Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório Buchholz eo Sigma-Aldrich RNAi-time para a discussão. Gostaríamos de agradecer ao Max Planck Society eo Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] para suporte. MISSÃO ® é uma marca registrada da LP Biotecnologia Sigma-Aldrich

1. Alta qualidade esiRNA bibliotecas MISSÃO <ol><li> Para cada gene de interesse da região-alvo mais sensíveis e específicas para RNAi é escolhido utilizando o algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). Quatro pontuações DEQOR o potencial silenciamento de todas as possível 21 nucleotídeos siRNAs longos em um alvo mRNA baseada em state-of-the-art design 4 restrições. Além disso, cada siRNA potencial é analisado para possível reatividade cruzada com outros genes através da realização de uma pesquisa BLAST contra o transcriptoma do organismo estudado. O programa fornece, assim, uma análise da qualidade global e cross-silenciamento capacidades dos esiRNA potencial (300-600 duração bp). </li><li> A região escolhida do alvo gene-cDNA é amplificado por PCR usando primers gene-específicos flanqueado por RNA-polimerase bacteriófago promotor-seqüências. </li><li> Cada produto de PCR utilizado para a produção esiRNA MISSÃO é verificada a identidade através do seqüenciamento e análise de pureza, Caliper Labchip. </li><li> Long double-stranded RNA é transcrito a partir do PCR-RNA polimerase produto, seguido de um recozimento dos fios transcritas. </li><li> esiRNAs são preparados por digestão enzimática limitada do long double-stranded RNA usando RNaseIII seguidos de purificação através de cromatografia de troca aniônica, utilizando colunas de Q-sepharose spin. </li><li> esiRNAs são precipitadas e ressuspendidas em tampão TE. O rendimento é medido pela absorção de UV-medições ea concentração é ajustada pela dissolução em um volume adequado de tampão TE. A qualidade global do produto final está marcada pela Caliper análise Labchip. </li></ol> 2. Escolhendo uma linha celular e otimização de transfecção para a seleção <ol><li> Titular quantidades de esiRNA (use EG5 como positivo e renilla-luciferase como controle negativo) e quantidades crescentes de reagentes de transfecção em uma placa de 384 poços, adicionar células e incubar por 48 horas. EG5 é uma proteína do motor kinesin necessários para a montagem do eixo bipolar e esgotamento leva a uma paragem da mitose. Repita este procedimento para os reagentes de transfecção e diferentes linhagens celulares. Aqui, usamos células HeLa cultivadas seguindo procedimentos padrão e oligofectamine (Invitrogen) como reagente de transfecção. </li><li> Para a escolha das condições ideais de transfecção contar as células transfectadas com EG5 esiRNAs que mostram uma paragem da mitose (forma arredondada) eo número total de células transfectadas com renilla-luciferase esiRNA (RLUC) por microscopia de luz. Escolha o estado com a menor toxicidade para RLUC eo fenótipo mais pronunciada para EG5. Um método alternativo para otimização das condições de transfecção envolve uma linha celular estável expressando EGFP (ou outro gene repórter adequados) sob o controle de um promotor constitutivo ativo. Após a transfecção de um esiRNA contra EGFP (ou outro gene repórter) e RLUC (ou outro esiRNA controle adequado negativo) eficácia medida knock-down e toxicidade por separação de células por exemplo fluorescência assistida (FACS). Certifique-se que o esiRNA usado para EGFP é totalmente complementar ao mRNA-alvo. </li></ol> 3. Configurando a tela de 5,6 Primária <ol><li> Otimizar a precisão de pipetagem para todos os componentes usados ​​em uma estação de pipetagem automática (por exemplo, Aquarius, Tecan e WellMate, Matrix). Porque os parâmetros de pipetagem mudar, dependendo do tipo de tipo de volume de solução, ea placa esta otimização tem que ser repetido para cada etapa separadamente. Se possível, a estação de pipetagem deve ser colocado sob uma capela de fluxo laminar para evitar contaminações. Todos os componentes utilizados devem ser higienizados antes do uso, quer em autoclave, se aplicável, ou por aspersão com etanol 75%. Otimizar protocolos de lavagem, para que a contaminação cruzada de bem para o bem é excluído. Detalhes para a otimização de pipetagem automática não pode ser dar para o espaço-constrangimentos e dependem em grande parte da estação de pipetagem utilizada. Para mais informações consulte a fabrica de protocolo. </li><li> Transfecção de células em formato de 384 poços, utilizando as condições otimizadas de cima com esiRNAs para EG5 e RLUC. Use um padrão alternado para EG5 e esiRNA RLUC cobrindo toda a placa. </li><li> Após a incubação por 48 horas fixar as células com 100% de etanol frio, hidratar em PBS por 15 minutos, mancha por 25 minutos em PBS contendo 1 mg / ml DAPI e 100 mg / ml de RNase A (Qiagen). Finalmente, lavar com PBS e armazenar a 4 ° C. </li><li> Medida de intensidade de fluorescência de DAPI-por exemplo, em um sistema de microscopia ScanR Olympus. Gerar um histograma de intensidade por conspirar contra o DAPI número de células e avaliar a distribuição do ciclo celular através do