Todos os experimentos foram realizados sob a supervisão da Animal Care Purdue e do Comitê do Programa de Uso e Animais de Laboratório da Universidade Purdue. Este trabalho foi patrocinado pela Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Tecnologia Office (OMP), sob os auspícios do Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil), como parte do Programa de Tecnologia de confiança Neural, através de Espaço e Guerra Naval Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No. N66001-11-1-4013. Os autores gostariam de agradecer Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor e Kevin Eliceiri para compartilhar seus conhecimentos microscopia.

Soluções Tampão fosfato salino (PBS) -, em g / l, 9 g de NaCl, 0,144 g de KH 2 PO 4, 0,795 g de Na 2 HPO 4, pH 7,4 O formaldeído a 4% - em ml / l; 202 ml de fosfato de sódio dibásico solução (0,4 M de Na 2 HPO 4), 48 ml de fosfato de sódio monobásico solução (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml de solução de formaldeído a 8%, 250 ml de água Milli- Q DDi água, a pH 7,4 HEPES salino tamponado de Hank com azida de sódio (HBHS) -, em g / l, 7,5 g de NaCl, 0,3 g de KCl, 0,06 g de KH 2 PO 4, 0,13 g de Na 2 HPO 4, 2 g de glucose, 2,4 HEPES g, 0,05 g de MgCl2 6 partes de H 2 O, 0,05 g de MgSO 4 7 partes de H 2 O, 0,165 g de CaCl2, 0,09 g de NaN3, pH 7,4 Solução de Lavagem (WS) - 1% vol / vol, nemsoro de cabra normal, 0,3% de Triton X-100, em HBHS com azida de sódio (NaN3). Refrigerar a WS a 4 ° C antes da sua utilização nos passos subsequentes. U2 Sca l Solução e - ureia 4 M, glicerol a 30% e 0,1% de Triton X-100 17 PROCEDIMENTO Todos os experimentos foram realizados sob a supervisão da Animal Care Purdue e do Comitê do Programa de Uso e Animais de Laboratório da Universidade Purdue. 1. Cirurgia <ol><li> Vários métodos cirúrgicos assépticos são compatíveis com o método apresentado histológica. O uso de uma armação estereotáxica e inserters automatizados são recomendados para melhorar a reprodutibilidade e controlo das matrizes de microeletrodos (MEA) Ângulo de implante em relação aos planos estereotáxicas. </li></ol> Nota: Nesta demonstração o nosso método cirúrgico é a seguinte: manter o sujeito em roedor estereotáxico earbars while sob anestesia isoflurano (entre 1-3%) realizadas pelo oxigênio da classe médica. Teste para a falta de um dedo do pé pinch-reflectir no rato ou a falta de um reflexo de aperto da cauda no ratinho para confirmar que o animal é completamente anestesiada. Aplicar pomada e limpar o local da cirurgia, com três lavagens alternadas de Betadine e álcool. Lavar as mãos, luvas cirúrgicas, hairnet madrugada, máscara e bata. Injetar um bolus de Lidocaína para anestesiar a área cirúrgica, criar uma incisão com tesoura ou periósteo, bisturi claro com raspador de osso e aplicadores de algodão, e criar uma craniotomia usando uma peça de mão broca de dentista e broca. Dirija um MEA haste única para o córtex usando um micromanipulador. Ter uma ajuda assistente cirúrgico para manter condições cirurgia asséptica e documentar o andamento da cirurgia. <ol start="2"><li> Após a implantação da MEA no cérebro, recolha de imagens por meio de um microscópio cirúrgico, para informar a eventual remoção do crânio a partir de em torno do bchuva. Porções dos dispositivos implantados serão preservados in situ. </li></ol> Nota: A recolha eventual de tecido com os dispositivos in situ baseia-se no que segue de perto o plano da inserção do dispositivo com o plano de seccionamento de tecidos. Notas detalhadas sobre o plano de inserção do dispositivo em relação ao cérebro, são, portanto, muito importante. <ol start="3"><li> Após o procedimento, aplique o elastômero de silicone Kwik-Sil (WPI), em torno de todo exposto MEA hastes ou cabos, e deixar curar. A peça de plástico esterilizado, tal como uma ponta de pipeta de corte, pode ser usado para ajudar a conter o elastómero de silicone em um pequeno poço em torno da craniotomia enquanto cura. </li><li> Aplique uma camada de duas partes em acrílico dental (&quot;Liquid Jet&quot; e &quot;Pó Jet&quot; de Lang Dental) sobre o Kwik-Sil e qualquer crânio exposto. </li></ol> Nota: Num passo posterior, o headcap vai ser derretido através de permitir que o implante seja separadoa partir do crânio. De cura UV acrílico devem ser evitados durante a Kwik-Sil e craniotomia, como esta acrílico duro é difícil de remover mais tarde. Materiais com visual opaco ao redor do implante também devem ser evitados; clara Kwik-Sil fornece uma visão do implante durante as etapas subseqüentes deste protocolo. <ol start="5"><li> Realizar procedimentos de cuidados pós-operatórios de acordo com o protocolo local dos regulamentos bem-estar animal, e retornar assuntos ambulatoriais a única alojados gaiola-boxes. </li></ol> 2. Perfusão e coleta de tecido Nota: Veja Gage et al. para um passo a passo detalhado de perfusão procedimento no modelo animal de ratos 19. <ol><li> Use a anestesia e perfusão protocolo aprovado pelo cuidado da instituição animal e comitê de uso. Após profundamente anestesiar o roedor (confirmado por uma falta do dedo pinch-reflexo em ratos ou cauda pinch-reflexo em camundongos) e expor o coração, fazer cortes rasos de tesoura empara o ventrículo esquerdo e átrio direito. Inserir uma agulha romba para dentro do ventrículo esquerdo e entregar temperatura ambiente PBS. Fornecer um total de ~ 10 ml de PBS a ~ 5 ml / min, em ratinhos, e ~ 200 ml de PBS a ~ 100 ml / min, em ratos. Olhe para depuração do sangue do fígado durante. </li><li> Injectar etiquetas químicas relevantes transcardially histologicamente, se assim for desejado, por entrega de seringa com o cuidado de evitar a introdução de bolhas de ar. </li></ol> Nota: As etiquetas vasculares (por