Os autores agradecem calorosamente Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. e A. Weber Jaouen para discussões úteis; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, o pessoal do biotério em IBDML eo pessoal da plataforma de imagem PicSIL em IBDML para suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Câncer du (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), pour la Recherche Fédération sur le Cerveau (FRC) para FD, por bolsas de estudo da Federação Recherche Médicale de la e Cancéropôle PACA ao CR.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a legislação francesa e em conformidade com a directiva do Conselho da Comunidade Europeia de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) para o cuidado e uso de animais de laboratório. A pesquisa em animais foi autorizada pela Direção Départementale des Serviços vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licença D-13-055-21) e aprovado pelo comitê de ética da Provence Côte d&#39;Azur n ° 14 (Projeto 87-04122012) . 1. Esferóides Preparação <ol><li> Preparação das placas de Petri revestidas com agarose <ol><li> Mistura-se 1 g de agarose com 100 ml de meio de cultura de células não suplementadas com soro fetal bovino. Usar um forno de microondas (850 Watts durante 40 seg, depois 3 x 15 seg; agita-se a solução entre cada sessão de microondas) para ferver a solução e para dissolver completamente a agarose. Autoclave esta solução de agarose a 1% durante 20 minutos a 120 ° C para garantir Steri. dade Nota: Tome cuidado para dissolver completamente o agarose antes do protocolo autoclave. Falta de homogeneidade pode comprometer a formação de esferóides. </li><li> Uma vez recuperada a partir do autoclave, verter 10 ml da solução de agarose a 1% em 100 x 20 mm pratos Petri. Deixar a placas de Petri de 20 min à temperatura ambiente para permitir que a solução de agarose a 1% para solidificar. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS acima da agarose para manter a humidade. Selar a tampa das placas de Petri revestidas com agarose enrolando-os com parafilme para evitar a evaporação. As placas de Petri podem ser armazenados durante 2 meses a 4 ° C, se adequadamente humidificado pela camada de PBS. </li></ol></li><li> Cultura esferóide <ol><li> Em de 75 cm 2 frascos, a cultura das células de glioma em seu meio recomendado como uma monocamada. </li><li> Substituir o PBS a partir de um dos 1% de agarose revestidas com uma placa de Petri com 1,5 ml de &quot;meio de pré-condicionado&quot; recolhidos a partir do recipiente que contém a monocamada de células de glioma de 2Ds. </li><li> Remover o meio do frasco contendo a monocamada de 2D de células de glioma. </li><li> Lave a monocamada com 10 ml de PBS. </li><li> Adicionar 2 ml de 0,05% de uma solução de tripsina / EDTA e incubar o balão de 4 min a 37 ° C. Nota: O tempo de incubação pode variar de acordo com a linha celular utilizada. </li><li> Adicione 8 ml de meio de cultura para impedir a ação da tripsina, lave delicadamente a suspensão de células Nota:. Tome cuidado para não lavar ar na suspensão de células à medida que aumenta a morte celular. </li><li> Coloque 6 ml da suspensão de células num frasco estéril. </li><li> Centrifuga-se o frasco de 4 minutos a 800 rpm. </li><li> Remover o sobrenadante e suspender suavemente o sedimento de células em 3 ml de meio de cultura. </li><li> Semente da suspensão de células no preparado revestida de agarose placa de Petri. </li><li> Colocar a placa de Petri, a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 2 a 3 dias, até os esferóides de diâmetro desejado são formados. </li></ol></li></ol&gt; 2. Esferóide e Janela Implantação <ol><li> Preparação do sistema de injecção <ol><li> Capilares de vidro limpo (1 mm de diâmetro) por sonicação em etanol a 70% durante 10 min. Lavar duas vezes com água antes colocação dentro de uma incubadora até secar. </li><li> Puxe vários capilares de vidro limpo com um puxador de pipeta, a fim de preparar um pequeno estoque. </li><li> Quebrar a ponta do capilar puxado por raspagem sobre a extremidade de um pedaço de papel de seda para se obter um extremidade chanfrada do tamanho desejado: normalmente um diâmetro externo de 300-350 ^ m e um diâmetro interno de 250-300 mM. Durante este processo de conformação, controlar o diâmetro do capilar utilizando um macroscópio cuja ocular está equipado com uma mira graduada. </li><li> Ligue a extremidade não chanfrada do capilar para um colector de 3 vias utilizando um pedaço de tubo de plástico, cujo diâmetro interior se ajusta o diâmetro externo do tubo capilar. </li><li> Usando tubin plásticog, ligar as duas outras formas de colector para uma 25 ul microlitro seringa e uma seringa de 1 ml carregado com óleo mineral histo-compatibilidade. </li><li> Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre a