as experiências de lapso de tempo, utilizar meio de crescimento vértice (0,5 x Murashige e Skoog mistura de sal basal sem vitamina, 1% de sacarose, 0,8% de agarose, pH 5,8 com hidróxido de potássioe solução, suplementado com vitamina [0,01% de mio-inositol, 0,0001% de ácido nicotínico, 0,0001% de cloridrato de piridoxina, cloridrato de tiamina 0,001%, 0,0002% de glicina] e citocinina [500 nM N6-benziladenina]) 15. </li></ol></li></ol> 2. Crescimento de Plantas <ol><li> Semear as sementes esterilizadas em placas MS (0,5 ou mistura de sais basais de Murashige e Skoog 1x sem vitamina, 0,8% de ágar, pH 5,8 com solução de hidróxido de potássio) com uma selecção apropriada. placas lugar no dia longo (16 horas de luz) ou contínuo dia, 16-22 ° C Condições para duas semanas. </li><li> O transplante das plântulas em solo com espaçamento suficiente para permitir o desenvolvimento robusto. Coloque plantas em dia curto, 16-22 ° C Condições de três semanas. NOTA: O cultivo de plantas em dia longo ou condições de dia contínua directamente após o transplante resulta na floração precoce e inflorescências que são menos vigorosa, e muito mais difícil de dissecar. Da mesma forma, deixando plantas sob curto Condit diaiões para mais do que três semanas resulta em dia floração independente de comprimento e inflorescências que são menos vigorosa. </li><li> Transferir as plantas para o dia longo (16 horas de luz) ou contínuo dia, 16-22 ° C Condições até florirem. ápices são mais fáceis de dissecar quando a inflorescência é 2-10 cm de comprimento. </li></ol> 3. Dissecção do rebento Apex <ol><li> Opcional: Usando uma pedra de afiar fina e uma gota de óleo leve, aguçar a fórceps sob o microscópio estereoscópico para torná-los blade-like, não apontar-like. </li><li> Remover siliques, botões de flores mais velhas e inflorescências secundárias da inflorescência principal empurrando a base dos pedúnculos com a pinça até quebrar. Remover como muitas flores quanto possível sem ampliação (figura 1, comparar A e B). </li><li> Usando fórceps, perfure um furo vertical na agarose de um prato de dissecação, cortados nos últimos 0,5 cm da inflorescência e colocá-lo na vertical, em que a agarose. O restantebotões de flores deve ser acima da superfície da agarose. </li><li> Encha o prato de imagem com estéril, água deionizada para que o ápice shoot está totalmente imerso. Colocar o prato de dissecação, ao microscópio estereoscópico, e remover o ar aprisionado em torno do vértice filmagem, criando jactos de água com uma pipeta de 1000? L (Figura 1, comparar C e D). </li><li> Sob o microscópio estereoscópico, usar os fórceps para remover botões de flores que não está a ser trabalhada, empurrando a base do pedúnculo ou a parte superior da gema até à ruptura do pedúnculo (Figura 1E). É importante que os pedúnculos quebrar limpa na junção com a haste, como pedúnculos sobra dificultar a remoção dos jovens botões florais. </li><li> Se imagiologia apenas botões de flores de fase 5 e mais jovens (Figura 2A), remover a água antes dissecando fase 6-8 botões de flores. Se as flores em botão de imagem Fase 5 e mais velhos, proceder à ablação sepal (ver secção 5.1). Caso contrário, proCEED para o passo 3.7. </li><li> Usando fórceps, perfurar um furo vertical na forma de um prato de imagem, e manter a posição vertical ápice dissecados no meio, de modo que apenas o meristema apical e brotos de flores circundantes estão acima da superfície do meio. Dependendo de qual broto (s) flor estão a ser trabalhada, pode ser necessário para inclinar ligeiramente a amostra, tal como botões de flores não estão necessariamente orientadas exactamente como a haste (Figura 2A). </li><li> Avance para manchar a amostra se necessário. Se não coloração e / ou imagem da amostra imediatamente, adicionar água e fechar o prato de imagens para evitar a desidratação. Se estiver usando um microscópio invertido, coloque o prato de imagem em uma caixa de plástico transparente e fechá-lo. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> Figura 1: Preparação dos ápices atirar para imagem confocal ao vivo. (A - E) de uma dissecçãoatirar ápice para a imagem latente. Inflorescência antes (A) e depois (B) a remoção de siliques e flores mais velhas. (C - D) Tiro ápice imerso em água no prato de dissecação, com uma bolha de ar presa na ponta (C) e depois da remoção da bolha de ar (D). (E) Atire ápice no prato de dissecação, após dissecção de botões florais com mais de estágio 5. (F - G) Visão de ápices no prato de imagem, no palco de um microscópio confocal vertical (F) e invertida (G) . Em (F), uma lente de água-imersão 40X está posicionado acima de um dos vértices, com a ponta da lente imerso em água. Em (G), o vértice filmagem é posicionado de cabeça para baixo por cima da lente da água de imersão-40X, com uma coluna de água que liga o meio de imagem para a ponta do cristalino. O painel mais pequeno em (F) mostra uma higsua visão de ampliação da área no retângulo vermelho, com um ápice shoot inserido no meio de imagem; linhas vermelhas e azuis indicam a superfície do meio e água, respectivamente. (H - I), Exemplos de dispositivos feitos por medida, que permitem a adição de mais água na ponta da lente água-imersão: uma manga de borracha de silicone feita a partir de um arranque a vela de ignição (H), e uma manga improvisada feita a partir do dedo de um luva de látex sem pó (G). Barras de escala = 0,5 cm em (A) e (B), de 0,1 cm em (C) e (D), e 100 ^ m em (E). Esta figura foi inicialmente publicada em 14 de referência. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. coloração NOTA: As paredes celulares ou membranas de plasma podem ser coradas com iodeto de propio ou FM4-64, respectivamente, para obter uma resolução celulardurante a imagiologia. Alternativamente, as linhas de repórter com proteínas fluorescentes marcadas para a membrana de plasma pode ser utilizado 6, 16. <ol><li> Remover a água do prato de imagem, e assegurar que a superfície do meio é seco para evitar a diluição do corante. </li><li> Sob o microscópio estereoscópico, aplicam-se 20 a 30 uL de 1 mg / mL solução de iodeto de propídio, ou 80 ug / ml solução FM4-64 para o ápice dissecados com uma pipeta de 10 mL. Certifique-se de toda a amostra está coberto de tinta para garantir uma coloração homogênea. </li><li> Manchar durante 2 minutos, se utilizando iodeto de propio, 20 min ou se utilizando FM4-64. </li><li> Lavar duas vezes com água estéril, desionizada. </li></ol> 5. Sepal Ablação NOTA: No estágio 4, primórdios das sépalas começar cobrindo a FM. À medida que crescem, que filtram a fluorescência a partir de tecido subjacente, e dificultar o processo de imagiologia. Sépalas pode ser removido manualmente utilizando um pino de metal Mounted em um pino-vise, ou impedidos de crescer utilizando ablação a laser no primórdio sépalas emergente. Alternativamente, é possível em alguns casos utilizar mutantes, tais como apetala1-1, em que sépalas estão ausentes ou substituídos por órgãos semelhantes a folhas que não cobrem o FM enquanto a parte central da flor se desenvolve normalmente (Figura 2F) 17. <ol><li> Ablação Sépala em botões de flores fase 5 e mais velhos usando um pino torno segurando uma agulha de metal linear (Figura 2, E1-E2) <ol><li> Coloque o prato de dissecação com o ápice dissecadas sob o microscópio estereoscópico, e definir a ampliação para máximo. Mergulha-se o ápice de rebentos em água estéril, desionizada, ou em alternativa, utilizar uma pipeta de 1000 mL para aplicar água para o ápice filmagem regularmente enquanto dissecando as sépalas. </li><li> Com a extremidade do pino do torno, posicionar o pino na parte superior do sépalas abaxial, tangencialmente em relação ao vértice filmagem. Com cuidado, empurre a sépala longe do ápice shoot até que rompedo botão de flor. </li><li> Proceda da mesma forma com a sépala adaxial, mas empurrar a sépala em direção ao ápice atirar. </li><li> Continuar de modo semelhante com as sépalas laterais, mas a posição do pino radialmente em relação ao