Este trabalho foi financiado (em parte) pela ciência ISRAEL FUNDAÇÃO (Grant 399/11), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) no âmbito do Projeto de Cooperação O alemão-israelense (DIP), e pelo Instituto da Família Rappaport de Investigação em de Ciências Médicas.

1. Geração de linhas celulares indutíveis <ol><li> Antes da experiência é necessário para obter a concentração mínima do fármaco G418 que mata todas as células utilizadas para a preparação das linhas de células desejados. Para este efeito, a placa de células de escolha em várias placas em duplicado a 70% de confluência no meio que será utilizado durante a experiência e adicionar concentrações crescentes de G418 (0-1.000 mg por ml). Monitorizar as células diários para determinar a concentração mínima G418 que mata as células de forma eficiente. A morte celular foi observada dentro de 3-7 dias. </li><li> Antes de geração de linhas de células, é recomendado verificar através de ensaios de transfecção transiente de que o plasmídeo que expressa o shRNA podem reduzir em certa medida a expressão do gene em estudo. Isto pode ser feito em qualquer linha de células que podem ser transfectadas de forma eficiente. </li><li> Placa T-REx-293 células a uma densidade de cerca de 5x10 6 células por placa de 10 cm em 8 ml de meio DMEM (contendo 10% de Tet syhaste aprovado FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades por ml de penicilina e 0,1 mg por ml de estreptomicina, 5 ug por ml de blasticidina). Incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> No dia seguinte, o meio de mudar a 8 ml de meio fresco antes da transfecção. </li><li> Transfectar as células, utilizando 10 ug de plasmídeo pSuperior.neo + GFP (Figura 1) que codifica Acf1 ou shRNA SNF2h conduzido por um promotor induzível por tetraciclina H1, bem como o gene de resistência à neomicina fundido a GFP e conduzido por um promotor PGK constitutiva. Adicionar o DNA de 500 ul de 150 mM de NaCl. Adicionar o reagente de jetPIE a outra aliquota de 500 ul de 150 mM de NaCl a 2 ul por ug de ADN. Adicionar a solução jetPIE ao DNA e misturar bem em vórtice. Incubar durante 15 min à temperatura ambiente. Pipetar suavemente complexos de ADN para as placas de 10 cm, contendo 70-80% de células confluentes. Regressar as placas ao incubador. </li><li> No dia seguinte, substituir o meio com um meio selectivo (meio DMEM comodescrito acima, contendo um adicional de 500 ug por ml de G418). </li><li> Para as duas semanas seguintes monitorizar as células e substituir o meio selectivo com um produto semelhante fresco a cada 3-4 dias até as colónias aparecem e podem ser visualizados sem um microscópio. </li><li> Antes do isolamento de colónias, preparar placas de 24 poços com meio selectivo. </li><li> Identificar colónias por olho, e marca a sua localização na parte inferior da placa utilizando um marcador colorido. Verificar ao microscópio que as colónias são bem separados. </li><li> Na capa estéril, aspirar o meio a partir da placa, com cuidado, lavar com PBS morno e aspirar todo o líquido remanescente bem. Adiciona-se 3 uL de 0,25% de tripsina / EDTA a uma colónia na placa. Pipetar a tripsina repetidamente até que as células de separar e adicione-os a um dos poços da placa de 24 poços. Repetir este para várias outras colónias na placa. </li><li> Cultivar as células a 37 ° C, 5% CO 2, até que preencha a bem. Em seguida, dividir as células derivadascada uma das colónias originais em três poços, cada um em uma placa de 12 poços separada, e incubar durante a noite. </li><li> No dia seguinte, substituir o meio de uma placa com meio contendo 1 ng por ml de doxiciclina a partir de uma solução stock preparada em água bidestilada (1-5 mg por ml). Substituir o meio de uma placa de controlo com meio sem doxiciclina. Incubar as células durante 72 horas a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> As