exemplo, dii) e corantes de ácidos nucleicos, por exemplo, para contraste (Hoechst 33342) são exemplos de etiquetas químicas administráveis ​​durante a perfusão. Quando administrado corretamente, esses marcadores histológicos deve rotular o animal inteiro 20. <ol start="3"><li> Entregar temperatura ambiente tamponado, formaldeído 4% transcardially para fixar o animal. Evitar perfuração do septo através do coração, que pode ser evidenciado pelos pulmões nariz de drenagem durante a perfusão. Procure por tremores de fixação nos grandes músculospara indicar a perfusão completa. Fornecer um total de ~ 10 ml de fixador em ~ 5 ml / min, em ratinhos, e ~ 200 ml de fixador em ~ 100 ml / min, em ratos. </li><li> Na sequência de perfusão, decapitar o animal, expor parte do tronco cerebral ou cerebelo usando fórceps, tesouras, e cabeça lugar em solução de formaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lava-se a cabeça em três mudas de PBS com um a quatro horas de intervalo entre as lavagens. </li><li> Armazenar as cabeças fixas em HBHS contendo azida de sódio a 4 ° C durante dias a meses. </li></ol> 3. Remoção cérebro com Dispositivos situ Nota: Execute esta seção em uma coifa enquanto usava equipamento de proteção individual. Evitar a dessecação dos tecidos, devolvendo a cabeça fixa para HBHS solução periodicamente. <ol><li> Dissecar cuidadosamente afastado pele e outros tecidos de todo o gorro acrílico com pinças e tesouras pequenas. </li><li> Quando estiver usando o calor-iluvas nsensitive, utilizar um ferro de solda para remover acrílico dental e expor uma área de subjacente claro Kwik-Sil (Figura 2a). </li></ol> Nota: O objectivo deste passo é o de permitir que os micro-tesouras um ângulo adequado de acesso a posições em que os dispositivos implantados entram no cérebro, de modo que os componentes implantados cerebrais pode ser separado a partir de componentes fixados ao crânio. <ol start="3"><li> Sob um microscópio cirúrgico, cortado em elastómero de silicone com curvas micro-tesoura, removendo pequenos pedaços de Kwik-Sil, com uma pinça para baixo para a posição em que os dispositivos de entrar no cérebro. </li><li> Continuar o corte ao longo da superfície da craniotomia com curvas micro-tesoura para separar componentes do dispositivo ligados a silício policristalino e do crânio a partir de componentes implantados no cérebro. Mais uma vez usar a ampliação microscópio e muito cuidado ao cortar as componentes do dispositivo expostos, tomando cuidado para evitar empurrando ou arrastando o implants no tecido fixado. </li><li> Remover o osso ao redor do headcap com cuidado usando fórceps. Usar uma espátula para separar o cérebro com os dispositivos implantados no crânio. Guarde o cérebro em solução HBHS até estar pronto para cortar. </li><li> Colocar o cérebro de uma placa de Petri de vidro cheio de HBHS, e utilizar uma lâmina de barbear para remover tecidos estranhos, tais como medula, cerebelo, bulbo olfativo ou, dependendo de se são relevantes para o local de implantação do dispositivo. Usar um bloco cérebro (Ted Pella) e lâminas de barbear para a secção do cérebro e criar uma superfície plana que segue de perto o ângulo dos dispositivos implantados, o que é conseguido através da colocação do cérebro em um bloco de cérebro de tamanho apropriado, orientando o cérebro de tal modo que qualquer porção visível do implante é paralelo com a guia de lâmina de barbear, e a colocação de uma lâmina de barbear de uma lâmina de guia de pelo menos 2 mm a partir do implante. Pressionar a lâmina através do tecido. Montar esta superfície para uma plataforma de vibratome. Alternarespectivamente, uma lâmina de barbear montada de um micromanipulador pode ser usado de uma forma semelhante como o controlo de bloco cérebro para criar um plano que segue de perto a direcção do implante. </li><li> Lugar de gelo sob a plataforma vibratome, e, depois de permitir que a superfície do tecido para secar brevemente sobre uma toalha de papel, aderir o cérebro para um vibratome usando Super Glue. Cola ao plano do tecido liso criado na etapa anterior é o estágio. Com as dimensões de tecido assimétricos, orientar a amostra de tal modo que a maior dimensão é colado para baixo em paralelo com a direcção do movimento da lâmina de vibratome para ajudar a evitar que a lâmina potencialmente batendo o tecido acabado. Depois dos conjuntos de cola (~ 1-2 min), adicionar gelada (~ 4 ° C) ao prato de PBS vibratome em torno do tecido. </li><li> Colete fatias de tecido de espessura entre 200-400 pm, incluindo o tecido de controlo, utilizando a taxa de vibração máxima (~ 100 Hz) e uma taxa de progressão lenta da lâmina (&lt;0,2 mm por segundo), com um ângulo da lâmina de 10 ° a partir de horizontal. Colete fatias cuidadosamente com uma espátula de escova ou colher e armazenar em HBHS em uma placa de 24 poços a 4 ° C. </li><li> Uma vez que o dispositivo em situ é visível a olho nu ou um microscópio cirúrgico, recolher as secções mais finas para se aproximar do dispositivo em incrementos de fatias de 100 um ou menos. </li></ol> Nota: típicos de silicone micro-implantes são visíveis a olho nu em formaldeído fixo tecido do córtex cerebral de roedor, entre 300 e 500 um a partir da superfície do dispositivo. <ol start="10"><li> Com o dispositivo em situ agora próximo da superfície do tecido, recolher uma fatia de tecido&gt; 250 um, contendo o dispositivo de dentro. Estimativa da espessura necessária pode ser auxiliada por referência fatias previamente recolhidas. </li></ol> Nota: Os dispositivos maiores, dispositivos multidentes e dispositivos angulares podem exigir cortes mais finos de tecido (&gt; 500 um) para capturar o dispositivo de uma só peça de tecido; remembro que tanto a penetração de rótulos aplicados ea profundidade imagens de microscopia será limitado na coleta de dados eventual dessas fatias muito grossas. Se possível, evitar a colidir com o dispositivo, com a lâmina vibratome, pois pode provocar a arrastar do dispositivo através da deformação do tecido e morfológicas. 