seringa microlitro ea seringa de 1ml. Remover o pistão da seringa microlitro e injetar óleo mineral para trás para dentro da seringa microlitro até que vaza, empurrando o êmbolo da seringa de 1ml. Substitua o pistão da seringa microlitro, enquanto tomando cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo. </li><li> Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre o capilar ea seringa de 1 ml. Encha o capilar com óleo mineral até que vaza da ponta, tendo o cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo. </li><li> Ajustar o selector de colector para estabelecer uma ligação entre a seringa de microlitro e o capilar. Expelir a cerca de 10 ul de óleo mineral. </li><li> Mergulhe a ponta capilar em solução PBSe usando o calibre da seringa microlitro, aspirar 5 ul de PBS no capilar. Note-se que o menisco entre o óleo e PBS é claramente visível. </li><li> Fixar o capilar num micromanipulador 3 eixo encaixe sob o macroscópio cirurgia. Este sistema irá ser utilizado para orientar o capilar para o local da injecção sob controle visual. </li></ol></li><li> Implantação esferóide <ol><li> Levemente sedar o mouse por inalação de isoflurano em uma câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 min). </li><li> Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Note-se que a anestesia frequentemente reduz a temperatura do corpo do animal. Recomenda-se a prosseguir com a cirurgia em uma sala a 26 ° C e manter o animal aquecido com uma almofada de aquecimento thermocontrolled subjacente. </li><li> Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos. </li><li> Raspar o couro cabeludo do animal. </li><li> Lugaro animal em uma estrutura estereotáxica usando barras de ouvido e um bocal. </li><li> Limpar a pele com iodo povidona (3% de sabão, em seguida, solução a 10%). </li><li> Adicione a 1 cm de comprimento incisão longitudinal no meio do couro cabeludo com um bisturi. Com uma tesoura cortar e remover a pele acima dos ossos parietais. </li><li> Com uma lâmina de bisturi remover suavemente o periósteo acima do crânio. Generosamente aplicar cianoacrilato no topo do osso para gerar uma superfície áspera para mais tarde a aderência de cimento. </li><li> Perfurar o osso parietal sob uma macroscópio cirúrgico para gerar uma craniotomia, de 4 mm de diâmetro. Generosamente adicionar PBS gelado contendo penicilina (1000 U / ml) e estreptomicina (1 mg / ml) durante todo o processo para evitar um aquecimento. Retire os pequenos fragmentos de osso com uma pinça e uma gaze estéril molhado. Tome cuidado para perfurar pelo menos um milímetro de distância de suturas do crânio parietais para evitar hemorragias. </li><li> Fina osso na fronteira da craniotomia em que a janela de vidro será selado. Objetivo é eNsure posicionamento posterior plana da janela de vidro com superfície de contacto máxima entre o cérebro e o vidro. Lentamente, retire o osso usando uma pinça e limpar a dura-máter exposta com a solução de PBS. </li><li> Tome a 5 mm de diâmetro rodada lamela de vidro, limpe-o com álcool e seque-a com papel de seda. Tentar usar a lamela como uma tampa para a craniotomia e confirmar que uma grande superfície plana do cérebro fica em contacto com o vidro. Se for necessário retirar a lamela mais a densidade dos ossos laterais. Prossiga até que o cérebro pode ficar espremido plana se aplicar suavemente a pressão sobre a lamela uma vez no lugar. </li><li> Limpe novamente a lamela com o álcool, seque-a com papel de seda, e guardá-lo à parte. </li><li> Com uma agulha de calibre 26 fazer um buraco na dura-máter no centro da craniotomia ainda evitar vasos sanguíneos principais. Certifique-se de não danificar o parênquima cerebral como o objetivo desta etapa é apenas para abrir a dura-máter. </li><li> Limpe suavemente o wi dura-máterª solução PBS para remover sangue hemorrágico. Cubra com um pedaço de papel de seda enquanto prepara a injeção esferóide. </li><li> Com o sistema de injecção de esferóide, preparado no passo 2.1, chupar um esferóide rodada montagem do diâmetro interno capilar (aproximadamente 200-250 mm) a partir da placa de Petri, preparado no passo 1.2. Esferóide deve vir junto com cerca de 5 mL de meio de cultura. Ele deve cair para a ponta da capilaridade sob o seu peso. </li><li> Remover o papel de seda molhado utilizadas para cobrir a craniotomia e posicionar o animal sob o sistema de injecção. </li><li> Abaixe a pipeta de injeção até tocar no buraco feito na dura-máter. Em seguida, coloque-o novamente por 250 um. Espere 30 segundos. </li><li> Lentamente injectar o esferóide utilizando o êmbolo da seringa de microlitros (2-3 ul), enquanto bombeia para fora o excesso de líquido com um pequeno pedaço de papel de seda. Espere 30 segundos e, em seguida, levante cuidadosamente a pipeta de injeção de 50 mm em direção à superfície. Espere 30 segundos e novamente