células a partir de uma colheita tratadas e não tratadas um poço de cada clone de células para a preparação de extractos de proteína e análise de Western blot para determinar a eficiência de Acf1 ou knockdown SNF2h. Use anticorpos para Acf1 ou SNF2h bem como anticorpos para alfa-tubulina, que serve como um controlo de carregamento. Usar as células no terceiro poço, não tratada, para a expansão de clones de células seleccionadas na qual além doxiciclina levou a pelo menos 50% de redução no nível da proteína em estudo. Congelar alíquotas destas células em 90% de FBS DMSO, 10% para utilização posterior. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Indução de knockdown e Transfecção <ol><li> As células da placa em que o meio selectivo em placas de 10 cm. Adicionar doxiciclina a 1 ug por ml de meio e incubar as placas a 37 ° C, 5% CO 2 durante 48-72 h (ver Figura 4). </li><li> Após 48-72 h, Tripsinizar as células de cada grupo de células, contá-los, e placa de 1.5x10 6 células por placa de 6 cm no mesmo meio, com ou sem doxiciclina. Incubar as células a 37 ° C CO, 5% 2 durante a noite. Plano, de modo que cada grupo de placas de secção 2.1 proporcionará as células por 12 placas de 6 cm, incluindo duas repetições para o ensaio DAPI para cada ponto, bem como uma chapa para a análise de transferência de Western de cada amostra (ver Figura 4). </li><li> No dia seguinte transfectar as células em placas de 6 cm com as seguintes combinações de plasmídeos: 1 | ig de plasmídeo de um vazio ou uma quantidade idêntica de plasmídeo codificando E4orf4, em conjunto com 4 ug de um vectorexpressando Acf1-GFP ou SNF2h-GFP rendido resistente à shRNA nos clones celulares por introdução de mutações silenciosas, ou 3 ng do vector correspondente vazia e 1 | ig de plasmídeo expressando GFP (Figura 4). Utilizar o reagente jetPIE como descrito acima (10 ul por 5 ug de ADN) para preparar a mistura de transfecção. Para cada amostra, preparar uma mistura de transfecção de três placas. </li><li> Após uma incubação de 15 min de ADN com o reagente de jetPIE à temperatura ambiente, suavemente pipetar quantidades iguais dos complexos de DNA a partir de cada mistura de transfecção para três placas de 6 cm e incubadas a 37 ° C CO, 5% 2 durante a noite. </li></ol> 3. DAPI Ensaio em células transfectadas <ol><li> No dia seguinte, extrair proteínas a partir de uma chapa por exemplo por Western blot para determinar se ou Acf1 SNF2h foram eficientemente derrubado e que E4orf4 era expressa igualmente nas diferentes amostras. </li><li> Aspirar o meio das placas destinadas ao DAPIensaio, lava-se as placas cuidadosamente com PBS e adicionar 1 ml de paraformaldeído a 4% em PBS preparado para cobrir as células. Preparação da solução de paraformaldeído e o tratamento das células com este produto químico deve ser efectuada numa câmara de química. Incubar durante 15 min, à temperatura ambiente sem agitação. </li><li> Aspirar o paraformaldeído e lavar três vezes com PBS, agitando à temperatura ambiente durante 5 min de cada vez. Adicionar etanol a 80%, mantida a -20 ° C e incuba-se à temperatura de -20 ° C durante pelo menos 1 hr. As placas podem ser mantidas sob etanol a -20 ° C durante vários dias, enquanto eles estão bem fechadas para evitar a evaporação do etanol e secagem. </li><li> Aspirar o etanol e lavar as células duas vezes com PBS e uma vez com PBS-BT (PBS contendo BSA a 0,5% e 0,05% de Tween-20), agitando à temperatura ambiente durante 5 min de cada vez. </li><li> Para impedir a ligação não específica de anticorpos, bloquear as células em 1 ml de tampão PBS-BT, contendo soro de cabra a 10% durante 20 minutos, enquanto agitando à temperatura ambiente. Em seguida, lave tele as células duas vezes em PBS-BT, 5 min cada lavagem. </li><li> Incubar as células com o anticorpo primário (um anticorpo específico de E4orf4 em nosso caso) em 1 ml de