4. Processamento de tecidos e de Compensação <ol><li> Lavar 3x em fatias de 5 minutos por lavagem em HBHS </li><li> Incubar em borohidreto de sódio (5 mg NaBH 4/1 ml de HBHS) para 30 total min (15 min cada lado da fatia). Virar as fatias usando um aço inoxidável ou Teflon colher revestido de micro e pequeno pincel (Ted Pella). Movimentos lentos e pensativo melhorar o sucesso de cada flip fatia. Evite tocar em todas as áreas em torno do dispositivo implantado com a escova. Quando possível, adicionar a solução de significativamente mais do que o necessário (&gt; 2 ml) permite manipular e virar as fatias de tecido mais facilmente. </li></ol>Nota: Esta etapa reduz endógena autofluorescência; pular esta etapa se etiquetas fluorescentes foram aplicados durante a perfusão ou XFP marcadores transgênicos estão presentes. <ol start="3"><li> Lavar 3x em fatias de 5 minutos por lavagem em solução de lavagem à temperatura ambiente. </li></ol> Nota: agitação durante as etapas de lavagem e de incubação é opcional. Os autores especulam que subtil brusco do implante rígida em relação ao tecido cerebral circundante pode ocorrer com agitação. No entanto, um misturador orbital em movimento a uma velocidade suave (&lt;rpm 60) pode evitar este enquanto aumenta o movimento de soluções. <ol start="4"><li> Bloquear, durante 2 horas em solução de lavagem à temperatura ambiente (fatias aleta depois de uma hora). </li><li> Incubar em anticorpos primários (diluído em solução de lavagem) durante cerca de 48 h (24 h de cada lado da fatia) a 4 ° C. </li><li> Executar 6 3 lavagens rápidas min com a solução de lavagem. </li><li> Executar 6, 1 hora (3 lavagens lavagemes em cada lado da fatia de tecido), em solução de lavagem (armazenar a 4 ° C durante a noite, se lavar). </li><li> Incubar em anticorpos secundários (diluído com solução de lavagem) durante cerca de 48 h (24 h de cada lado) de 4 ° C. </li><li> Executar 6 3 lavagens rápidas min com a solução de lavagem. </li><li> Executar 6, 1 hr lavagens (3 lavagens de cada lado) na solução de lavagem; armazenar a 4 ° C durante a noite, se lavar. </li><li> Remover Solução de lavagem e adicionar o glicerol-based &quot;U2 - Sca l e&quot; solução de compensação. Permitir a limpar a cerca de 1 semana para rodelas grossas (250-500 um) ou 2-3 semanas para as secções de tecido de grande espessura (&gt; 500 um), a 4 ° C. </li><li> Cobrir a placa com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C. </li><li> Montar em lâminas acomodando cortes de tecidos de espessura (Figura 2b, 2c) usando uma solução de limpeza como meios de montagem e selagem com unha polonês claro. Armazenar a 4 ° C ao abrigo da luz. </li></ol> 5. Panorama Imagem de Full TiInterface de ssue e Dispositivo <ol><li> Usando mais-trabalho objetivos distância microscópio (&gt; 2 mm), começam imagem com um laser microscópio confocal ou dois fótons microscópio. Nós vamos demonstrar com um LSM Zeiss 710, lente Carl Zeiss software &quot;Zen&quot; (2010), e um estágio XY controlada por computador traduzindo a imagem de um panorama 3D em torno de um implante. </li></ol> Nota: correto para o índice de refração da solução de limpeza ou em software, através de uma coleira corretiva sobre o objectivo, ou em processamento de dados após a coleta. Nesta demonstração entramos em um valor de índice de refração para a solução de compensação &quot;U2&quot; de 1,4 para o software Leica microscópio Zen; esta definição sutilmente ajusta z-passo intervalos para contabilizar incompatibilidade índice de refração. <ol start="2"><li> No tecido perto do dispositivo, cerca de avaliar as apropriadas do eixo z definições da janela e coleta de dados do z-dimensão para cada canal fluorescente usando laser de baixa potência (~ 00,5-5%) e grandes z-passo tamanhos (&gt; ^ M 25). </li></ol> Nota: Inclua um espaço adicional acima e abaixo ao definir o eixo z ao configurar a coleta de dados panorâmica, como o tecido não pode ficar inteiramente plana no vidro do carro (~ 20 um em cada direção). <ol start="3"><li> Estabeleceu o objectivo no centro xy do panorama eventual, usando o software panorama Zen, determinar o número de posições de coleta necessários para cada eixo (X e Y) para cobrir a sua região de interesse. </li><li> Reavaliar e finalizar a coleção janela eixo z. </li><li> Definir manualmente a sensibilidade do detector de potência de laser e a rampa de forma adequada com maior profundidade, o objectivo é, tipicamente, de manter aproximadamente o mesmo a intensidade da imagem, independentemente da profundidade de imagem na direcção da fatia de tecido, mas também para evitar o ruído de fundo elevado. </li><li> Recolher cada imagem fluorescente série de dados. Se necessário, para evitar a sobreposição de sinais, executar linha de lasers seqüencialmente. </li></ol> Nota: Se estiver disponível, ajustar o software para salvar automaticamente os dados para o disco rígido durante a coleta. <ol start="7"><li> Altere as configurações de software para coletar o &quot;reflexão&quot; e &quot;transmitância&quot; de dados, e usar um mais longo, comprimento de onda mais penetração (por exemplo, 633 nm) para captar esses canais. Determinar a potência do laser apropriado e sensibilidade do detector de &quot;reflectância&quot; e &quot;transmitância&quot; recolha e repetir a mesma série recolha em torno do dispositivo implantado. </li><li> Exportar os dados para posterior processamento, quantificação e análise. </li></ol>