cálculo do percentual de células com o DNA 2N conteúdo para a fase G1; &lt;2N&gt; 4N para S-fase; 4N para G2/M-phase e &gt; 4N para aneuploidia / poliploidia. </li><li> Avaliar a homogeneidade dos resultados sobre a placa. Otimização é necessária se os resultados diferem significativamente para excluir effe posiçãocts. Um problema comum quando se utiliza multi-placas é bem maior evaporação nos poços vantagem durante o tempo de incubação. Isto leva a diferentes condições experimentais em poços diferentes, que muitas vezes se traduz em placa-position efeitos específicos. Por este motivo, recomendamos deixar todos os poços borda vazia para uma tela. Para minimizar ainda mais a evaporação se certificar de que as incubadoras são mantidos em umidade alta. Nós também rotineiramente empregam barreiras evaporação, como Corning A fita de vedação respirável que bloqueiam a evaporação. Recursos também outros para efeitos da posição tem que ser levados em consideração, por exemplo, variação da técnica do sistema de leitura (microscópio leitor de placas, etc) ou variações de manipulação de líquidos (gradientes, heterogeneidade de soluções, etc). </li><li> As diferenças estatísticas entre os controles positivos e negativos fornecer uma medida para a importância do doseamento utilizados. A grande diferença entre o controle negativo (ou ruído de fundo; mock-controle) e da amostra tem de ser estabelecida antes de iniciar o rastreio real. Uma boa medida para a significância estatística é o factor-Z. O Z-fator é calculado segundo a equação: Z = 1 - (3 SD [amostra] + 3 SD [simulação]) * (| Av. [amostra] - Av. [simulação] |) -1; com SD: desvio padrão; Av: média. A Z-fator de 1&gt; Z&gt; 0,5 indica uma separação estatisticamente significativa de controles negativos (e ruído) dos controles positivos 7. </li></ol> 4. Tela principal <ol><li> Prepare 384 poços placas de cultura de tecidos para a transfecção de esiRNAs utilizando as condições otimizadas de cima. Aqui, usamos esiRNA 15ng por poço dissolvido em 5μl tampão TE. Pelo menos oito posições de controle por placa deve ser carregado com adequados controles positivos e negativos para o processo biológico em estudo (aqui: EG5 e RLUC). Para evitar efeitos de borda posição dos poços são carregados com 5μl tampão TE apenas. </li><li> Adicionar 5μl OptiMEM (Invitrogen) contendo Oligofectamine 0.2μl por poço, misturar e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar suspensão celular sobre a mistura de transfecção (aqui: 40μl de uma suspensão de células HeLa a 25 células / mL de concentração; equivalente a 1.000 células por poço) e incubar por 72 horas. </li><li> Medida DNA de conteúdo em um microscópio automatizado (Olympus ScanR, veja acima). Avaliar usando Z-score estatísticas para a seleção hit: Z-scores são calculados para todos os esiRNAs amostra usando o sinal para o controle negativo como referência. Nota, o Z-score não é o mesmo que o factor-Z. Z-scores fornecem uma medida estatística de significância dos valores da amostra em comparação com um controle (mock-). É calculado de acordo com a equação: Z = (valor [Sample] - média [simulação]) * desvio-padrão [simulação] -1. Para a seleção bateu um limite tem de ser aplicado. Tipicamente, um critério de importância, como: 2 &lt;Z &lt;-2 é usado, mas dependendo da qualidade do conjunto de dados, o estudo processo biológico ou simplesmente o escopo da tela, diferentes limiares podem ser aplicáveis. Ao lado do razoavelmente fácil Z-score estatísticas também mais elaboradas métodos de avaliação matemática pode ser usada (a primeira no interior amplo campo de avaliação estatística de dados de rastreio podem ser encontrados em Malo et al. 8). </li></ol> 5. Tela secundária e validação hit <ol><li> A tela secundária segue a tela principal para eliminar falsos positivos devido a erros experimentais ou fora do alvo efeitos. Para os hits selecionados o mesmo procedimento utilizado na tela principal deve ser repetido para um número maior de repetições (3-5) para permitir uma melhor avaliação estatística. </li><li> Por sucessos verificados um esiRNA secundário que não se sobrepõem (ou outro gatilho silenciamento não sobrepostos) contra os alvos identificados nas telas iniciais devem ser utilizados. Mesmo ensaio e leia-out deve ser aplicada como para a tela principal. </li><li> Em última análise, os genes selecionados podem ser validadas pelo cross-espécies de resgate RNAi 9. Assim, um cromossomo bacteriano artificial codificação (BAC) por exemplo, o rato ortólogo do gene é estavelmente transfectadas em células. BAC-construções de preservar um gene em seu contexto genômico e permitir uma expressão quase-fisiológica. RNAi contra o gene endógeno humano vai deixar a expressão do transgene rato inalterada que resgata a RNAi-fenótipo. RNAi-resgate fornece o padrão-ouro para a verificação de fenótipos RNAi disponíveis até à data. </li><li> Finalmente, os candidatos validados são estudados em mais detalhes para finalmente obter a compreensão mecanicista. Em muitos casos RNAi pode ser usado nesses experimentos, por exemplo, no secundário, testes mais elaborados. </li></ol>

