1. Preparação e contagem das células NAMALWA <ol><li> Remover as células da garrafa de cultura e centrifugar as células a pelota. Remover as células sobrenadante e ressuspender em um volume conhecido de PBS. As células utilizadas neste protocolo são células em suspensão. Se você estiver usando células aderentes terá de trypsinize antes de coletar. </li><li> Para determinar o número de células vivas, mancha uma alíquota da suspensão de células, misturando-o 01:01 com uma solução 0,4% de azul de tripano e Pipete 10 da mistura sobre uma lâmina de contagem, e depois inserir o slide na célula automatizada TC10 contador (Bio-Rad Laboratories, Inc). </li><li> O contador de células TC10 vai autofocus para assegurar a contagem mais precisa, e depois prosseguir com a contagem. Ela determina automaticamente a densidade de células vivas e células totais da amostra. </li><li> Selecione ver a imagem para mostrar as células na tela principal. Em seguida, selecione a calculadora de diluição para ter o contador de células TC10 calcular automaticamente a quantidade de mistura de células que serão necessários. </li><li> Este experimento está usando um total de três siRNAs: uma siRNA controle e dois siRNAs diferentes visando o gene STAT6, além de controles untransfected. Isto requer 3,6 ml na concentração final de 5 X 10 6 células por ml. </li><li> Digite a concentração desejada e os valores de volume final na calculadora de diluição, e calcula o volume de suspensão de células necessárias com base na contagem de células vivas para essa amostra. Alternativamente, realizar o cálculo manualmente. Em seguida, transferir o volume necessário de mistura de células para esses experimentos em um tubo novo. </li><li> Girar a misturas de células para agregar as células e remover todos os PBS. Ressuspender em 3,6 ml de tampão de eletroporação Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories). Transferência de 800 mL alíquotas em tubos contendo os siRNAs apropriado e misture delicadamente. As células estão agora prontos para eletroporação. </li></ol> 2. Electroporating as células em placas de 96 poços <ol><li> A placa de 96 poços eletroporação permite que o replica para todos os quatro tratamentos de ser electroporated juntos. </li><li> Transferência de 150 mL da suspensão de células nos poços apropriados de uma placa de eletroporação de 96 poços. </li><li> Inserir a placa na câmara de eletroporação MXcell placa e feche a tampa. </li><li> Electroporate usando configurações otimizadas para a linha de celular e de buffer a ser utilizado. Estas células são electroporated usando uma onda de decaimento exponencial com as definições do aparelho de 250 V, 350 mF, e 1000 Ω de resistência. </li><li> Depois de eletroporação é completa, pipeta para cima e para baixo suavemente em cada bem para misturar e depois transferir as células a uma placa de cultura de tecidos contendo pré-aquecido mídia. NAMALWA células são cultivadas em RPMI (Life Technologies), suplementado com FCS 7,5% e 1% piruvato. </li><li> Amostras de controle que não foram electroporated são tomadas a partir da suspensão de células remanescentes e adicionado à cultura de pratos pré-aquecido meio de cultura de forma idêntica para as células electroporated. </li><li> Células incubar durante a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Após 24 horas, um conjunto de células foi induzida com concentração de 10 ng / ml final IL-4 recombinante (R &amp; D Systems). O segundo conjunto de células controle só recebem mídia adicional. Todas as células são incubadas uma hr mais 24 a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 3. Extrato e verificar RNA <ol><li> Após um total de 48 horas de crescimento, contar as células em cada poço, e transferir uma alíquota de cada bem a um tubo de microcentrífuga para a extração de RNA, e congelar uma alíquota de segundo para análise de proteínas western blotting ou outros. </li><li> Centrifugar amostras para agregar as células, e, em seguida, remover e descartar o sobrenadante de cada tubo. </li><li> Prosseguir com a extração de RNA. Normalmente usamos o total Aurum RNA kit (Bio-Rad) de acordo com o protocolo incluídos. </li><li> Ao monitorar siRNA knockdown mediado gene é especialmente importante para verificar a qualidade RNA RNA degradado, porque vai dar resultados enganosos. A relação 260/280 não indica a integridade do RNA, portanto, é importante para executar as amostras em um gel ou dispositivo microfluídicos para confirmar RNA não são degradadas. </li><li> Para avaliar a qualidade e quantidade em uma única etapa, essas amostras serão analisadas com o sistema de eletroforese Experion automatizado (Bio-Rad). </li><li> Primeiro, as amostras de calor. Então, primeiro, carga e vórtice do Experion chip de RNA. Inserir o chip na estação eletroforese Experion e começar a correr. </li><li> Após a corrida é completa, o software irá exibir Experion resultados automaticamente na forma de um electroferograma tabela de resultados, (que exibe RNA concentração, a relação ribossomal, RNA eo número indicador de qualidade), e gel virtual (que é semelhante a um RNA tradicional gel). De alta qualidade total de amostras de RNA terá tipicamente um RQI de 8-10. </li&gt; </ol> 4. PCR em tempo real <ol><li> Após verificar a qualidade RNA, prossiga com as reações cDNA. Este experimento usou o iScript um passo-RT-PCR mix (Bio-Rad) para combinar a síntese de cDNA e PCR em tempo real em uma reação. </li><li> Faça um mix master contendo todos os componentes de reação que não seja os modelos RNA para cada conjunto de primers, e distribuir esses na placa de PCR. </li><li> Após diluição da RNA a uma concentração uniforme, adicione a amostras de RNA nas cavidades apropriadas. Cada reação é configurado em triplicado. </li><li> Selar a placa, e colocá-lo no CFX384 sistema de PCR em tempo real (Bio-Rad). Selecione o protocolo apropriado e começar a correr. </li><li> Uma vez que a corrida é completa, a expressão do gene é determinada pela comparação de expressão gênica do gene de interesse normalizado para um gene nas células de referência electroporated com siRNA experimental para a normalização das células electroporated mesmo com um controle siRNA. </li></ol> 5. Análise de knockdown siRNA <ol><li> A expressão de CCL17 foi monitorado usando quantitativa PCR em tempo real para investigar o papel do ativador transcricional STAT6 em IL-4 indução dependente de CCL17. Para este experimento, GAPDH foi utilizado como gene de referência. Genes de referência alternativo ou genes múltiplos de referência pode ser usado da mesma maneira. </li><li> O software Gerenciador CFX automaticamente normalizado CCL17 expressão a expressão do gene de referência a partir da mesma amostra e automaticamente comparados os valores resultantes normalizada a tratamentos de controle simplesmente selecionando GAPDH como &quot;referência&quot; e ao tratamento controle (siRNA controle sem indução de IL-4) como &quot;controle&quot; na janela de configurações experiência do gerente de software CFX. </li><li> Sem indução de IL-4, a transcrição de CCL17 permaneceu em baixa, níveis constitutivos comparável ao tratamento controle. </li><li> Células induzidas com IL-4 e manter um caminho STAT6 normal (ie, siRNA controle ou tratamentos controle untransfected) mostraram 10/08 indução dobra de CCL17 expressão. </li><li> Células induzidas com IL-4, mas com STAT6 expressão inibida pela introdução de qualquer siRNA STAT6 mostrou expressão CCL17 apenas cerca de 2 vezes maior do que as células uninduced confirmando o papel do STAT6 no IL-4 expressão induzida de CCL17. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visão geral da via IL-4 sinalização. Um Binding) de IL-4 ao seu receptor leva a dimerização e ativação de STAT6. Ativado STAT6 transloca para o núcleo e ativa a transcrição de seus genes-alvo, como CC17. B) Sem IL-4 indução, transcrição de CCL17 permanecerá em baixa, níveis constitutivos. C) Depois de siRNA mediada pelo silenciamento do gene STAT6, o tratamento com IL4 deve levar a pouco ou nenhum aumento no CCL17 expressão. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Indução de CCL17 por IL4 medida por diferentes condições quantitativas por PCR em tempo real. A) As amostras cultivadas sem IL-4 teve um baixo nível de expressão constitutiva, independentemente da expressão do gene. B) Como mostrado em verde e azul, as amostras de controle normalmente respondeu ao tratamento com IL-4, com uma indução 10/08 dobra de CCL17. No entanto, as células transfectadas com siRNAs segmentação STAT6, mostrado em vermelho e rosa, tinha diminuído CCL17 expressão em resposta a IL-4, apoiando a idéia de que STAT6 desempenha um papel na expressão de IL-4 induzida de CCL17.