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	<li>Schwartz, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Neural+Prosthetics.">Cortical Neural Prosthetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).</li><li>Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+Insight:+future+neuroprosthetic+therapies+for+disorders+of+the+nervous+system.">Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system.</a> Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).</li><li>Rousche, P., Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+recording+capability+of+the+Utah+Intracortical+Electrode+Array+in+cat+sensory+cortex.">Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).</li><li>Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal,+longitudinal+assessment+of+intracortical+microstimulation.">Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation.</a> Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).</li><li>Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstimulation+in+auditory+cortex+provides+a+substrate+for+detailed+behaviors.">Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors.</a> Hearing Research. 210, 112-117 (2005).</li><li>Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+planar+multisite+microprobes+in+recordingextracellular+single-unit+intracortical+activity.">Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+interface+between+neural+tissue+and+chronically+implanted+intracortical+microelectrodes.">Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes.</a> IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).</li><li>Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+impedance+spectroscopy+for+monitoring+tissue+responses+to+inserted+neural+implants.">Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants.</a> J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).</li><li>Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes.">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).</li><li>Szarowski, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+responses+to+micro-machined+silicon+devices.">Brain responses to micro-machined silicon devices.</a> Brain Research. 983, 23-35 (2003).</li><li>McConnell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+neural+electrodes+cause+chronic,+local+inflammation+that+is+correlated+with+local+neurodegeneration.">Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration.</a> J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).</li><li>Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intact+interface+between+neural+tissue+and+implanted+microelectrode+arrays.">Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays.</a> J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).</li><li>Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-film+silica+sol-gel+coatings+for+neural+microelectrodes.">Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).</li><li>Wilks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(3,4-ethylene+dioxythiophene)+(PEDOT)+as+a+micro-neural+interface+material+for+electrostimulation.">Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation.</a> Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+voltage+biasing+improves+unit+recordings+by+reducing+resistive+tissue+impedances.">Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances.</a> IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).</li><li>Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+pulses+change+neural+interface+properties+and+improve+unit+recordings+with+chronically+implanted+microelectrodes.">Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+characterization+of+the+brain-microdevice+interface+using+Device+Capture+Histology.">In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li><li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Tissue+Fluorescent+Imaging+in+Scattering+Specimens+Using+Confocal+Microscopy.">Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).</li><li>Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Biasing,+Cyclic+Voltammetry,+&amp;+Electrical+Impedance+Spectroscopy+for+Neural+Interfaces.">Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, &amp; Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces.</a> J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).</li></ol>

