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1. Preparação de Pratos Cultura ECM revestidos ou Lamelas <ol><li> Preparar solução de ECM por dissolução ECM substrato em PBS (Dulbecco tamponada com fosfato, Invitrogen, # 14040-133). Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 milímetros (VWR, # 28145-495) e congelar em alíquotas a -80 ° C. </li><li> Diluir ECM solução estoque em PBS a uma concentração desejada. Para MaxGel, dilua em meio DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium, Invitrogen, # 11995-065). </li><li> Se imunofluorescência será executada, esterilizar 12 milímetros lamelas de vidro circulares (VWR, # 89015-724), por imersão em etanol e deixar secar ao ar. Isto deve ser feito na capa laminar estéril. Se imunofluorescência não será realizada pule para o passo 1.5. </li><li> Lugar esterilizada lamelas em cada poço de uma placa de 24 poços (Corning, # 3526). </li><li> Adicionar 0,5 ml de solução de substrato diluído a cada poço da placa de 24 poços e incubar à temperatura ambiente durante 3 hr. </li><li> Aspirar a solução de ECM e lavar threE em tempos de PBS. </li><li> Aspirar PBS e utilizar imediatamente, ou enrolado em parafilme e armazenadas a 4 ° C durante até 2 semanas. </li></ol> 2. Preparação de instrumentos de dissecação Placas Sylgard com carvão adicionado são preparadas por protocolo do fabricante. O fundo preto resistente destas placas fornece suporte para a fixação do embrião para baixo e a cor oferece um bom contraste que facilita a visualização do embrião translúcido. <ol><li> Para preparar pratos pesam diretamente em um copo tri-derramar sobre um equilíbrio Parte 150 g Um líquido 15 g Parte B e 1 pó de carvão g (Instrumentos de Precisão Mundo, # SYLG184). Misture usando um palito de picolé de madeira ou espátula. Despeje em vidro ou plástico de 100 pratos centímetros. Usar um maçarico de butano pequena realizou cerca de 10 a 12 polegadas acima dos pratos para queimar as bolhas. Tampas lugar em placas e deixe descansar por pelo menos 24 horas para definir. </li><li> Para preparar instrumentos de dissecação inserção de um pino Minutien (0,1 milímetros diameter) para um suporte de pino (Belas ferramentas científicas, # e # 26002-10 26018-17, respectivamente), em alternativa, agulhas de calibre 26 (BD, # 309597) dobradas em ângulo recto com o auxílio de uma pinça podem ser utilizados como instrumentos de dissecação. Afiadas Estudante Dumont # 5 Fórceps (Ferramentas Ciência Fine, # 91150-20) usando uma pedra de amolar (Belas ferramentas científicas, # 29008-22). </li><li> Esterilizar todas as ferramentas de dissecação com etanol 70% antes da utilização. </li></ol> 3. Coleta de embriões <ol><li> Euthanize o mouse cronometrado grávida de 8,5 post coitum dias de acordo com os regulamentos da comissão de animais de uso e remover útero. </li><li> Útero lugar em uma placa de Petri de plástico com PBS estéril. </li><li> Lavar uma vez com PBS útero estéril. </li><li> Sob um microscópio de dissecção remova cuidadosamente embrião do deciduas usando um par de fórceps. </li><li> Remover Membranas Extra-Embrionárias e salvar para a genotipagem, se necessário. </li><li> Fase embrionária através da contagem somitos. Os estágios ideais para fazer explantes para analisar celular behAvior durante a elevação vezes neural seria entre os 6 e os 10 estágios somito quando as pregas neurais estão apenas começando a elevar e antes da morfogênese principal do mesênquima craniano ocorre. </li><li> Lavar embrião em PBS. Coloca-se num prato de Sylgard preto com DMEM que contém nenhuma vermelho de fenol (Invitrogen, # 21063-029). Remova as membranas extraembryonic e salvar para a genotipagem, se necessário. </li></ol> 4. Preparação de Explantes <ol><li> Recentrar o microscópio com a ampliação mais elevada possível ao longo da região da cabeça do embrião. </li><li> Faça cortes com uma agulha de dissecção em cada mão. Use uma agulha para