REPEAt o processo de elevação por passos de 50 mM até a superfície. Tempo de espera evita a extração do esferóide que iria ficar para a pipeta. </li><li> Confirmar a presença do esferóide no cérebro utilizando uma macroscópio fluorescência. </li><li> Misturar 100-300 diâmetro mM reticulados contas de gel dextrano com solução de PBS numa placa de Petri. Espere 1 minuto e pescar algumas contas hidratados. Colocá-los no osso adjacente ao craniotomia. </li><li> Sob o controlo macroscópica, escolher um cordão com um diâmetro semelhante ao tamanho da abertura da dura-máter. Cortar o talão de gel de dextrano reticulado em duas metades, utilizando fórceps. </li><li> Com cuidado, coloque um dextrano gel hemi-talão reticulado no orifício de injeção com a face convexa em direção ao esferóide. Tome cuidado para não remover o esferóide e pressione suavemente para baixo até a fronteira do côncavo entrar em contato com a dura-máter circundante. </li><li> Coloque uma gota de cola de cianoacrilato sobre uma lâmina de vidro; molhe a ponta de um palito no drop para levar uma pequena quantidade de cola. Rapidamente selar as bordas do gel de dextrano hemi-grânulo reticulado para a dura-máter adjacente por estampagem em torno de cola. Ter o cuidado de executar movimentos rápidos e precisos, a fim de evitar a colagem do dextrano reticulado em gel de hemi-grânulo para o palito. Evite o excesso de cola que pode se espalhar e impedir se não impedir imagem depois de secas. Espere 2 minutos para a cola secar e, em seguida, limpar a craniotomia e osso circundante com solução PBS. </li></ol></li><li> Implantação Janela <ol><li> Coloque a 5 mm de diâmetro rodada lamela acima da craniotomia (ver 2.2.12). As arestas da lamela deve ser diluído no crânio no exterior da craniotomia. A lamela deve estar em contato com a dura-máter eo osso diluído nas bordas. É muito importante ter um contato direto entre a dura-máter ea lamela de vidro de outra forma o tecido da cicatriz pode desenvolver e impedir a claridade óptica. </li><li> Com um lenço de papel, absorver o PBS no tharestas e de lamelas, de modo que solução não cobre totalmente a craniotomia, quando da aplicação de uma pequena pressão no centro da lamela. Isto irá garantir que o osso, de vidro e cérebro são coladas no lado da região de interesse. </li><li> Manter uma pequena pressão no centro da lamela com um fórceps enquanto aplicando suavemente cianoacrilato na fronteira entre o osso e a lamela. A cola vai espalhar-se espontaneamente até a interface com a solução de PBS. Solução vai agir como uma barreira dada a hidrofobicidade da cola. Vedação deve ser eficaz em menos de um minuto, mas tomar um extremo cuidado para não mover a lamela até que seja corrigido. Isso de outro modo resultar em fuga de cianoacrilato sobre a dura-máter, portanto, conduzir a uma falha da cirurgia. </li><li> Em caso de cola teriam se espalhado em cima do vidro, removê-lo usando uma lâmina de micro-bisturi, fazendo movimentos em espiral, uma vez que, de outra forma reduzir a claridade óptica. Cuidado para não quebrar a lamela de vidro during o processo, devido a pressão excessiva. </li><li> Consolidar a fixação de vidro, aplicando cimento dental nas bordas da lamínula em direção ao crânio adjacente. Certifique-se de cobrir todo o crânio exposto até o couro cabeludo. Usando cimento extra, construir paredes laterais ao redor da lamela para criar o pool necessário para a imersão do objetivo. O cimento dental vai curar em menos de 10 min. </li></ol></li></ol> 3. Cuidados pós-operatórios e Preparação for Imaging <ol><li> Cuidados pós-operatórios <ol><li> Retire o mouse do quadro estereotáxico, injetar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc sobre as regiões pélvica e deitá-la em uma jaula com um caloroso tecido-ninho. </li><li> Monitorar o animal até os efeitos da anestesia ter desaparecido. Em geral 2 a 3 horas após a cirurgia, os ratos são totalmente móvel. Certifique-se que o animal tem um fácil acesso a comida e água. Fornecer o animal com agarose contendo glicose (agarose3%, glicose a 3%). </li><li> Monitorizar o peso dos animais diariamente e injectar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc para o primeiro 10d após a cirurgia. Por considerações éticas, eutanásia os ratos quando a perda for superior a 15% do seu peso original. A pressão intracraniana aumenta com o tamanho do tumor levando a deficiências motoras para o animal. Esta é a linha de células tumorais dependente e ocorre em vários atrasos pós-cirurgia. Cuidados especiais devem ser tomados para caracterizar o ponto final do experimento com a linhagem celular utilizada. </li></ol></li><li> Preparação para a imagem latente <ol><li> Levemente sedar o ratinho por inalação de isoflurano numa câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 minutos). </li><li> Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Tal