Os autores não têm divulgações relevantes para declarar, financeira ou outra.

O &quot;dispositivo de captura-Histologia&quot; método (DCHist) demonstraram aqui permite a avaliação histológica perto de interações morfologia preservada entre o tecido cerebral e implantes de tecidos. Recolha de tecidos DCHist requer a separação cuidadosa dos componentes montados no crânio do dispositivo a partir de componentes implantados no cérebro. DCHist também exige a coleta de uma fatia de tecido grosso histológico (&gt; 250 mm). Estes cortes de tecido, uma vez rotulado, limpo, montado, e com imagens, pode fornecer informações novas para a implantação ou lesão resposta crônica após a dispositivos de longa permanência. Usando ferramentas avançadas de microscopia, a interface entre o tecido e o dispositivo pode ser trabalhada e analisada em grande detalhe, como mostrado nas Figuras 3-5. As técnicas apresentadas na sua forma actual contam com a capacidade de, lentamente, embora a escavar headcap feita a partir de duas partes de cimento dentário e Kwik-Sil para baixo para o ponto de implantação do dispositivo.Utilizando cimento dental que pode ser gravado ou de outro modo removida para longe e um elastómero de silicone transparente através da qual pequenas tesouras pode ser guiado visualmente auxiliar muito sucesso em separar o dispositivo implantado a partir dos seus componentes montados no crânio. A tentativa de cortar o dispositivo sob o crânio acima do cérebro e, a fim de recolher lo in situ não é recomendado, porque o implante crânio montado irá ser puxado para fora do cérebro, de uma quantidade significativa. Embora mais finos, implantes menores, tais como AAM haste individuais de NeuroNexus, são mais passíveis de DCHist, os princípios não estão restritos a hastes de dispositivos individuais ou matrizes de microeletrodos. Recolha e estratégias de imagem são amplamente aplicáveis ​​a haste multi-dispositivos e implantes maiores, tais como cânulas, com os requisitos é que eles devem ser separados a partir de qualquer montagem do crânio e recolhido dentro de uma secção de tecido de espessura. Embora os autores estão focados na análise do tecidocircundantes implantes corticais, dispositivos movidos mais fundo no cérebro também pode ser recolhida e trabalhada. A profundidade de inserção do implante não deve afectar a captura do implante de uma fatia, desde que o dispositivo não se desviar muito de o ângulo de inserção conhecidas. Existem limitações à aplicação útil do método DCHist. Seções de tecido cerebral são difíceis de imagem através de centenas de micrômetros, especialmente nas áreas de substância branca, embora as soluções de compensação óptica pode melhorar muito profundezas de imagem em vários tecidos 21. Para melhorar ainda mais a profundidade de imagem, de dois fotões microscopia de excitação podem ser empregues juntamente com a limpeza óptica descrita. Outra limitação potencial do método descrito podem ser os métodos específicos e anticorpos imuno fluorescentes utilizados pelos investigadores. Difusão passiva normalmente dirige a incorporação destes marcadores através de tecido fixadoe em sites de ligação a antígenos. As concentrações finais de anticorpo de trabalho deve ser determinada por investigadores numa base caso a caso para maximizar a penetração da etiqueta, evitando níveis elevados de etiquetagem de fundo. Rotulagem de anticorpos não deve ser variável entre fatias que são processados ​​de forma idêntica, mas de diferentes anticorpos podem variar consideravelmente na sua capacidade de penetrar e marcar o seu antigénio, com alguns anticorpos facilmente etiquetar antigénios muitas centenas de micrómetros de profundidade e de outros antigénios de etiquetagem apenas dezenas de micrómetros de profundidade. Descrevemos melhorar esta difusão por aplicação de etiquetas de anticorpos em concentrações superiores típicos, com vários dias de aplicação, e de uma solução contendo detergente diluído e bloqueio de soro. Periodicamente lançando as fatias também promove ainda rotulagem. Passos de recuperação de antigénio e os processos de fixação adicionais (por exemplo glutaraldeído microondas, etc) pode ser adequado para antigénios específicos. Anticorpo secundário fluoroch-conjugados roma pode também variar no seu desempenho rotulagem de espessura, embora isto não tenha sido observado pelos autores usando rótulos de Alexa Fluor da Invitrogen. Alternativamente, os indivíduos animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em tipos de células de interesse pode ser utilizada para evitar problemas com a penetração etiqueta de anticorpo, tal como muitas proteínas fluorescentes, tais como eGFP, conservam a sua fluorescência após tratamento com formaldeído, e pode ser imediatamente visualizado em secções de tecido. DCHist é um poderoso conjunto de técnicas para capturar e analisar o impacto de microdispositivos implantados no tecido cerebral. Acoplamento este protocolo histológico com in vivo de avaliação de qualidade e de eletrofisiologia de dados de eletrodos de impedância 22 poderia melhorar muito a nossa compreensão das fontes biológicas de variabilidade fisiologia e degradação. O campo de dispositivos implantados protéticos neurais em particular, podem beneficiar com a detalhada DCHist imaging da interface de dispositivo / tecido intacto para informar um maior desenvolvimento de dispositivos biologicamente neutros MEA.