vértice da parte aérea, e empurrar os sépalas para o lado, para longe do botão de flor. </li><li> Mergulha-se o ápice de rebentos em água estéril, desionizada durante alguns minutos, para evitar a desidratação. </li></ol></li><li> A ablação de primórdios de sépalas na fase de 3-4 (Figura 2, C5-D5) <ol><li> Colocar a cápsula de imagem com o vértice manchado, dissecado na platina do microscópio confocal. Localize e foco no ápice como se estivesse se preparando para a imagem (ver secção 6, &quot;Configuração de imagem&quot;). </li><li> Utilizando o software de sistema de ablação a laser, definir a zona de ablação, que corresponde à crista e ponta da primórdios sépalas emergente antes de começar a cobrir o meristema flor (tipicamente, na fase 3 para sépalas abaxial e adaxiais, e no fim da fase 3 / cedo fase 4 para se lateraisamigos). </li><li> Definir a potência do laser e tempo de moradia com parâmetros adequados para retirar células suficientes sem infligir muito dano aos tecidos subjacentes. Normalmente, dependendo do sistema de ablação a laser utilizado, os parâmetros apropriados precisa inicialmente ser identificado através de um processo de tentativa e erro para garantir que as células suficientes são removidos para evitar as sépalas para crescer posteriormente sobre o FM, sem afetar o resto da flor bud. Usando muita potência do laser e habitação tempo resulta em danos para o centro da flor, afetando o seu crescimento e / ou sobrevivência. Uma vez que os parâmetros corretos foram identificados, eles podem ser reutilizados para experimentos posteriores. NOTA: Se a ablação inicial revelar insuficiente, é possível proceder a uma segunda ablação nos dias seguintes (figura 2, C4 e D2). </li></ol></li></ol> 6. Configuração de imagem <ol><li> Use um microscópio vertical. <ol&gt; <li> Encher o prato de imagem com os ápices dissecados com água estéril, desionizada de modo a que a superfície do meio é coberto em milímetros de água 2,5-5 (Figura 1F). Completamente mergulhe as amostras. NOTA: Quando imagem com um microscópio vertical, vários ápices pode ser colocado no mesmo prato de imagem. No entanto, se o processo de imagem dura mais do que uma hora, iodeto de propio tende a ser diluído, e algumas amostras pode precisar de re-colorao antes da imagiologia. </li><li> Colocar a cápsula de imagem na platina do microscópio (Figura 1F). Diminuir a lente água-imersão e elevar a mesa de modo que a ponta do cristalino mergulha na água. Proceder com cautela, de modo a não esmagar os ápices dissecados ou mergulhar a lente para o meio de geração de imagens. </li><li> Se uma bolha de ar está preso na ponta da lente, fazer jactos de água com uma pipeta de 1000 mL para removê-lo. </li><li> Sob iluminação de epifluorescência, posição de um dos vértices dissecados no campo da lente usando o con XYtroller. Olhe pelas oculares e focar a amostra usando o controlador Z. Proceder com cautela para não esmagar a amostra. </li><li> Usando o software microscópio confocal, zoom no botão de flor a ser trabalhada, e proceder à imagiologia sua amostra. </li></ol></li><li> Usar um microscópio invertido. <ol><li> Usando uma pipeta de 1000 uL, colocar uma gota de água estéril, desionizada na ponta da lente. </li><li> Segure o prato de imagem de cabeça para baixo, e com uma pipeta de 1000 mL, adicione uma gota de água estéril, deionizada ao ápice dissecado. </li><li> Colocar a cápsula de imagem de cabeça para baixo sobre a platina do microscópio (Figura 1G). Proceder com cautela para não esmagar a amostra. </li><li> Sob iluminação de epifluorescência, posicionar o vértice dissecados sobre a ponta da lente usando o controlador XY. Com o controlador Z, cuidadosamente baixar a fase até a amostra atingir a gota de água na ponta da lente. Uma coluna de água deve formar between a ponta da lente e o meio. </li><li> Se a coluna de água não forma, adicione cuidadosamente uma gota de água para a amostra com uma pipeta de 1000 mL. Adicionar mangas improvisados para a lente, a fim de