permite que a anestesia tipicamente 45 minutos de observação. Para realizar as sessões de imagem mais longos, o mouse é colocado sob a inalação contínua de isoflurano emar (0,25-0,75%). </li><li> Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos. </li><li> Coloque o animal em um quadro estereotáxico e bloquear o crânio com os earbars. </li><li> Para visualizar os vasos sanguíneos, um corante fluorescente pode ser injectado por via intravenosa. </li><li> Se a janela estiver suja, pode ser limpa, removendo delicadamente os escombros com uma lâmina fina e no canto de um tecido. Não use álcool para limpar a janela, uma vez que nem sempre é compatível com cimento dental e pode resfriar o cérebro abaixo da janela. </li></ol></li></ol>

<ol>
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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+radiotherapy+plus+procarbazine,+lomustine,+and+vincristine+with+or+without+BUdR+for+treatment+of+anaplastic+astrocytoma:+final+report+of+RTOG+9404.">Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).</li><li>Piao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+resistance+to+anti-VEGF+therapy+is+associated+with+myeloid+cell+infiltration,+stem+cell+accumulation,+and+a+mesenchymal+phenotype.">Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype.</a> Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Esta abordagem permite a utilização de métodos de imagiologia óptica para monitorizar ao longo de dias e semanas, o crescimento de glioma ortotopicamente implantado. O mesmo animal pode ser subsequentemente submetido a virtualmente qualquer modalidade de imagem do cérebro durante o decorrer da patologia; no entanto, a preparação específica microscopia de dois fótons oferece a oportunidade única de alcançar resolução subcelular dentro do cérebro do animal vivo. Nosso protocolo apresenta a vantagem de fazer ...

Glioblastoma multiforme aparece como a forma mais agressiva de tumor cerebral em adultos com uma sobrevida média de 12 meses e uma taxa de sobrevida em 5 anos de 5%. O tratamento clínico depende de cirurgia, radioterapia e quimioterapia, muitas vezes utilizados em combinação. No entanto, os efeitos destes tratamentos paliativos permanecem 1-3. Até agora, a maioria dos estudos de neuro-oncologia contar com técnicas que só são capazes de fornecer uma visão estática e realizados em grandes grupos de animais portadores de tumor sacrificados em diferentes pontos temporais (ver, por exemplo, 4,5). O recente desenvolvimento de métodos de acompanhamento com base em imagens intravital permite estudar o crescimento de glioma e as interações entre as células tumorais e seu microambiente fisiopatológico no mesmo animal ao longo do tempo. Isso abre o caminho para a peça exclusiva de informação que foi até agora inatingível 6. Animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse pode ser usadod para estudar as interações específicas entre as células tumorais e ex neurônios neste papel. Ao longo da última década, a microscopia de dois fótons intravital 7 tornou-se um padrão-ouro em estudos neuro-oncologia fundamentais e ensaios pré-clínicos 8,9 por sua capacidade de realizar observação intravital profundo de cérebro do rato (&gt; 500 mm abaixo da dura-máter) com uma resolução espacial micrométrica 10. Utilizando microscopia de dois fotões intravital com modelos animais orthotopical implantados com uma janela craniana crónica 11, é possível seguir a progressão do tumor ao longo do tempo no mesmo 9,12 rato. Uma das principais desvantagens destes modelos animais anteriormente publicadas, no entanto, que eles não imitam as limitações físicas que governam o crescimento do tumor como a dura-máter não é selado após a injecção da suspensão celular 9,13,14. Células de glioma podem vazar noespaço extradural transformar um modelo de glioma ortotópico em um heterotópico. O modelo animal aqui apresentados consiste na injecção de um esferóide de células de glioma fluorescentes no córtex cerebral, a uma profundidade de 200 um, seguido pelo fecho da dura-máter com um gel de dextrano hemi-grânulo reticulado e cola de histo-compatibilidade . O crescimento do tumor é então restrito ao parênquima cerebral que mantém as restrições físicas fisiopatológicos. Uma janela de vidro crônica implantado acima do tumor permite um acesso óptico fácil para microscopia de dois fótons intravital. Usando animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse, é possível realizar um acompanhamento do crescimento glioma ao longo do tempo e estudar sua interação com seu microambiente (aqui com os neurônios e vasos destacados com dextrans fluorescentes).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1337">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill</td>
			<td style="width:383px;">Dremel (Germany)</td>