O autor é empregado por Bio-Rad Laboratories, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Este artigo demonstrou como electroporate siRNAs em uma difícil transfectar linhagem de células de suspensão e como seguir a expressão gênica nessas células. Ao fazer este procedimento é importante lembrar de manter as coisas o mais consistente possível em todas as amostras.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

O uso de siRNA knockdown mediado gene continua a ser uma importante ferramenta em estudos de expressão gênica. estudos estão sendo conduzidos siRNA não só para estudar os efeitos da downregulating genes individuais, mas também para interrogar vias de sinalização e de outras redes de interação complexas. Estas análises via requerem o uso de modelos celulares relevantes e métodos que causam menos perturbação da fisiologia celular. Eletroporação é cada vez mais sendo usado como uma forma eficaz de introduzir siRNA e outros ácidos nucléicos em difícil transfecção de linhas celulares e pilhas, sem alterar a via de sinalização sob investigação. Existem várias etapas fundamentais para uma experiência bem sucedida siRNA, e existem maneiras de simplificar o trabalho, melhorando a qualidade de dados em vários estágios experimentais. Para ajudar você a começar com o seu projeto de siRNA knockdown mediado gene, vamos demonstrar como realizar um estudo completo do percurso recolha e contagem de células antes da eletroporação através de pós-real-time PCR transfecção análise de expressão gênica. O estudo a seguir investiga o papel do ativador transcricional STAT6 em IL-4 expressão gênica dependente de CCL17 em uma linha de células de linfoma de Burkitt (NAMALWA). As técnicas demonstradas são úteis para uma ampla gama de siRNA baseado em experiências com ambos os aderentes e células em suspensão. Também vamos mostrar como otimizar contagem de células com o contador de células automatizado TC10, como electroporate várias amostras simultaneamente, usando o sistema de eletroporação MXcell, e como a avaliação simultânea da qualidade e quantidade de RNA com o sistema de eletroforese Experion automatizado.

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Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Este procedimento descreve um fluxo de trabalho rápido e fácil de introduzir em siRNA difícil de transfecção de linhas celulares e siga expressão gênica por PCR em tempo real. Uso de um contador de células automatizado, multi-prato bem eletroporação, e da estação de eletroforese automatizada fornecer resultados rápidos e confiáveis, sem a necessidade de manipulação robótica caro.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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Research

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Biology

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

Preparação de linhagens de células para Knockdown condicional da expressão gênica e mensuração dos efeitos Knockdown em E4orf4 morte celular induzida por

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...