adicionar mais água, na sua ponta, o que facilita o estabelecimento e manutenção da coluna de água (Figura 1H e 1I). </li><li> Sob iluminação de epifluorescência, olhar pelas oculares e focar a amostra usando o controlador Z. Proceder com cautela para não esmagar a amostra. </li><li> Usando o software microscópio confocal, zoom no botão de flor a ser trabalhada, e prossiga para a imagem da amostra. </li></ol></li><li> Se a realização de experimentos de lapso de tempo, despeje a água para fora do prato de imagem e fechá-lo para evitar a desidratação entre os pontos temporais. Colocar a cápsula de imagens com as amostras no dia longo (16 horas de luz) ou contínuo dia, 16-22 ° C condições. amostras re-mancha antes de cada ponto de tempo. NOTA: Enquanto as células em desenPing órgãos florais pode dividir mais rápido, as células na divisão meristema floral uma ou duas vezes a cada segundo dia, e linhagens celulares são fáceis de controlar com pontos de tempo a cada 24 h. No entanto, se for necessário, é possível para a imagem das amostras a cada seis horas. </li></ol> 7. Considerações sobre os parâmetros de imagem NOTA: Como configurar os parâmetros de imagem depende muito o sistema confocal usado. Abaixo estão sugestões de alguns desses parâmetros que podem ser usados ​​com qualquer microscópio confocal. Para mais considerações sobre os parâmetros de imagem, consulte a seção Discussão e referência 14. <ol><li> Para a resolução XY: use 1.024 x 1.024 para uma boa resolução celular. Como alternativa, use 512 x 512 para reduzir o tempo de imagem, em detrimento da resolução. </li><li> Para a resolução Z: definir o passo de tamanho de 0,5-1,5 | im. Baixando o passo tamanho aumenta a resolução Z, mas também o tempo de imagem. </li><li&gt; Para o pinhole: definir o pinhole para 1-1,5 unidades arejados. Aumentando o furo de pino aumenta a intensidade do sinal, mas também o ruído de planos não prioritários. </li></ol> 8. A visualização de dados confocal <ol><li> Transformar imagens estáticas de pontos no tempo de desenvolvimento da flor em um filme. <ol><li> Abra as imagens fixas (em formato jpeg ou tif) no software (por exemplo, Fiji). </li><li> Vá em Image&gt; Pilhas&gt; Imagens de pilha. As imagens abertas serão agrupadas em uma pilha. </li><li> Se a ordem das imagens na pilha não correspondem à ordem cronológica, usar o plugin Stack Sorter (Plugins&gt; Pilhas&gt; Stack Sorter) para reordená-las. </li><li> Para ligar a pilha em um filme, vá em File&gt; Save As&gt; AVI. </li></ol></li></ol>

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O autor não tem nada a divulgar.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para a imagem de, em desenvolvimento de Arabidopsis botões de flores ao vivo com um microscópio confocal e uma lente de água-dipping. Enquanto isso pode ser feito com qualquer um pé ou um microscópio invertido, é mais fácil e rápido de usar o antigo. É também importante notar que diferentes sistemas confocais variar significativamente em termos de velocidade, sensibilidade, e a capacidade de separar os comprimentos de onda. Os melhores microscópios confocais agora permitir a imagem vários canais diferentes (por exemplo, GFP, YFP, dsRed e iodeto de propidio; Figura 2G) nas mesmas amostras. Alguns microscópios confocal estão equipados com um detector espectral, que pode coletar a fluorescência de diversos fluoróforos simultaneamente e separá-los depois. Ao usar um detector regular, no entanto, um conjunto de lasers e filtros devem ser usados ​​para excitar e separar a fluorescência de fluoróforos diferentes. Alguns fluoróforos têm espectros de emissão totalmente distinta (por exemplo, um PCPd YFP), e podem ser visualizados simultaneamente. Outros fluoróforos têm espectros de emissão de sobreposição parcial (por exemplo, GFP e YFP), e geralmente têm de ser trabalhada separadamente, o que aumenta o tempo de imagiologia. Imagiologia de fluoróforos perto também muitas vezes requer a restrição quanto do espectro é recolhido para cada canal