PBS-BT, durante 1 hora enquanto agitando à temperatura ambiente. Em seguida, lavar duas vezes em PBS-BT e uma vez em PBS contendo 0,1% BSA, 5 min cada lavagem. </li><li> Incubar as células em 1 ml de PBS-BSA a 0,1% contendo o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado e 0,5 ug por ml de concentração final de DAPI durante 40 min, enquanto agitando à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, lava-se com PBS durante 5 min, secar bem por aspiração e manter as placas de cabeça para baixo durante uma hora adicional a durante a noite para atingir a secagem completa. Em seguida, montar as lâminas de cobertura sobre as células, utilizando Fluoromount-G solução. Manter as placas a 4 ° C no escuro até estar pronto para contar os núcleos apoptóticos. </li><li> Peça a um colega para identificar as várias placas com números novos, assim contando núcleos apoptóticos nas várias amostras pode ser feito de uma maneira imparcial. </li><li> Visualizar as células sob um umicroscópio fluorescente pright com uma ampliação de 400X (no ar) ou 630X (em óleo de imersão). Identificar células transfectadas que são coradas para as várias proteínas expressas em cada amostra, e contar o número de núcleos de condensação fragmentada ou visualizados por coloração com DAPI dentro da população de células transfectadas. Monitorizar vários campos e contar um total de pelo menos 200 células transfectadas. </li><li> Calcula-se a percentagem de núcleos com morfologia apoptótica no interior da população de células transfectadas. Repita a experiência, com duplicados, de 2-3 vezes para calcular a significância estatística das mudanças entre as diferentes amostras. </li></ol> 4. Resultados representativos A eficiência de obtenção de colónias nos quais knockdown condicional da expressão de genes tem sido bem sucedida é variável, dependendo do gene envolvido. Em nossas mãos, obtivemos sete colônias de sucesso de 12 testados para Acf1 e 6 de 18 para SNF2h. Figura 2 shows uma placa representativa de clones de células seleccionadas (fig. 2A), bem como uma colónia única (Figura 2B). A Figura 3 mostra um blot representativo preparado com proteínas extraídas a partir de células de vários clones cultivados na presença ou ausência de doxiciclina durante 72 h. A membrana foi corada com anticorpos anti-SNF2h e à alfa-tubulina, que serve como um controlo de carregamento. Dois dos clones (número 4 e 5) apresentaram uma forte redução nos níveis de SNF2h sobre indução doxiciclina. Deve-se notar que, embora a GFP + pSuperior.neo plasmídeo (Figura 1) usado para a geração de linhas celulares codifica uma proteína de fusão GFP-neo, a fluorescência verde em linhas de células estáveis ​​foi muito baixa e de expressão de proteínas de fusão com GFP outros introduzido transientemente em estas células podem ser facilmente detectados acima do fundo de fluorescência verde. Uma representação esquemática das experiências efectuadas em clones de células para medirse que o efeito do knockdown SNF2h Acf1 ou E4orf4 em morte celular induzida é mostrada na fig. 4. O tempo necessário para knockdown da expressão do gene por meio de tratamento de doxiciclina pode variar de acordo com a estabilidade da proteína, cujo nível deve ser reduzido. Para Acf1 e SNF2h, um tratamento de 72 horas foi necessária para knockdown eficiente ao nível da proteína. A Figura 5 mostra um exemplo de células que expressam E4orf4 e GFP e submetidos a morte de células manifesta pelo aparecimento de DAPI manchado de núcleos com uma morfologia condensado ou fragmentado. Figura 6 mostra os resultados de uma experiência representativa que demonstra que a doxiciclina induzida knockdown Acf1 levou a um aumento da E4orf4 estimulada a morte celular (Figura 6A). Este aumento não resultou de um aumento da E4orf4 níveis (Figura 6B). Além disso, a restauração da Acf1 para as células induzidas a doxiciclina diminuiu o aumento da E4orf4 toxicidade aos níveis<html> observado em células não induzidas (Fig. 6). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Figura 1. Mapa do plasmídeo + pSuperior.neo GFP. O mapa mostra o promotor induzível por tetraciclina H1 condução shRNA expressão e a expressão do promotor PGK de condução de uma proteína de fusão GFP-neo. O mapa foi adaptado a partir do manual pSuperior OligoEngine. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Figura 2. Identificação de colónias resistentes à neomicina. Imagens de uma placa contendo colónias (A) e de uma única colónia (B) são mostrados. As colónias foram obtidas por cultura das células durante 14 dias num meio selectivo contendo neomicina. ys &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Figura 3. Exame da eficiência knockdown em colónias seleccionadas. Células de várias colónias seleccionadas na presença de neomicina foram plaqueadas em poços em duplicado. Um poço de cada uma das amostras foi induzida pela doxiciclina (+) e um poço foi deixada sem tratamento (-). As proteínas foram extraídas de 72 horas pós-indução e submetido a cromatografia em SDS-PAGE. O Western blot foi corado com anticorpos para sucessivamente SNF2h e à alfa-tubulina (que serve como um controlo de carga), e mostra os níveis de SNF2h em células induzidas e de controlo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Figura 4. Planear uma experiência de ensaio típico knockdown-DAPI. Etapas sucessivas da experiência são apresentados, incluindo o tratamento de doxiciclina para alcançar Acf1 ou knockdown SNF2h, a transfecção para restaurar ou Acf1 SNF2h expressão ou a introdução de uma empty vector e a introdução de E4orf4, ou o seu correspondente vector vazio para dentro das células, e análise dos resultados. Doxiciclina tratados com placas são mostrados em vermelho (Dox) e placas de controlo são marcados em azul. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Figura 5. Detecção de E4orf4 a morte celular induzida pelo ensaio de DAPI. Células que sofreram diferentes tratamentos descritos na Figura 4 foram fixadas e coradas com anticorpos específicos para E4orf4 e DAPI para visualizar os núcleos de células transfectadas. Esta fotografia foi tirada específico a partir de uma amostra contendo E4orf4 e a proteína GFP controlo. (A) da GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) imagens fundidas. As setas brancas marca GFP-E4orf4 e células transfectadas contendo núcleos com morfologias apoptóticas. As setas vermelhasmarcar núcleos com formas irregulares, que não são contadas como núcleos apoptóticos. Asteriscos núcleos mitótica marca ou núcleos que acabou dividido. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Figura 6. Acf1 knockdown E4orf4 aumenta a morte celular induzida. (A) As células da linha de células T-REx-293-derived expressando Acf1-shRNA partir de um promotor induzível por tetraciclina foram induzidos com doxiciclina (Dox +) ou deixada sem tratamento (-Dox). Três dias mais tarde, as células foram transfectadas com plasmídeos expressando E4orf4 (+ E4orf4) ou um vector vazio (-E4orf4), juntamente com um vector vazio ou uma Acf1 plasmídeo expressando GFP-tagged, que foi tornado resistente ao shRNA pela introdução do silencioso mutações. As células foram fixadas 24 horas após a transfecção e coradas com anticorpos para E4orf4 e com DAPI. A indução da morte celular foi medida através do ensaio descrito acima e DAPI a percentagem of células transfectadas com núcleos condensados ​​ou fragmentados foi determinado. Uma experiência representativa com três repetições é mostrado, e as barras de erro representam o desvio padrão. (B) As células de placas paralelas foram colhidas para análise de Western blot. A membrana foi corada com anticorpos anti-E4orf4, GFP, e Acf1. O Acf1 endógeno e Acf1-GFP estão apresentados em dois painéis separados.

