Os autores gostariam de agradecer a UGT Harlan Fellowship para suporte de Paaqua Grant ea UGT Luther Rice Fellowship para suporte de Mona Herold. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concessão MCB-1121711.

1. Preparação de instrumentos, meios de cultura e pratos <ol><li> Afie quatro pinças utilizando filme abrasivo Alumina. Fazer isso sob um microscópio de dissecação para monitorar o tamanho da ponta. Um par de fórceps serve como um back-up no caso de uma dica é danificado durante o procedimento. Autoclave as quatro pinças e armazenar em um recipiente estéril. </li><li> Faça 500 ml cada de meio de cultura 0,1 X 1,0 X e (ou Modificação de Marc Ringers [MMR] ou salinos Modificado Barth [MBS]; receitas em 15) e filtro de esterilizar. Rotineiramente utilizar MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, HEPES 5 mM [pH 7,8], 2,5 mM de NaHCO3). Guarde-o em 14-18 ° C por meses. </li><li> Fazer uma solução de 2% de agarose num meio de cultura (2 g de electroforese de agarose de grau em 100 ml de 1X meio de cultura num frasco de vidro com tampa de rosca). Autoclavar para dissolver agarose. Este pode ser armazenado a 4 ° C, durante meses, e microondas para liquefazer a agarose quando é necessário seguinte. </li><li> Enquanto a agarose é líquido, despeje cerca de 0,5 ml para o fundo de cada poço de uma placa de cultura estéril de 24 poços. Isso vai impedir que os explantes de furar para o plástico. </li><li> Enquanto a agarose é líquido, derrame aproximadamente 2-3 ml para o fundo de dois a três pratos de Petri 60 milímetros, e agite cuidadosamente para garantir que a parte inferior é coberto. Estes servirão como pratos de dissecção eo agarose impede embriões de degola para o plástico uma vez que suas membranas são removidas. </li><li> Quando a agarose tiver arrefecido e endurecido, chama a ponta de uma 6 &quot;pipeta Pasteur até que se funde com uma bola, e ligeiramente tocar na superfície da agarose em cada poço da placa de cultura. Isto vai criar uma depressão pouco profunda em que o explante será colocado. </li><li> Encher cada poço da placa de cultura com meio de cultura estéril 1X. </li><li> Quando a agarose tiver arrefecido e endurecido, encher o prato de dissecação com meio de cultura diluído (0,1 X 0,1 X MMR ou MBS) para facilitar a separação de blastómeros. </li&gt; </ol> 2. Selecção de Embriões <ol><li> Obtenção de ovos fertilizados e remover o revestimento de acordo com protocolos de geléia padrão 15. Transferi-los para meio de cultura de 0,5 X 100 numa placa de Petri mm. </li><li> Quando os embriões atingem o estágio de 2 células, classificar aqueles em que o sulco de clivagem primeiro corta a área levemente pigmentados no hemisfério animal (Figura 1) para uma placa separada. Estes serão os doadores para os explantes. Manter os restantes dois embriões de células em um prato separado ao lado dos embriões de dadores de todo o procedimento para servir como controlos para a fase de irmãos explantes. </li></ol> 3. Preparação de Explantes <ol><li> Colocar 5-10 embriões numa placa de dissecação, mas funcionam apenas com um embrião de uma vez. </li><li> Posicionar o primeiro embrião de modo a membrana vitelina transparente pode ser visto, que é separado por um espaço livre (espaço perivitelino) acima da superfície do pólo animal do embrião. Usando uma força afiadaps na mão subdominante (mão esquerda se for destro), segure a membrana vitelina acima do espaço perivitelino. Usando uma pinça afiada na outra mão, segure a membrana próxima à ponta fórceps primeiro, e puxe em direções opostas para descascar a membrana de distância. Fazer o aperto inicial, a uma distância a partir da célula que está a ser dissecado, de modo que a célula alvo não é danificada durante a remoção da membrana. Pode-se dizer que a membrana foi removido porque o embrião vai achatar. </li><li> Pegue uma célula vizinha com a pinça na mão subdominante e usar esse celular como uma &quot;alça&quot; para a célula a ser dissecado não está diretamente tocado. Com a pinça na outra mão, puxe as restantes células vizinhas para longe do blastômero desejado. Se as células da linha média, que compartilham o mesmo destino, são alvo, eles podem ser removidos em conjunto, como um par. Finalmente, dissecar afastado a &quot;alça&quot; da célula. </li><li> Pegue o blastômero (ou par blastômero), com uma estéril, Pipetas de Pasteur de vidro, evitando bolhas de ar e sucção excessiva. A pipeta pode ser fogo-polido para remover bordas cortantes que podem danificar o celular, mas não rotineiramente fazer isso. Colocar a ponta da pipeta de Pasteur sob a superfície do meio de cultura numa cavidade da placa de cultura de explante e suavemente expelir o blastómeros. Ele deve deslizar na depressão rasa pela gravidade. O blastômero mesmo a partir de mais do que um embrião podem ser combinados em um único explante. </li><li> Repetir este procedimento com os embriões restantes no prato dissecção, uma-a-uma. Depois de cerca de 10 embriões, o prato de dissecação será preenchido com resíduos celulares. Quando isso ocorre, mudar para um prato de dissecação fresco. </li><li> Depois de todas as dissecções são feito, verifique se os explantes estão nas depressões rasas. Caso contrário, eles podem ser suavemente empurrado para dentro da depressão com um laço de cabelo que foi esterilizada com etanol a 70% e seco ao ar. </li><li> Cerca de uma hora após a dissecção passado, remover detritos surrounding explantes curadas com uma estéril, vidro Pasteur pipeta. </li><li> A placa de cultura de explantes em 14-20 ° C ao lado da placa de Petri contendo o irmão, embriões de controlo. Embriões irmãos vai indicar o estado de desenvolvimento dos explantes de blastómeros. </li></ol> 4. Explantes de colheita de Análise <ol><li> Colher os explantes quando os irmãos atingir o estágio desejado desenvolvimento. Estes explantes sobreviver muito bem, mesmo que algumas das células se desintegram. Por isso, se existe uma massa turva no poço de cultura, explorar com uma malha de cabelo ou uma pinça para determinar se um explante saudável é enterrado no interior. </li><li> Pegar explantes em um pequeno volume da solução de cultura com uma pipeta de Pasteur de vidro, e gentilmente expeli-los para um tampão de lise adequado, ou fixador para o ensaio a ser realizado. </li></ol>