para evitar fluorescência de um fluoróforo a partir de vazando para outro canal. Isto provoca uma perda da intensidade do sinal recolhido, o que pode ser compensado por um aumento da potência do laser e ganho. No entanto, o tempo de imagiologia prolongada e aumentou a potência do laser pode branquear e / ou danificar a amostra. potência do laser aumentado e / ou ganho também pode aumentar o ruído de fundo. Otimização da intensidade do sinal, resolução e tempo de imagem para cada amostra é feito através de um processo de tentativa e erro, e envolve trade-offs permanentes. Este protocolo explica como executar imagem confocal ao vivo de botões florais em desenvolvimento nos flancos de um ápice shoot dissecado. istoPode-se argumentar que o fato de que o ápice shoot não está ligado ao resto da planta e cresce em meio contendo citocininas podem afetar SAM e desenvolvimento da flor. No entanto, este meio foi concebido empiricamente através de um processo de tentativa e erro para garantir a atirar dissecado meristemas apicais produzir novos botões florais no plastocrono normal, e que estes botões florais desenvolver normalmente 15. Da mesma forma, dissecção sepal não parece afetar os padrões de expressão de genes ou o desenvolvimento do resto da flor. Outros protocolos detalhes como realizar imagiologia confocal vivo do SAM ainda ligado ao resto da planta (por exemplo 11 de referência). Tais protocolos poderia ser adaptada para, e oferecer uma alternativa útil para a imagem latente de desenvolver flores, especialmente quando o estudo dos processos relacionados com a citoquinina. Eles apresentam contudo várias desvantagens: os alonga-tronco e torções, e altera a orientação dos botões de flores; umand enquanto a imagem de um ápice shoot ligado ao resto da planta funciona bem com um microscópio vertical, é muito mais complicado fazê-lo com um microscópio invertido. Lentes de imersão tem uma melhor abertura numérica (NA) do que as lentes &quot;seco&quot; (isto é, lentes que são separados da amostra de ar), e, por conseguinte, proporcionar uma resolução mais fina da amostra, o que é crítico quando se utiliza um microscópio confocal. Usando uma lente de água-imersão, assim, fornece uma muito melhor do que uma lente de NA seco, evitando o ápice filmagem de desidratação durante o processo de imagiologia. Enquanto glicerina e lentes de petróleo têm uma NA ainda maior do que as lentes de água, eles requerem o uso de uma lamela, que é muito pouco prático com uma amostra do tamanho de um ápice shoot, que também continua crescendo durante as experiências de lapso de tempo. Dado o tamanho das amostras (de acordo com as fases florais, pilhas pode ser superior a 150 um de espessura), que também é importante usar uma lente com uma distância de trabalho. Normalmente, utilizar uma lente de 20 ou 40X com NA de um e uma distância de trabalho de 1,7-2,5 mm. Software microscópio confocal oferece várias formas de visualizar dados confocal, incluindo reconstruções tridimensionais (Figura 2, B1, B2 e B4) e vistas fatia (Figura 2, B3). Enquanto as vistas tridimensionais mais vulgarmente utilizados são projecções máximos de intensidade de z-pilhas confocal (Figura 2, B1 e B4), alguns de software (por exemplo, ZEN e Imaris) também proporcionam vistas de transparência que filtra o sinal a partir das partes mais profundas de a amostra (Figura 2, B2), o que pode ser útil quando se olha para processos que tomam lugar, ou genes expressos em, a camada epidérmica. A intensidade do sinal pode ser codificada com uma única cor (Figura 2, B1), utilizando pixels intensity, ou utilizando um código de cor (Figura 2, B4). imagem confocal ao vivo não só oferece insights qualitativos valiosas sobre o desenvolvimento da flor, mas também potencialmente fornece os biólogos do desenvolvimento com uma riqueza de dados quantitativos. Software diferente (por exemplo Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permite a quantificação do número ou o volume de células que expressam um ou vários