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	<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Knockdown da expressão do gene específico é uma abordagem importante para a investigação da contribuição de uma proteína de vias reguladoras. Desde knockdown constitutivo de expressão de genes essenciais afeta negativamente a proliferação de células, o estudo pode exigir a introdução ou transitória de siRNAs ou aplicação de sistemas estáveis ​​knockdown condicionais. A geração de linhagens de células estáveis ​​com a capacidade para a expressão induzida por fármacos de shRNAs aqui descrit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Alta glicose DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet sistema aprovado FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Pen Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-rex-293 células </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidina </td><td> Invitrogen </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> pSuperior.neo + GFP plasmídeo </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Transfecção Polyplus </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doxiciclina </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeído </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

Inactivação funcional da expressão de genes em células de mamíferos é crucial para o estudo da contribuição de uma proteína de interesse a 1,2 caminhos diversos. No entanto, knockdown condicional da expressão do gene é necessária nos casos em que knockdown constitutivo não é tolerada pelas células durante um período longo de tempo 3-5. Aqui descrevemos um protocolo para a preparação de linhas de células que permitem knockdown condicional de subunidades do factor de remodelação da cromatina ACF. Estas linhas de células de facilitar a determinação da contribuição de ACF a indução da morte celular pela proteína E4orf4 de adenovirus 6. As sequências que codificam os ARN em gancho de cabelo curto para as subunidades Acf1 SNF2h e do factor de remodelação da cromatina ACF foram clonados ao lado de um promotor induzível por doxiciclina num plasmídeo que também contém um gene para o gene de resistência à neomicina. Clones de células resistentes à neomicina foram seleccionadas na presença de G418 e isolado. As linhas celulares resultantes foram induzidas pelatratamento doxiciclina, e uma vez que os níveis de expressão ou Acf1 SNF2h foram reduzidos, as células foram transfectadas com um plasmídeo codificando E4orf4 ou um vector vazio. Para confirmar o efeito específico dos construtos shRNA, os níveis de proteínas ou Acf1 SNF2h foram restaurados para os níveis WT por co-transfecção com um plasmídeo que expressa ou Acf1 SNF2h que foram tornadas resistentes ao shRNA pela introdução de mutações silenciosas. A capacidade de E4orf4 para induzir a morte das células nas diferentes amostras foi determinada por um ensaio de DAPI, em que a frequência de aparecimento de núcleos apoptóticos com morfologias, na população de células transfectadas foi medida 7-9. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para a determinação da contribuição funcional de várias proteínas para a indução da morte celular pelos seus parceiros de proteína nos casos em que pode ser constitutiva knockdown célula letal.

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Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Contribuição do factor de remodelação da cromatina ACF para E4orf4 morte celular induzida foi medida. O protocolo inclui a selecção de clones de células na qual o tratamento doxiciclina induz knockdown condicional do subunidades ACF Acf1 e SNF2h, e utilização do ensaio para medir DAPI E4orf4 morte celular induzida em linhas celulares indutíveis.

Preparação de linhagens de células para Knockdown condicional da expressão gênica e mensuração dos efeitos Knockdown em E4orf4 morte celular induzida por

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

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10.9K visualizações.  Technion - Israel Institute of Technology. Contribuição do factor de remodelação da cromatina ACF para E4orf4 morte celular induzida foi medida. O protocolo inclui a selecção de clones de células na qual o tratamento doxiciclina induz knockdown condicional do subunidades ACF Acf1 e SNF2h, e utilização do ensaio para medir DAPI E4orf4 morte celular induzida em linhas celulares indutíveis.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

A geração de linhas de células humanas estáveis ​​com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Em larga escala Knockdown Gene em<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...