manter o tecido no seu lugar e o outro para fazer cortes. </li><li> Cortar a cabeça do embrião anterior aos rhombomeres. </li><li> Corte ao longo da linha média para bifurcar a cabeça em duas metades iguais. </li><li> Corte em torno das franjas exteriores da cabeça e linha média. Estes cortes vão remover a crista premigratory e ectoderme superfície na fronteira externa ea placa precordial na linha média. O tecido remanescente será o explante e irá conter a migração de crista neural cranial, mesoderme e ectoderme superfície paraxial. </li><li> À medida que o tecido é cortado, remover detritos dissecado do prato usando uma pipeta de pasteur estéril. Isto impede confundir o explante com os restos dissecados. </li><li> Delicadamente, lave o explante pipetando cima e para baixo com uma pipeta de 20 ul ponta e Pipetman. Isto irá remover células frouxamente ligados e evitar bordas irregulares em explantes. </li><li> Cuidadosamente pegar cada explante em cerca de 10 uL de líquido utilizando uma pipeta de 20 uL e ponta Pipetman e lugar no centro da cultura revestida. </li><li> Adicionar 20 ul de meio de cultura suplementado com 15% de FBS para cobrir o explante. </li><li> Colocar a placa numa incubadora de cultura de tecidos humidificada (5% de CO 2, 37 ° C) durante 1-2 horas para permitir que o explante para prender a parte inferior do prato. Ver periodicamente para garantir que o explante não secapara fora. </li><li> Quando o explante tem anexado, cuidadosamente adicionar a cada cavidade 250 ul de DMEM suplementado com FBS a 10% que foi aquecida a 37 ° C em banho-maria. Uma vez explantes foram ligados eles não se movem quando o prato é suavemente agitada sob microscópio. </li><li> Retornar ao prato de cultura de tecidos incubadora. </li><li> Após 24 h, os explantes serão solidamente presas e células vão começar a emigrar. Neste momento agentes farmacológicos podem ser adicionados aos meios de comunicação. </li><li> 48 h após o plaqueamento, as células migraram a partir dos explantes. A distância migrada pode ser visualizada e impressa. Nós normalmente parar a cultura neste ponto desde explantes começam a mostrar sinais de viabilidade diminuiu com incubações mais longos. Um corante vital tal como laranja de acridina ou azul tripano pode também ser usado para verificar a viabilidade do explante. </li><li> Neste ponto, as imagens podem ser adquiridas para documentar a distância e o número de células que migram a partir do explante. Alternativamente, se explantes foram semeadas em lamelas,eles podem ser corrigidos e as análises de imuno-histoquímica realizada para visualizar as proteínas de interesse. </li></ol> Etapas críticas no protocolo <ol><li> Cortar os explantes de aproximadamente o mesmo tamanho. </li><li> Limpar todos os detritos dissecção fora do prato dissecar como você está dissecando para evitar detritos confuso com o tecido desejado explantado. </li><li> Quando explantes revestimento em poços ou em lamelas se esqueça de colocar gota de mídia com explante no centro de bem. </li><li> Permitir explantar tempo suficiente para prender antes de inundar o bem com a mídia. </li><li> Condições de tratamento deve ser padronizado para cada substrato de teste e agente farmacológico usado. </li><li> Dois explantes podem ser feitas a partir de cada embrião (um do lado esquerdo e uma do lado direito do tubo neural). </li><li> Ao testar a migração de células a partir de linhas de ratinhos mutantes em diferentes condições experimentais, colocar um explante mutante no grupo de controlo e outro do grupo tratado. </li></ol> Solução de problemas <ol><li> Se explantes não anexar, aumentar o tempo previsto para a fixação. Na nossa experiência, cerca de metade dos explantes não atribuem e explantes maiores aderir de forma mais eficiente. </li><li> Se explantes anexar a periferia do poço que será difícil de imagem. Certifique-se de colocar explantes no centro do poço. </li><li> Idealmente