O campo de pesquisa tem como objetivo neuroprótese para ajudar as pessoas que sofrem de várias deficiências e transtornos ignorando estruturas doentes ou danificadas no corpo através de interface SNC 1,2 dispositivos. Microdispositivos Brain-implantados, tais como matrizes de microeletrodos (MEA), pode ser utilizado para gravar ou estimular as estruturas cerebrais e, assim, permitir o estabelecimento de longo prazo interfaces entre electrónica e tecido do SNC 3-5. MEAs penetrantes, os dispositivos que são conduzidos para o tecido cerebral, em particular como uma promessa bidireccionais interfaces devido à proximidade em que se apresentam os eléctrodos a um conjunto relativamente pequeno de neurônios próximos 6. No entanto, as respostas complexo tecido resultam da implantação a longo prazo de MEAs penetrantes, muitas vezes resultando em variáveis ​​e gradualmente degradar electrofisiológicas sinal-para-ruído mais dias ou meses, e um aumento na impedância eléctricadade entre os sites de eletrodos e terra 7,8. As origens putativas destas alterações incluem a activação de microglia, astrocitose reactiva ao longo dos microdispositivos, e uma perda ou migração de neurónios a partir do tecido circundante para dispositivos implantados 9-11. Um grande desafio para a compreensão dessas alterações no tecido em torno crônicas AAM, a penetração é a dificuldade na captação de dados histológicos da interface tecido circundante intacto dispositivos cronicamente implantados 12. A análise histológica do tecido com a interface do dispositivo / tecido ainda presente seria melhorar os atuais dispositivo de remoção de protocolos histológicas. Com um dispositivo sem perturbações restante no tecido, o impacto biológico das interacções relativamente subtis, tais como a utilização de revestimentos biocompatíveis 13,14 ou a compensação eléctrica da superfície do eléctrodo, 15,16 podem ser visualizados e analisados ​​em relação ao implante. Here que demonstrar um método para coletar, processar e imagem da interface microdispositivo intacta por análise de microscopia baseada detalhada do tecido cerebral circundante. Neste método, o dispositivo e o tecido cerebral circundante são recolhidos dentro de uma secção de tecido espesso (&gt; 250 um), utilizando um vibratome. Para melhorar a penetração do rótulo histológica para estas rodelas grossas, etiquetas fluorescentes histoquímicos e imuno-histoquímicos são aplicados em concentrações elevadas em soluções contendo soro de bloqueio e um detergente para vários dias. Uma solução de limpeza óptico é utilizado para melhorar a profundidade de imagem de microscopia, eo tecido é montado em dois lados para câmaras de laser subsequente por microscopia confocal 17. Para capturar a interface completa histológica, uma fase controlada por computador é utilizado durante a translação de imagem para recolher z-stack panoramas ao longo do comprimento dos implantes. Além de imagens aplicadas etiquetas de tecido, a coleta de reflexão laser de volta a partir de implantese transmissão de luz através do tecido ajuda ambos localizar a interface do dispositivo em relação ao tecido circundante. Tecidos preparados com este &quot;dispositivo de captura-Histologia&quot; (DCHist) protocolo fornece acesso às imagens morfologia preservada tecido / dispositivo de interações e, assim, melhora a anteriores dispositivo de remoção de protocolos histológicos 18.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> 14533 </td><td> DNA marcador </td></tr><tr><td> Coelho anti-Iba1 </td><td> Wako (Japão) </td><td> 019-19741 </td><td> Anticorpo monócitos </td></tr><tr><td> Acrílico dental </td><td> Lang Dental (vários distribuidores) </td><td> Jet Pó Reparação Prótese e líquido </td><td> Headcap construção </td></tr><tr><td> Kwik-Sil </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> KWIK-SIL </td><td> Cobrindo expostos implantes cranianos </td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 005-000-121 </td><td> Processamento de tecidos </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100-500ml </td><td> Processamento de tecidos </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U4883 </td><td> Limpando solução </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G20225 </td><td> Limpando solução </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Curvas micro-tesoura </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 14208 </td><td> Corte implante antes de remover cérebro </td></tr><tr><td> Giletes </td><td> Ted Pella </td><td> (Vários tamanhos) </td><td> Para utilização com o bloco Cérebro </td></tr><tr><td> Acrílico Cérebro Matrice </td><td> Ted Pella </td><td> 15054 </td><td> Bloco cérebro para criar plano inicial no tecido </td></tr><tr><td> Lâminas de plástico </td><td> Ted Pella </td><td> 260225 </td><td> Tecido de montagem </td></tr><tr><td> Tampa de vidro </td><td> Ted Pella </td><td> (Vários tamanhos) </td><td> Tecido de montagem </td></tr><tr><td> Matrizes de eletrodos </td><td> NeuroNexus </td><td> (Vários modelos) </td><td> AAM exemplo </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1000 S </td><td> Sistema específico usado no método apresentado </td></tr><tr><td> Lâminas Vibratome </td><td> (Vários fornecedores) </td><td></td><td> Coletar fatias </td></tr><tr><td> Placas de 24 poços </td><td> (Vários fornecedores) </td><td></td><td> Armazenamento e processamento de fatias de tecido </td></tr><tr><td> Microscópio confocal com estágio motorizado XY-varredura </td><td> Carl Zeiss Microscopy </td><td> Software Zeiss LSM 710 e &#39;2010 Zen&#39; </td><td> Sistema específico usado no método apresentado </td></tr><tr><td> Ferro de solda </td><td> (Vários fornecedores) </td><td></td><td> Escavação headcap </td></tr></tbody></table>