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	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

Autores declaram relações financeiras com entidades comerciais que possam ter interesse no trabalho apresentado.

Interferência de RNA tem se tornado uma técnica padrão para o estudo de perda de função-fenótipos. Grande escala coleções de RNAi-mediadores estão disponíveis a partir de diferentes fornecedores e fornecer um método fácil, econômico e rápido para silenciamento de genes. Este abriu o portão para a triagem sistemática para atores-chave em muitos processos biológicos que permite uma perspectiva de escala do genoma em uma ampla gama de diferentes espécies e tipos de células. Alta de falsos positivos e falsos negativos são as taxas de um desafio comum em telas de RNAi. Para resolver este problema, esforços consideráveis ​​foram investidos para melhorar a eficácia e, em particular a especificidade do silenciamento triggers. Uma descoberta importante foi que um grupo de siRNAs diferentes visando a transcrição mesma aumenta muito a especificidade alvo. Porque uma piscina muito complexa de diferentes siRNAs é produzido pela endoribonuclease, esiRNAs são gatilhos alta especificidade alvo, reduzindo a taxa de falsos positivos em telas de RNAi. esiRNAs também demonstraram para atingir knockdowns eficiente, reduzindo também a taxa de falso negativo. Porque as telas de RNAi são tecnicamente exigentes, que provavelmente permanecerá desafiador para realizar de forma rotineira por algum tempo. No entanto, como reagentes e instrumentos de laboratórios obter melhor e mais compartilhar seus conhecimentos, o uso de telas de RNAi na biologia moderna são considerados para aumentar no futuro.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

Interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo básico celular para o controle da expressão gênica. RNAi é induzida por curto double-stranded RNA também conhecido como pequenos RNAs de interferência (siRNAs). A curto double-stranded RNA provenientes de mais de casal precursores presos pela atividade de Dicer, uma proteína da família III RNase de endonucleases. Os fragmentos resultantes são componentes do RNA induzida silenciamento complexos (RISC), direcionando-a para o mRNA alvo cognato. RISC cliva o mRNA alvo, reduzindo assim a expressão da proteína codificada 1,2,3. RNAi tem se tornado um método poderoso e amplamente utilizado experimental para a perda de estudos a função do gene em células de mamíferos utilizando pequenos RNAs de interferência. Atualmente dois métodos principais estão disponíveis para a produção de pequenos RNAs de interferência. Um método envolve a síntese química, ao passo que um método alternativo emprega clivagem endonucleolítica de alvo específico long double-stranded RNA pela RNase III in vitro. Assim, uma piscina diversificado de siRNA-like oligonucleotides é produzido, que é também conhecido como endoribonuclease preparados siRNA ou esiRNA. Uma comparação da eficácia dos siRNAs quimicamente derivados e esiRNAs mostra que ambos os gatilhos são potentes no alvo gene-silenciamento. Diferenças podem, no entanto, ser visto quando se compara especificidade. Muitos única siRNAs sintetizados quimicamente produzem proeminente fora do alvo os efeitos, enquanto que a mistura complexa inerente esiRNAs leva a um knockdown mais específico 10. Neste estudo, nós apresentamos o projeto do genoma escala bibliotecas MISSÃO esiRNA e sua utilização para RNAi triagem exemplificado por uma tela de DNA de conteúdo para a identificação de genes envolvidos na progressão do ciclo celular. Vamos mostrar como otimizar o protocolo de transfecção e no teste de triagem em alta taxa de transferência. Também demonstramos como grande conjuntos de dados podem ser avaliados estatisticamente e apresentar métodos para validar visitas primária. Finalmente, damos potenciais pontos de partida para outras caracterizações funcionais de visitas validado.

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Aqui usamos uma biblioteca esiRNA humanos em uma tela de high-throughput de genes envolvidos na divisão celular. Demonstramos como configurar e realizar uma esiRNA telas, bem como a forma de analisar e validar os resultados.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K visualizações.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Aqui usamos uma biblioteca esiRNA humanos em uma tela de high-throughput de genes envolvidos na divisão celular. Demonstramos como configurar e realizar uma esiRNA telas, bem como a forma de analisar e validar os resultados.

Vídeo: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Biologia

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.