explantes serão de aproximadamente o mesmo tamanho. No entanto, diferenças no tamanho do explante pode ser corrigido para a utilização do diâmetro dos explantes como um factor de correcção, quando quanitating migrações de células a partir de explantes. </li><li> Se ocorrer contaminação ter certeza estéreis as condições de trabalho estão sendo usados. Todas as ferramentas e superfícies de trabalho devem ser esterilizados com etanol a 70%. Pipetas e placas de Petri devem ser nova e estéril. </li><li> Se explantes estão se perdendo durante a dissecção, periodicamente, remover detritos para evitar a perda de explante. </li><li> Dominando a dissecção é demorado e requer prática. Optimal ampliação, afiados instrumentos de dissecação e ajuda de agulhas. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método aplicado aqui proporciona um ensaio poderoso para examinar o comportamento das células mesenquimais cranianos. Além das análises estáticas aqui apresentados, ao vivo, em experimentos com imagens de campo claro ou em combinação com a expressão de proteínas marcadas com GFP pode ser utilizado para analisar o comportamento de células em tempo real à medida que migram a partir do explante. Para as experiências de imagens ao vivo, os explantes podem ser rotulados com DiI ou para diferenciar a migração de crista neural da mesoderme paraxial, ROSA-YFP; Mesp1-cre ou ROSA-YFP; Wnt1-cre ou outras linhas transgénicas poderiam ser utilizados. Cranianos mesênquima ECM interações também podem ser examinados utilizando este ensaio explante. Aqui nós explantes placa em substratos diferentes de ECM que estão presentes no mesênquima craniana para mostrar que as células migram sobre estes a diferentes graus, e que a ECM influencia a morfologia das células. Além disso, os explantes podem ser incorporados numa matriz tridimensional para acessar os comportamentos de cells neste contexto. Este ensaio de explante pode ser alterada para análise do efeito de manipulações genéticas e farmacológicas sobre comportamentos mesênquima cranianos para analisar sinais intrínsecas e extrínsecas que podem regular a migração e modificar. Por exemplo, utilizou-se este ensaio em nossos estudos de discernir a função de secreção de Hsp90 em excesso nos comportamentos anormais celulares em Hectd1 mesênquima mutante craniana 15. Nestas experiências, foram tratados explantes com anticorpo anti-Hsp90, Hsp90 proteínas, geldanamicina e DMA (amelioride dimetil) para bloquear a secreção de Hsp90 para demonstrar que o comportamento anormal de células mutantes Hectd1 é devido ao excesso de Hsp90 extracelular 15. Uma abordagem semelhante pode ser usada para dissecar farmacologicamente vias adicionais subjacentes morfogénese normal ou anormal do mesênquima cranial. Uma vez que o ensaio é completado, os explantes e células migratórias podem ser analisados ​​por uma série de métodos. Por exemplo, c análises imuno-histoquímicaum ser empregue para examinar a localização de proteínas críticas para a circulação de células. Análises de transcriptoma poderia também ser utilizado para determinar como os tratamentos afecta a expressão do gene. Uma limitação significativa desta técnica é a de que ele não comportamentos modelo em três dimensões, como eles ocorrem in vivo. Modificação do protocolo de explantes onde são incorporados em uma matriz tridimensional (eg matrigel), juntamente com a expressão da proteína fluorescente marcadas compartimentos celulares poderia ser empregada necessária para resolver este problema. Mesmo se estas modificações foram realizadas experiências adicionais para correlacionar comportamentos observados neste ensaio ex vivo com os in vivo seria necessário. Outras limitações incluem o grande número de embriões necessários para gerar números suficientes para gerar dados significativos estatisticamente. Mais importante ainda, a dissecção é relativamente simples, mas exige prática para dominar.