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	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os passos mais críticos para a cultura bem sucedida de blastômeros individuais são os seguintes: 1) identificar correctamente o blastômero de interesse e 2) manutenção de uma cultura estéril e saudável, 3) as células de dissecação na parte correcta do ciclo celular, e 4) o desenvolvimento do Manual necessário destreza para evitar danos durante a dissecção e transferir para a cultura também. Para manipular blastómeros específicos, é essencial ser capaz de identificar os eixo...

Embriões de Xenopus laevis foram utilizados extensivamente para identificar os mecanismos pelos quais as células embrionárias adquirem os seus destinos específicos, porque os ovos são suficientemente grandes para permitir que as abordagens de microcirurgia. Além disso, desenvolvem-se externamente, sem a necessidade de suplementação nutricional do meio de cultura uma vez que cada célula contém uma fonte rica intracelular de plaquetas gema que proporcionam um armazenamento de energia intrínseca. Um trunfo importante para o estudo dos mecanismos pelos quais o destino da célula é determinado é o conjunto completo de mapas destino dos blastômeros estágio de clivagem (de 2 a 32 - de células-estágios) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Estes mapas foram construídos por microinjecting uma molécula detectável em um blastômero, único de identificação e monitoramento mais tarde no desenvolvimento que os tecidos são preenchidos pela descendência rotulados. Mapas destino consistentes são possíveis porque os eixos fundamentais de os embriões podem ser identificados de forma confiável em muitos embryOS. Em primeiro lugar, em todos os embriões de tipo selvagem para o hemisfério animal é pigmentada, enquanto que o hemisfério vegetal não é. Em segundo lugar, a entrada do esperma no momento da fertilização provoca uma contracção da pigmentação hemisfério animal para o lado ventral futuro, em muitos embriões diferença pigmentação, portanto, pode ser utilizado para discriminar entre os lados dorsal e ventral. Em terceiro lugar, o sulco de clivagem primeiro se aproxima do plano sagital mediano na maioria dos embriões, e portanto, pode ser usado para identificar os lados direito e esquerdo do embrião. Os mapas destino também confiar no fato de que, naturalmente, ovos fertilizados freqüentemente apegar em padrões regulares que fazem cada blastômero identificável através de uma grande população de embriões. Enquanto existe variabilidade dentro e entre garras de ovos quanto aos padrões de pigmentação e clivagem, utilizando procedimentos de selecção descrito aqui permite que as células com destino prescritos para ser identificado com cerca de 90% de precisão. Destinos celulares podem ser determinadas durante a embriogênese através de vários mecanismos. Fatores intrínsecos, como diferencialmente herdados mRNAs citoplasmáticos ou proteínas, contribuem para vários aspectos de padronização cedo. Por exemplo, os mRNAs específicos maternos determinar quais as células que contribuem para a linha germinal, tornar-se a endoderme, ou contribuir para o eixo do corpo dorsal (revisto em 7). Factores extrínsecos fornecidos localmente por células vizinhas ou mais distante do centro de uma sinalização embrionária, são responsáveis ​​pela indução de tipos específicos de tecidos e padronização do sistema de quase todos os órgãos. Exemplos de centros de sinalização incluem o organizador / nó na gástrula que induz o ectoderma neural e padrões da mesoderme, e da zona de polarização atividade que os padrões do eixo ântero-posterior do botão do membro. Embora os mapas destino identificar os precursores dos diferentes órgãos e revelar o caminho do desenvolvimento tomadas pelos seus descendentes no embrião normal, eles não conseguem distinguir entre intrínsecae influências extrínsecas sobre essas células. Eles também não revelam de todo o potencial de desenvolvimento de uma célula, cujos descendentes diferenciar no ambiente complexo de sinalização do embrião. Duas abordagens experimentais pode testar se o destino de uma célula é determinada por factores intrínsecos ou seja posteriormente influenciado por factores externos: 1) transplantação de células para um local novo no embrião, ou 2) a remoção da célula a partir do embrião seguido por cultura em ausência de sinais exógenos. Ambas as abordagens experimentais têm sido viável em Xenopus, porque as células são suficientemente grandes para serem separadas manualmente. Por exemplo, vários estudos têm excluído células individuais de embriões (para mudar interações célula-célula) ou células transplantadas para locais novos, em embriões de acolhimento para testar mudanças Fate (revisada em 7, 8, 9). Além disso, a segunda abordagem da explantar pequeno número de células a partir de diferentes regiões do embrião into cultura para elucidar as interacções