Mesmo embriões muito precoces contêm muitas moléculas de sinalização diferentes, o que pode tornar desafiador discernir a função completa de qualquer sinal embrionário individual. Ao isolar células de centros de sinalização endógenos, essas explantes permitem aos pesquisadores examinar o papel de uma determinada molécula de sinalização em isolamento relativo. A principal vantagem dessa técnica é que somos capazes de recapitular o tempo embrionário, os movimentos celulares e os padrões de expressão genética dentro de um sistema ex-vivo simplificado sem o tempo ou esforço necessário para manter as células-tronco na cultura.
Comece cortando as explantas dos embriões não infectados primeiro. Se as explantas estendem a cultura, então o corte foi feito para perto da gema. Comece preenchendo uma agulha capilar de vidro puxada com RNA.
Coloque a agulha cheia em um micromedutor e quebre a ponta da agulha com os fórceps. Calibrar o volume de injeção usando um micrômetro de estágio com uma gota de óleo mineral, ajustando o tempo de injeção e a pressão no injetor pneumático para obter um bolus do tamanho desejado. Mantenha a ponta da agulha de RNA submersa no óleo até estar pronta para injetar.
Coloque os embriões na placa de injeção usando uma pipeta Pasteur e uma bomba de pipeta e, em seguida, use um dedo enluvado para pressionar os ovos nos cochos suavemente. Injete 10 picogramas ndr2 RNA na gema de embriões de célula única até que o número desejado de embriões seja atingido ou até que os embriões comecem a se dividir. Use um fluxo suave de água de ovo de uma garrafa de espremer para lavar os embriões da placa de injeção em uma placa de Petri rotulada.
Coloque os embriões na incubadora de 28,5 graus Celsius até atingirem o estágio celular de 128. Remova ovos não fertilizados e embriões mortos do prato. Uma vez que os embriões tenham atingido o estágio de 128 células, coloque-os em pratos de vidro rotulados de Petri, e decanteça o máximo de água de ovo possível deles.
Rotular pratos cristalizadores de vidro com fita de laboratório correspondente a nomes de pratos pequenos, e encher dois terços do caminho com água de ovo. Coloque esses pratos ao lado do microscópio de dissecação para uma acessibilidade rápida. Adicione um mililitro de 20 miligramas por estoque de pronase mililitro, descongelado no gelo a 15 mililitros da solução 3X Danieau em um tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione pelo menos cinco mililitros de solução de pronase a cada placa de vidro Petri contendo embriões. Agitar os pratos de vidro em um movimento circular, monitorando o progresso da descorção consistentemente sob um microscópio dissecando. Uma vez que os acordes começam a enrugar e um a dois embriões estão fora de seus acordes, mergulhe cuidadosamente a placa de vidro Petri contendo pronase e os embriões no prato de cristalização de vidro correspondente contendo água de ovo.
Lave os embriões de descorção três vezes com água de ovo e decante a água do ovo do prato. Realize a terceira e última lavagem com a solução de 0.3X Danieau. Cubra os embriões desocupados com uma tampa de placa de Petri, e devolva-os à incubadora a 28,5 graus Celsius até chegarem ao estágio de 256 células.
Encha uma placa de Petri revestida com solução 3X Danieau. Uma vez que os embriões estejam no estágio de 256 células, transfira-os para a placa revestida de agarose contendo a solução de Danieau 3X, alinhando-os ao longo do centro do prato. Use um par de fórceps, mantidos fechados para estabilizar o embrião, e use o outro para cortar o blastoderm.
Para cortar, aperte suavemente as células blastoderm com um par de fórceps, em seguida, pegue os fórceps estabilizadores e execute-os ao longo dos outros fórceps para cortar aproximadamente metade do blastoderm. Gire o embrião, colocando as fórceps no corte existente e, em seguida, corte o ortopedia do blastoderm restante para o primeiro corte. Mantenha as explantas na solução 3X Danieau por pelo menos cinco minutos para curar, e depois transfira-as para o poço revestido de seis poços cheio de quatro mililitros de mídia explant.
Coloque as placas de cultura de explanta na incubadora de 28,5 graus Celsius até que o ponto de tempo ou estágio desejado seja atingido. Para cortar as explantas quimricas, use um prato com agarose moldado em 12 pequenos poços rasos usando contas de vidro de um milímetro. Encha a placa com a solução 3X Danieau.
Prepare-se adicionando 12 embriões de um genótipo ou condição ao lado esquerdo da placa, e 12 embriões do outro genótipo são condicionados ao lado direito da placa. Mova um embrião de cada condição para o centro da placa perto de um dos 12 poços. Usando fórceps, corte uma explanta de cada embrião como descrito para explantes de embriões únicos.
Pressione rapidamente as bordas cortadas das duas explantas juntas dentro do poço raso usando fórceps para permitir que as duas metades se curem juntas em uma única explanta. Continue com os 12 poços restantes dentro da placa. Uma vez que as explantas são curadas, transfira-as para o poço revestido de agarose de uma placa de seis poços cheia de quatro mililitros de mídia explant.
Repita até que o número desejado de explants seja alcançado. A cultura explanta na incubadora de 28,5 graus Celsius até que embriões de irmãos intactos cheguem ao estágio desejado. Explants de controle cortados dos embriões não infectados do tipo selvagem ou aqueles injetados com 50 picogramas de proteína fluorescente verde codificadora de mRNA permaneceram arredondados durante todo o período de cultura, e não conseguiram expressar marcadores de mesoderme, endoderme ou neuroectoderme.
Explantas cortadas de embriões injetados com 10 picogramas de ndr2 mRNA tornaram-se altamente alongadas após oito a nove horas de cultura. Imagens de lapso de tempo ao vivo dessas explantas por microscopia de contraste de interferência diferencial revelaram que a extensão se lança em ou cerca de oito horas após a fertilização. Explantas de embriões injetados com 10 picogramas de ndr2 apresentaram expressão robusta dos marcadores de mesoderme, tbxta, noto, tbx16 e o marcador de neuroectoderme sox2.
É muito importante cortar as explantas bem acima da margem embrionária. Caso contrário, as explanações conterão sinais endógenos da margem e não serão ingênuas. Neste método, foram utilizadas explanações para abordar o papel da sinalização nodal na morfogênese gastrulada.
No futuro, outros pesquisadores podem usar essa abordagem para testar o papel de moléculas adicionais de sinalização, por exemplo, em qualquer número de processos de desenvolvimento.