Fechamento do tubo neural na região craniana ocorre entre os dias embrionário 8,5 (E8.5) e 9,5 no embrião de rato. Deixar de fechar o tubo neural nos resultados de cabeça em anencefalia, um defeito de nascença estrutural comum em humanos e é incompatível com a vida. As forças que impulsionam fecho do tubo neural cefálica são gerados a partir de amostras de tecido neural e da epiderme circundante e mesênquima 3. Em particular, a expansão do mesênquima craniana é pensado para ser essencial para a elevação de 1,2 dobras cranial neural. O mesênquima craniana é rica em proteínas de ECM em particular proteínas glicosiladas como proteoglicanos de sulfato de heparina, sulfatos de condroitina e hialuronato de 4-8. Ao contrário do embrião de galinha, onde as células da crista neural emigrar do tubo neural após o fecho dorsal do tubo neural, da crista neural no embrião de rato migra ao mesmo tempo que as dobras neurais começam a rise (depois da fase de somito 5). Assim, durante neurulação no embrião de ratinho, o mesênquima crânio é composto de células derivadas da crista neural e da mesoderme paraxial. Crista neural e populações mesoderma paraxial são induzidas em diferentes momentos do desenvolvimento; localizadas em diferentes posições no embrião e se desenvolvem em diferentes estruturas 9,10. A mesoderme paraxial origina da linha primitiva e migra para a região anterior do embrião para a base da placa neural presuntivo. A crista neural é induzida na junção da placa neural e ectoderme epidérmica, sofre uma transição epitelial para mesênquima e delamina imediatamente antes da elevação dobra neural do embrião de roedor. Células da crista neural migram ao longo de caminhos estereotipados no mesoderma paraxial subectodermal ao arco branquial, frontonasal e mesênquima periocular. A mesoderme paraxial contribuirá para alguns dos ossos da calota crânio e músculos do rosto, enquanto ªe crista neural contribuirá para outros ossos do crânio e face, além de nervos cranianos 9-11. A mesoderme paraxial e linhagens da crista neural podem ser diferencialmente marcada pela Mesp1-CRE-CRE e Wnt1 linhas de camundongos transgênicos, respectivamente 9. O papel essencial do mesênquima cranial em fechamento do tubo neural foi inferida a partir de experiências em que o tratamento de embriões de roedores com ECM perturbar agentes tais como hialuronidase, condroitinase ABC, heparitinase ou Diazo-oxo-norleucina (DON) durante neurulação fecho do tubo neural prejudicada 7, 12-14. Nestas experiências, a análise histológica de secções de sequência estáticos neurulação revelou dysmorphogeneis associados do mesênquima cranial 7,12-14. No entanto, uma vez que o agente teratogénico tiveram acesso a vários tecidos, que continua a ser determinado se o mesênquima craniana é realmente o tecido alvo. Em apoio à conclusão de que este tecidoé essencial para a neurulação, o mesênquima craniana anormal aparece nas análises histológicas em alguns mutantes do mouse com exencefalia 15-17. Mesmo assim, na maioria dos casos, o efeito da mutação sobre o comportamento celular do mesênquima cranial não foi tratada. Concebemos um ensaio ex vivo do explante para examinar directamente a consequência de uma mutação genética ou manipulação farmacológica sobre o comportamento das células mesenquimais cranianos 15. Este ensaio é semelhante ao publicado por Tzahor et al 2003 para aceder ao potencial de diferenciação do mesênquima subjacente cranial as 18 rhombomeres excepto que modificaram o dissecção explante para estudar as propriedades migratórias de populações mais anterior do mesênquima que estão na base do crânio neural anterior placa. O nosso método é também uma modificação dos ensaios de explante realizado no embrião de galinha para analisar o comportamento migratório da crista neural com kediferenças y. Preparações anteriores explantado da crista neural ou o mesoderma paraxial mais posterior 19,20. Além disso, durante a elevação dobra neural do embrião de galinha, a crista neural ainda não migraram a partir do tubo neural dorsal e, assim, explantes tomadas da mesoderme paraxial anterior não contêm células da crista neural. No nosso ensaio, explantes mesênquima cranianos consistindo de mesoderma paraxial, crista neural e ectoderme superfície são preparadas e semeadas sobre um substrato. Manipulação experimental, incluindo isolamento a partir de explantes de mutantes genéticos, plaqueamento de explantes em ECM diferente ou tratamentos farmacológicos pode ser realizada. As células migram a partir do explante e da distância, o número e o comportamento pode ser analisado e comparado entre os grupos de tratamento. Além disso, esta preparação pode ser alterada para análises de migração celular por meio de técnicas de imagiologia vivos. Após a experiência da migração, os explantes podem ser fixados e submetidos a imunohistoquímica para pelesTher elucidar o efeito dos tratamentos. De um modo geral, o protocolo aqui apresentado é um ensaio in vivo simples ex para investigar o comportamento do mesênquima cranial. Como um experimento representativo, utiliza-se este ensaio para analisar a migração do mesênquima cranial em diferentes substratos extracelulares.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