intact histological characterization of brain-implanted microdevices and surrounding tissue

A investigação sobre o design e utilização de micro-cérebro implantados, como matrizes de microeletrodos, visa produzir dispositivos clinicamente relevantes que interagem com o tecido circundante cronicamente cérebro. Tecido circundante destes implantes é pensado para reagir à presença dos dispositivos ao longo do tempo, o qual inclui a formação de um isolante &quot;cicatriz glial&quot; em volta dos dispositivos. No entanto, a análise histológica destas alterações do tecido é normalmente realizado após o explantar dispositivo, num processo que pode perturbar a morfologia do tecido de interesse. Aqui demonstramos um protocolo em que os dispositivos implantados-corticais são recolhidos em torno intacto tecido cerebral dos roedores. Descrevemos como, uma vez perfundidos com fixador, os cérebros são removidos e cortados de modo a evitar a dispositivos explantar. Nós delineamos rotulagem anticorpo fluorescente e métodos de compensação óptica úteis para a produção de um tecido, informativo ainda grossasecção. Finalmente, demonstramos a montagem e imagiologia destas secções de tecido, a fim de investigar a interface biológica em torno cerebrais implantados dispositivos.

MEAs Brain-implantados podem ser recolhidos em fatias de tecido, primeiro pela separação quaisquer componentes crânio montado a partir dos componentes do cérebro incorporados. Figura 2a mostra os resultados da remoção de um dos lados de um headcap cimento dentário e uma porção do Kwik-Sil em torno de um cabo de MEA num crânio de ratos. Um ferro de soldar foi utilizada para remover o cimento dental e Kwik-Sil numa hotte. A cablagem e quaisquer estruturas não-MEA foram implantados próximo cortado com micro-tesouras por escavação lentamente através do Kwik-Sil para baixo para a superfície do cérebro fixo. Após corte, etiquetagem e limpeza de tecidos, simples feitos por lâminas são úteis para a montagem das fatias de tecido de espessura (Figura 2b). Uma fatia de cérebro montado que contém um microdispositivo implantado é mostrado na Figura 2c. Imagiologia através de qualquer um dos lados da lâmina pode permitir-lhe avaliar a interface em torno de um dispositivo, tal como demonstrado na Figura 3 </strong&gt;, em que ao longo da microglia suporte de silício de um MEA são visíveis a partir de um lado (Figura 3a) e ao longo de microglia sítios de eléctrodos e vestígios visíveis do outro lado (Figura 3b). Uma vez montado, o tecido pode ser visualizado utilizando um estágio de translação XY. Sínteses das etiquetas fluorescentes através fatias de tecido inteiro pode ser gerado com a resolução desejada (Figura 4). A análise detalhada do interface tecido morfologicamente conservados em torno de microdispositivos implantados podem ser recolhidos sob a ampliação elevada para a análise da resposta do tecido local (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> Figura 1. Visão geral de procedimento. (AC) do cérebro micro-implante cirurgias são finazados com uma camada de polímero Kwik-Sil que rodeia imediatamente o dispositivo, seguido de um revestimento acrílico. (D, e) Após a eutanásia, a camada acrílica é queimado, e crânio-montados componentes do dispositivo são separados dos componentes implantados por corte através do elastómero de silicone. (F, g) O cérebro é então removido a partir do crânio e é cortada e montada na fase vibratome. (Hk) fatias de tecido são recolhidos, incluindo uma fatia de tecido que contém o dispositivo. (L) tecido pode então ser processado e montado em câmaras personalizados para microscopia detalhada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) Limpar Kwik-Sil su elastômero de siliconerrounding um cabo de eletrodo array (seta) foi exposta através da queima de distância de uma janela na tampa de cimento dentário em uma cabeça roedor perfundido usando um ferro de soldar. (B) Para acomodar imagens em ambos os lados de uma fatia de tecido grosso, simples &quot;slide-câmaras&quot; pode ser feito cortando um slide de plástico e aderindo lamela de cada lado em torno do tecido e solução de montagem. (C) Um rato fatia de tecido cerebral com o implante intacto (seta vermelha) é mostrada após a montagem. Ambos os lados do tecido é rapidamente acessível a imagens de microscopia com esta configuração. Para a escala, painel (a) é de 25 mm de diâmetro, na parte inferior, enquanto que os painéis (b, c) é de 80 mm de diâmetro, na parte inferior. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> Figura 3. Int Máximaensity z projecções de 40 um de espessura, pilhas de imagens recolhidas em torno da parte traseira (a) e frontal (b) de uma matriz de microeletrodos implantados. Microglia (marcado com anti-Iba1 e Alexa Fluor 633, branco) e laser de reflexão de luz (vermelho), recolhidas a partir da superfície do dispositivo, foram sequencialmente trabalhada a partir de ambos os lados de uma fatia de tecido 400 um de espessura. À medida que os implantes cerebrais são muitas vezes opacos, montagem com acesso óptico de ambos os lados permite uma visão clara de estruturas de tecido marcados &quot;por trás&quot; do implante em relação ao objectivo do microscópio. Barra de escala 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Uma fatia DCHist rotulado fotografada usando um estágio controlado por computador em um microscópio confocal a laser. (A) núcleo celular (corados com Hoechst 33342) e (b) os monócitos / microglia(Marcado com anti-Iba1) foram simultaneamente fotografada em canais separados. (C) A transmissão e reflectância de luz também foram recolhidos, mostrando a localização do implante de 4 semanas em relação a Hoechst e Iba1 dados. (D) sobreposição de todos os canais de transmissão, mas também é mostrada. A área do retângulo branco é ampliado em imagens que aparece à direita. Barra de escala de 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> Figura 5. Usando um microscópio de fase controlada por computador e software apropriado, os dados de imagem panorâmica pode ser recolhido em torno do implante. Reflectância (a) e de transmitância (b) permitir a localização do dispositivo, enquanto que as etiquetas fluorescentes anticorpos ou químicas (c, anti-Iba1 rotulagem de microglia e macrophages) permitir imagens detalhadas dos componentes do tecido ao longo da interface do tecido intacto. Barra de escala de 200 um.