			<td style="width:156px;">398</td>
			<td style="width:375px;">any high quality surgical bone drill would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501860 (#1/4)</td>
			<td>also sold by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Tissue scissors</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14395</td>
			<td style="width:375px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dumont tweezers M5S</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dental cement</td>
			<td>GACD (USA)</td>
			<td>12-565 &#38; 12-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cyanoacrylate</td>
			<td>Eleco-EFD (France)</td>
			<td>Cyanolit 201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass capillaries without filament</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments (UK)</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Microliter syringe (25 &#181;l)</td>
			<td>Hamilton (USA)</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>Kite-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">T derivation (3-way stopcock - Luer lock)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14035-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Stereotactic frame (mouse adaptor)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass coverslips</td>
			<td>Warner Instruments (USA)</td>
			<td>CS-5R (64-0700)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 &#181;m beads</td>
			<td>Available from various suppliers including Sigma (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Eye ointment</td>
			<td>TVM (France)</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies (Nikon, &#8230;)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais agressiva de tumores cerebrais sem tratamentos curativos disponíveis até o momento. Modelos murinos desta patologia contar com a injecção de uma suspensão de células de glioma no parênquima cerebral após a incisão da dura-máter. Considerando que as células têm de ser injetada superficialmente para ser acessível a microscopia de dois fótons intravital, as injeções superficiais deixam de recapitular as condições fisiopatológicas. Na verdade, escapando através do trato injeção maioria das células tumorais alcançar o espaço extra-dural onde expandir anormalmente rápido na ausência de restrições mecânicas do parênquima. Nossos melhorias não consistem apenas em focalmente a implantação de um esferóide de glioma em vez de injecção de uma suspensão de células de glioma nas camadas superficiais do córtex cerebral, mas também no entupimento do local de injecção por um gel de dextrano hemi-cordão de ligação cruzada que é colada à surrounding parênquima e selou a dura-máter com cianoacrilato. Todas estas medidas aplicar a expansão fisiológica e infiltração de células tumorais no interior do parênquima cerebral. Craniotomia foi finalmente fechada com uma janela de vidro cimentados ao crânio para permitir imagens crônica ao longo de semanas, na ausência de desenvolvimento do tecido da cicatriz. Aproveitando-se de animais transgênicos fluorescentes enxertados com células tumorais fluorescentes Nós mostramos que a dinâmica das interações que ocorrem entre as células de glioma, neurônios (ex-PCP Thy1 ratos) e vascularização (destacado por uma injeção intravenosa de um corante fluorescente) pode ser visualizado por intravital microscopia de dois fotões durante a progressão da doença. A possibilidade de uma imagem de tumor com resolução microscópica em um ambiente cerebral minimamente comprometido representa uma melhoria de modelos animais atuais GBM que deve beneficiar o campo da neuro-oncologia e testes de drogas. </p&gt;

Uma vez que o protocolo cirúrgico é realizado (Figura 1), os animais podem ser observados por meio de microscopia de fluorescência ao longo de semanas até ao sacrifício. Uma reação inflamatória pode ser observada após a cirurgia, que desaparece dentro de uma ou duas semanas. O crescimento do tumor pode ser observada através de várias técnicas de microscopia, incluindo a microscopia de fluorescência e análise macroscópica de dois fotões (Figura 2). Imagens de exemplo desc...

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An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K visualizações.  Aix Marseille University.  Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons. 

Vídeo: An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Um modelo ortotópico de câncer de bexiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Radioterapia em uma combinação ortotópico modelo de tumor de cérebro de camundongos

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Um modelo de camundongo ortotópico de Carcinoma anaplásico da tiróide

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama espontânea metástase

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...