O sistema nervoso central é derivado da placa neural que sofre uma série de movimentos morfogenéticos complexos resultantes da formação do tubo neural em um processo conhecido como neurulação. Durante a neurulação, a morfogênese do mesênquima que está na base da placa neural é acreditado para conduzir elevação vezes neural. O mesênquima craniana é composta da mesoderme paraxial e células da crista neural. As células do mesênquima cranial forma uma malha composta por pourous estreladas células em forma e mistura da matriz extracelular (ECM) que suportam os fios dobras neurais. Durante a neurulação, o mesênquima craniana sofre rearranjos estereotipadas, resultando em sua expansão e esses movimentos são acreditados para fornecer uma força motriz para a elevação vezes neural. No entanto, os caminhos e comportamentos celulares que levam morfogênese mesênquima craniana permanecem pouco estudados. As interacções entre a ECM e as células do mesênquima os cranianos thes underlycélulas de comportamentos e. Descrevemos aqui um simples ensaio ex vivo do explante concebido para caracterizar o comportamento dessas células. Este ensaio pode ser alterada para manipulações farmacológicas para dissecar a vias de sinalização envolvidos e as análises de imagem em tempo real para caracterizar ainda mais o comportamento dessas células. Apresenta-se um experimento representativo que demonstra a utilidade deste ensaio para caracterizar as propriedades migratórias do mesênquima cranial em uma variedade de componentes da matriz extracelular.

O aparecimento de células que migram a partir de explantes de mesênquima crânio é mostrado na Figura 2. Testamos a migração em vários substratos ECM que estão presentes no mesênquima craniana durante neurulação incluindo fibronectina (100 mg / ml, Sigma # F1141), laminina (100 mg / ml, Sigma # L2020), ECM MaxGel (diluição 1:500 em DMEM ; Sigma # E0282) e ácido hialurónico (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Células não migrar do explante, quando não está presente ECM (dados não mostrados) e de todos os substratos testados migração das células suportado. Tanto a forma como o bem como o tamanho das células que migram a partir dos explantes depende do substrato. Isto é esperado que os estudos prévios demonstraram que as forças mecânicas geradas pela interacção das células com a ECM diferente afetar tanto a forma e as propriedades das células migratórias 21. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg /&quot; /&gt; Figura 1. Preparação de explantes. (A) Para preparar explantes, E8.5 embriões são dissecados de deciduas e tecidos extraembryonic. (B) as cabeças de Embriões são dissecados a partir do corpo anterior aos rhombomeres. Os explantes são preparados por remoção de tecido a partir da linha média e os bordos exteriores da cabeça de remover a placa precordial na linha média e a crista neural e premigratory ectoderma superficial na fronteira, respectivamente. (C) Os explantes são preparadas cortando-se o tecido a partir das bordas da linha média e exterior da cabeça de remover a placa precordial na linha média e a crista neural e premigratory ectoderma superficial nas fronteiras. (D) Os explantes são colocados em um pequeno volume de meio em placas revestidas com MEC / lamelas e deixadas a ligar, antes da adição de mais mídia. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> Figura 2. Explantes de migração das células mesenquimais do crânio a partir de explantes, semeadas em diferentes substratos. Foram semeadas em fibronectina, laminina, ECM MaxGel ou ácido hialurónico e fotografadas após 48 h em cultura. Barra size = 200 mm.

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An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas neurais<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Aqui nós descrevemos um simples<em&gt; Ex vivo</em&gt; Explantar ensaio para caracterizar os comportamentos celulares do mesênquima craniana durante neurulação. Este ensaio tem inúmeras aplicações, sendo inclusive passível de manipulações farmacológicas e análises de imagens ao vivo.

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.7K visualizações.  Children's National Medical Center. O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas neurais 1,2. Aqui nós descrevemos um simples Ex vivo Explantar ensaio para caracterizar os comportamentos celulares do mesênquima craniana durante neurulação. Este ensaio tem inúmeras aplicações, sendo inclusive passível de manipulações farmacológicas e análises de imagens ao vivo.

Vídeo: An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Biologia

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Toxicidade celular de Nanogenomedicine em MCF-7 Linhagem Celular: MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Fabricação e operação de uma inserção de oxigênio para culturas de células aderentes

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogênica Ensaio: células aderentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...