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Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Aqui apresentamos um método histológico para captura, rotulagem, opticamente limpar e imagem da interface tecido intacto cérebro em torno de microdispositivos cronicamente implantados no tecido cerebral dos roedores. Os resultados das técnicas que compõem este método são úteis para a compreensão do impacto dos vários penetrantes cérebro-implantes em seu tecido circundante.

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K visualizações.  Purdue University. Aqui apresentamos um método histológico para captura, rotulagem, opticamente limpar e imagem da interface tecido intacto cérebro em torno de microdispositivos cronicamente implantados no tecido cerebral dos roedores. Os resultados das técnicas que compõem este método são úteis para a compreensão do impacto dos vários penetrantes cérebro-implantes em seu tecido circundante.

Vídeo: Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Neurociência

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

Exposição do SNC porco para análise histológica: A manual por decapitação, crânio de abertura, e Cérebro Remoção

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Electroencephalographic, Heart Rate, and Galvanic Skin Response Assessment for an Advertising Perception Study: Application to Antismoking Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these approaches often appear poorly accurate in scientific terms. Neuroscience is increasingly applied to the investigation of the neurophysiological bases of the perception of and reaction to commercial stimuli to support traditional marketing methods. In this context, a particular sector or marketing is represented by public service announcements (PSAs). The objective of this protocol is to apply electroencephalography (EEG) and autonomic signal analysis to study responses to selected antismoking PSAs. Two EEG indices were employed: the frontal alpha band EEG asymmetry (the Approach Withdrawal (AW) index) and the frontal theta (effort index). Furthermore, the autonomic Emotional Index (EI) was calculated, as derived from the Galvanic Skin Response (GSR) and Heart Rate (HR) signals. The present protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate, through the aforementioned indices, the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of antismoking PSAs. In particular, a campaign characterized by a symbolic communication style (classified as "awarded" on the basis of the prizes received by specialized committees) obtained the highest approach values, as estimated by the AW index. A spot and an image belonging to the same PSA campaign based on the "fear arousing appeal" and with a narrative/experiential communication style (classified as "effective" on the basis of the economical/health-related improvements promoted) reported the lowest and highest effort values, respectively. This is probably due to the complexity of the storytelling (spot) and to the immediateness of the image (a lady who underwent a tracheotomy). Finally, the same "effective" campaign showed the highest EI values, possibly because of the empathy induced by the testimonial and the explicitness of the message.

The following protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of Public Service Announcements (PSAs) against smoking, aired in the USA and Europe during the period between 1998 and 2015.

Eletroencefalográficos, frequência cardíaca e avaliação de resposta galvânica da pele para uma percepção de publicidade estudam: aplicativo para anúncios de anti-tabagismo serviço público

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Um modelo do rato de leve hipoperfusão intra-uterino com estenose Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...