repórteres, ou o nível de expressão de um repórter em células diferentes. Esse software também pode ser usado para realizar segmentação automático de células, rastrear linhagens de células e quantificar o crescimento. Este software diferente oferece ferramentas similares, mas também difere de muitas maneiras. MARS-ALT e MorphoGraphX foram concebidos especificamente para as plantas 15, 20, 21, ao contrário de um Imarisnd Fiji. MorphoGraphX ​​permite apenas a segmentação e análise da camada de epiderme, enquanto Imaris e MARS-ALT permitir a segmentação e análise de toda a amostra. No entanto, MARS-ALT requer a imagem antes de a mesma amostra de três ângulos diferentes 15, e Imaris requer apenas uma única pilha. O acesso à informação quantitativa é fundamental para promover nossa compreensão do desenvolvimento da flor.

A maioria do corpo planta forma pós-embrionariamente de grupos de células-tronco situados na ou perto da ponta - ou meristemas apicais - dos brotos e raízes. Todas as estruturas acima do solo da planta adulta derivar a partir do meristema apical (SAM), o qual produz continuamente órgãos laterais nos flancos: folhas durante a fase vegetativa, e meristemas de flores (FMS), depois ele passa para a fase de reprodução. FMs, por sua vez desenvolver em flores. Enquanto o SAM Arabidopsis produz órgãos laterais, uma de cada vez, num padrão repetitivo, espiral, o FMS produzir quatro tipos de órgãos florais dentro de quatro espirais, de uma maneira parcialmente síncrono, com vários programas de desenvolvimento desvendar simultaneamente. As redes genéticas subjacentes à especificação da identidade dos diferentes órgãos florais foram parcialmente decifrado (para revisões, ver referências 1, 2), mas muitos aspectos da developme flornt, tal como o posicionamento dos órgãos florais e a definição de limites entre giros, permanecem pouco compreendidos. Estudos genéticos moleculares iniciais de desenvolvimento da planta confiou na técnicas tais como hibridação in situ e repórteres de GUS para analisar a expressão do gene. Embora estes métodos têm proporcionado uma riqueza de informações e contribuíram muito para a nossa compreensão do crescimento da planta e desenvolvimento da flor, existem limitações importantes: eles não têm boa resolução celular, não permitir a fácil observação do padrão de múltiplos genes expressão na mesma amostras, e mais importante, apenas pode ser aplicado a tecidos mortos, fixos. Recentes avanços em microscopia confocal têm superar essas limitações, e fornecer os biólogos do desenvolvimento com uma ferramenta poderosa para investigar os processos de morfogênese planta subjacente. Em particular, a microscopia confocal permite a observação de tecidos vivos e órgãos ao longo da sua formação, que é critical para compreender plenamente um processo essencialmente dinâmico, como o desenvolvimento. Imagem confocal vivo tem sido extensivamente utilizado para analisar o crescimento aéreo de plantas e a produção de órgãos laterais pelo SAM (por exemplo referências 3, 4, 5, 6), mas com a excepção de alguns relatórios (por exemplo, as referências 7, 8, 9, 10), ele não tem sido amplamente aplicada para o estudo de desenvolvimento da flor. Protocolos para imagem confocal ao vivo do SAM estão disponíveis (por exemplo, faz referência 11, 12), e fornecer uma boa base para a representação do botões florais em desenvolvimento que cercam o SAM. No entanto, botões florais de imagem apresenta desafios específicos: por exemplo,botões de flores rapidamente tornar-se maior do que o SAM, e a fase 4, sépalas começar a cobrir os (FM fases como descrito na referência 13), e escurecimento da fluorescência a partir de tecidos subjacentes (Figura 2A). Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado explicando como realizar imagem confocal ao vivo no desenvolvimento de botões florais de Arabidopsis usando uma posição vertical ou um microscópio invertido e uma lente de água-dipping. Nós publicado anteriormente este protocolo em referência 14.