indutivas tecido na ausência de factores exógenos é possível porque as células do embrião de Xenopus são preenchidos com um armazenamento intracelular de nutrientes, as plaquetas da gema. Portanto, elas podem ser cultivadas durante alguns dias em um meio de sal definido sem suplementação nutricional ou factor de crescimento do meio de cultura. Nós temos usado essa abordagem para mostrar que blastômeros animais dorsal tem uma capacidade autônoma de produzir tecidos neurais e dorsal mesodérmicas devido a mRNAs herdada da mãe 10, 11, e outros mostraram que a especificação mesoderma de 32 celulares blastômeros depende tanto informações intrínsecas e extrínsecas 12 . Uma vantagem da cultura de células como explantes é que o meio pode ser suplementado com factores definidos de sinalização a fim de determinar qual a célula-a-célula via de comunicação pode influenciar o destino das células explantadas 12, 13, 14. Além disso, pode-se injetar o pr blastômeroior a cultura com mRNA para sobre-expressar um gene, ou com oligonucleotídeos anti-senso para evitar a tradução de mRNAs endógenos. Estes, ganho e perda de função-análises podem identificar quais as moléculas são necessários para um destino autonomamente expressa. Para a análise do destino do explante, a identificação de tipos específicos de células pode ser realizada por expressão de genes padrão (por exemplo, hibridação in situ, RT-PCR) e ensaios imunocitoquímicos. Este protocolo fornece um simples, mas poderoso maneira, a distinção entre mecanismos intrínsecos e extrínsecos que regulam como uma célula embrionária se desenvolve em tecidos específicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Filme abrasivo de alumina </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-38 </td><td> Curso (12 mm), para grandes reparações de dicas fórceps </td></tr><tr><td> Filme abrasivo de alumina </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-46 </td><td> Médio (3 mm), para a multa afiação de dicas fórceps </td></tr><tr><td> Filme abrasivo de alumina </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fina (0,3 mm), para o polimento de dicas fórceps </td></tr><tr><td> Fórceps: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> Belas Science Tools </td><td> # 11252-30 </td><td> Estes têm as pontas finas que não precisam de afiar quando comprado. Resistente à corrosão para que eles possamser autoclavados. </td></tr><tr><td> Solução de gentamicina </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Adicionar ao meio no mesmo dia que a utilização </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Mapas de destino, construídos a partir da linhagem de rastreamento de todas as células de um embrião, revelam que os tecidos descendem de cada célula do embrião. Embora os mapas destino são muito úteis para a identificação de precursores de um órgão e para elucidar o caminho de desenvolvimento pelo qual as células descendentes povoar o órgão do embrião normal, não ilustram o potencial de desenvolvimento de uma célula precursora ou identificar os mecanismos pelos quais seu destino é determinado. Para testar compromisso destino da célula, se compara repertório normal de uma célula de descendentes no embrião intacto (o mapa destino) com os indicados depois de uma manipulação experimental. É o destino da célula fixo (comprometido), independentemente do meio ambiente celular, ou é influenciada por fatores externos prestados por seus vizinhos? Usando os mapas destino abrangentes do embrião de Xenopus, descrevemos como identificar, isolar e cultura precursores de estágio único de clivagem, chamado Blastomeres. Esta abordagem permite avaliar se estas células iniciais estão comprometidos com o destino que elas adquirem no seu meio ambiente normal em que o embrião intacto, requerem interacções com as suas células vizinhas, ou pode ser influenciada para expressar destinos alternativos, se forem expostos a outros tipos de sinais.

A capacidade deste ensaio para avaliar com precisão a potencial de desenvolvimento das células baseia-se dissecando a blastômero correcta com base no destino de mapas 1, 2, 3, 4, 5, 6. Portanto, é importante escolher os embriões com o padrão de pigmentação correcta na fase 2-célula, como se ilustra na Figura 1, que, posteriormente, em conformidade com padrões de clivagem regulares, conforme ilustrado na Figura 2. Se uma observa os embriões classificadas como chegar...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

blastomere-explants-to-test-for-cell-fate-commitment-during-embryonic

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A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

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15.2K visualizações.  The George Washington University. O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Vídeo: Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Biologia

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...