<table><tbody><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>80 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Straight Stainless Steel Needles&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-50</td><td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Round plastic boxes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64332</td><td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td></tr><tr><td>Rectangular hinged boxes</td><td>Durphy Packaging Co.&amp;nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>transparent, 2-7/8&amp;rdquo; long, 2&amp;rdquo; wide, 1-1/4&amp;rdquo; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td></tr><tr><td>P10 and P1000 pipettes&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>with corresponding filter tips</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>with an 80-90X maximum magnification</td></tr><tr><td>Laser ablation system</td><td></td><td></td><td>for sepal ablation</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 or 40X water-dipping lens</td><td></td><td></td><td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog basic salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>without vitamins</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>N6-Benzyladenine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, a cytokinin</td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>dilute in water to 80&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL, to stain the plasma membranes</td></tr></tbody></table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

O estudo do crescimento e desenvolvimento das plantas foi confiado por muito tempo em técnicas experimentais utilizando, tecidos fixados mortas e sem resolução celular adequada. Recentes avanços em microscopia confocal, combinados com o desenvolvimento de vários fluoróforos, têm superar esses problemas e abriu a possibilidade de estudar a expressão de vários genes simultaneamente, com uma boa resolução celular, em amostras vivas. imagem confocal ao vivo fornece biólogos de plantas com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento, e tem sido amplamente utilizada para estudar o crescimento das raízes ea formação de órgãos laterais nos flancos do meristema apical atirar. No entanto, ele não tem sido amplamente aplicada ao estudo de desenvolvimento da flor, em parte devido aos desafios que são específicos para imagiologia flores, como as sépalas que crescem sobre o meristema flor, e filtrar a fluorescência dos tecidos subjacentes. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para executar imagem confocal ao vivo em directo, desenvolvendo árabeidopsis botões de flores, utilizando quer uma posição vertical ou um microscópio invertido.

A Figura 2 apresenta vistas de diferentes confocal Z-pilhas de botões de flores de Arabidopsis vivas que expressam diferentes genes repórter fluorescentes, e coradas com iodeto de propídio (Figura 2, A-C5 e G) ou FM4-64 (Figura 2, E1-F) para fornecer uma resolução celular clara. A maioria dos sistemas confocais para permitir a imagiologia de dois fluororos com não-sobreposição espectros de emissão, tais como GFP ou YFP em conjunto com qualquer um iodeto de propio ou FM4-64 (Figura 2A - 2F). Os melhores sistemas confocais também são capazes de separar vários fluoróforos com espectros de emissão que se sobrepõem parcialmente nas mesmas amostras, tais como GFP e YFP, e dsRed e iodeto de propio (Figura 2G). Três exemplos de experiências de lapso de tempo são apresentados na Figura2 e mostram botões de flores em desenvolvimento normalmente após a ablação sépalas foi realizada quer com um sistema de ablação por laser (Figura 2, C1-C5 e D1-D5) ou manualmente com um pino do torno e um pino de metal (Figura 2, E1-E2). Note-se que o botão da flor mostrado na Figura 2, E1-E2 é a partir de uma planta mutante super-homem-1, que é por isso primórdios carpelo não são observados no centro da gema na etapa 7. A ablação por laser de emergente primórdios sépalas do botão de flor mostrado na Figura 2, C1-C5 impede-os de que cobre o modo FM, que ainda pode ser trabalhada no estádio 5 (Figura 2, C5). Por outro lado, no caso do botão de flor mostrado na Figura 2, D1-D5, ablação por laser só atrasou o crescimento sépalas, mas sépalas eventualmente cresceu para cobrir a maior parte da fase de FM por 5 (Figura 2, D5 </strong&gt;). Pelo contrário, se demasiado poder do laser e habitação tempo é usado durante a ablação a laser, os danos se espalha para a parte central da flor e afeta o seu crescimento e, por vezes, resulta na morte subsequente de todo o botão de flor. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> Figura 2: Visualização de confocal Z-pilhas de botões de flores ao vivo. A e B2 são vistas de transparência; B1 e B4-G são projecções de intensidade máxima; B3 é uma vista em corte ortogonal. (A - E2) flores que expressam um repórter Vénus para o gene APETALA3 (verde); paredes das células foram coradas com iodeto de propio (vermelho, excepto para B4, verde). (A) A inflorescência; números indicam estágios florais; sépalas, na fase 4 e 5 flores filtrar a fluorescência do repórter Vénus, que normalmente forms um anel. Note-se que alguns botões florais aparecem inclinado em comparação com a inflorescência. (B1 - B4) Quatro vistas diferentes do mesmo confocal Z-pilha de um botão de fase 5 flor: projecções de intensidade máxima (B1 e B4) com uma intensidade de sinal Vénus codificada com intensidade de pixel na cor verde (B1) ou com o código de cor fogo (B4; código de cor é mostrada na parte inferior do painel); vista transparência (B2) e vista fatia ortogonal (B3; a orientação XY, XZ e YZ das fatias é indicada no painel). (C1 - C5) 4-dia com intervalo de tempo de um botão de flor individual a partir estados 3 e 5; ablação por laser (marcados como traços brancos) realizada no dia 1 e no dia 3 foram suficientes para impedir que os sépalas de cobrir o centro do botão de flor na etapa 5. (D1 - D5) 4-dia com intervalo de tempo de um botão de flor do indivíduo etapa3 a fase 5; ablação por laser registo realizados no dia 1, 2 e 3 eram insuficientes para impedir que as sépalas de cobrir o centro do botão de flor. (E1 - E2) botão de flor individual após a remoção manual da abaxial e sépalas adaxiais (E1), e de todos os sépalas (E2); setas brancas indicam sépalas restantes; asteriscos brancas indicam cicatrizes resultantes da remoção das sépalas. (F) fase 7 flor apetala1-1 que expressa um repórter DR5-3xVenusN7 18 (verde); membranas de plasma foram coradas com FM4-64 (vermelho); setas azuis indicam as estruturas de folha-like que substituem sépalas e não cobrem o botão de flor. (L) Fase 4 botão de flor que expressa um repórter GFP fluorescente para Dornröschen-COMO 7 (verde), um repórter para Vénus SUPERMAN (vermelho) e um repórter para dsRed CLAVATA3 19 (ciano); célulasparedes foram coradas com iodeto de propídio (cinzento). d: dias; r: fase. Barras de escala = 25? m; escala é idêntico em B1, B2 e B4, em C1-C5 e D1-D5, em. Esta figura foi modificado a partir de referência 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

imagem confocal ao vivo fornece biólogos com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a imagem confocal ao vivo de desenvolver flores Arabidopsis.

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K visualizações.  California Institute of Technology.  imagem confocal ao vivo fornece biólogos com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a imagem confocal ao vivo de desenvolver flores Arabidopsis. 

Vídeo: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Genética

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Biologia do Desenvolvimento

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Um método simples para criação de imagens Arabidopsis Folhas Usando Perfluorodecalin como um meio de imagem infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biologia

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Medindo espacial e temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em Arabidopsis Plantas

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

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