Este protocolo permite a entrega de campos elétricos de pulso por eletrônica flexível para estudar seus efeitos terapêuticos sobre o glioblastoma. Fazemos isso visualizando o microambiente tumoral in vivo com imagens. A bioeletrônica está se integrando a este protocolo usando vários modelos diferentes de complexidade crescente, a fim de estudar o efeito dos campos pulsantes sobre o câncer.
As técnicas de microfabricação apresentadas neste trabalho também podem ser testadas como um meio de tratamento de outros tipos de câncer, incluindo xenoenxertos derivados de pacientes. Isso se move em direção à ideia de medicina de precisão adaptada para cada paciente individual. Essas sondas são feitas com técnicas padrão de microfabricação, de modo que a fabricação é simples e qualquer pessoa com uma sala limpa pode fazê-las.
Para a padronização de eletrodos de ouro, deposite uma camada de três micrômetros de parileno C com um sistema de deposição de parileno colocando as lâminas de vidro limpas na câmara de deposição. Pesar seis gramas de parileno C em um barco de alumínio, colocá-lo no forno, evacuar a máquina e iniciar a deposição com os parâmetros descritos no manuscrito. Quando a deposição estiver concluída e a temperatura do vaporizador estiver abaixo de 40 graus Celsius, desligue o resfriador, o vaporizador, o forno.
Ventile a máquina e colete as amostras. Gire o revestimento das amostras tratadas com plasma com um fotorresistente negativo a 1.000 vezes G por 40 segundos. Exponha o fotorresistente através de uma máscara que apresenta o design do eletrodo interdigitado.
Em seguida, mergulhe as amostras em um revelador livre de íons metálicos por três minutos para remover o fotorresistente não exposto. Para depositar uma camada de adesão de 20 nanômetros de cromo e uma camada de 300 nanômetros de ouro com um evaporador térmico, ventile a máquina evaporadora e prenda as amostras na placa redonda superior com parafusos metálicos. Encha os cadinhos dedicados, respectivamente, com cromo e ouro.
Selar e evacuar a máquina e iniciar a rotação do suporte da amostra. Selecione o cadinho que contém crómio e aumente lentamente a corrente até que a taxa de deposição atinja 0,2 angstroms por segundo. Abra o obturador, aguarde até a deposição de 20 nanômetros de cromo, feche o obturador e diminua lentamente a corrente até zero miliamperes.
Selecione o cadinho contendo ouro e aumente lentamente a corrente até uma taxa de deposição de 0,2 angstroms por segundo. Abra o obturador para evaporar o ouro, espere até a deposição de 10 nanômetros de ouro e, em seguida, aumente a taxa de deposição para 1,5 angstroms por segundo até que aproximadamente 300 nanômetros sejam depositados. Feche o obturador e diminua lentamente a corrente para zero miliamperes.
Imergir as amostras num copo contendo acetona. Em seguida, lave as amostras com isopropanol e seque-as com uma pistola de ar. Spin revestir quatro camadas de solução PEDOT:PSS a 150 vezes G durante 35 segundos.
Remova a camada de parileno C sacrificial imergindo as amostras em água. Imergir as amostras em água deionizada por 30 minutos para remover o sabão restante e os compostos de baixo peso molecular no filme PEDOT:PSS e separar as amostras do substrato de vidro. Adicione 75 microlitros de solução derretida de 1%agarose em cada poço da placa de 96 poços cuidadosamente e deixe solidificar por 15 minutos à temperatura ambiente.
Descole as células de glioblastoma transduzidas obtidas durante a geração estável da linhagem celular. Adicione 10.000 células de glioblastoma por poço e componha o volume total para 150 microlitros por poço usando DMEM contendo um grama por litro de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades por microlitros de penicilina e 100 microgramas por microlitros de estreptomicina. Substitua metade da mídia por mídia fresca a cada dois dias até novos experimentos, mantendo a ponta da pipeta na parte superior do poço para evitar danos à agarose ou ao próprio esferoide.
Coloque os ovos fertilizados de codornas japonesas, Coturnix japonica, em uma incubadora em bandejas com um rotador automático que gira os ovos a cada duas horas. Este dia é considerado embrionário dia zero. No terceiro dia embrionário, abra suavemente os ovos usando uma pinça com pontas finas pré-lavadas com etanol a 70%.
Despeje o embrião em um barco de pesagem de plástico, cubra-o com outro barco de pesagem e coloque-o em uma incubadora umidificada padrão a 37 graus Celsius por três dias. No sexto dia embrionário, faça uma pequena incisão na membrana corioalantóica com uma agulha de calibre 23. Coloque um esferoide de sete dias na incisão usando uma pipeta e devolva o embrião à incubadora por três dias até novos experimentos.
Coloque uma gota de DPBS para cobrir a craniotomia. Coloque o eletrodo flexível na gota de DPBS e coloque suavemente a parte de trás da sonda com as almofadas de contato nas costas do mouse. Absorva a gota de DPBS com um pequeno pedaço de papel até que a sonda possa ficar plana na dura-máter e seguir a curvatura do cérebro, garantindo que a pequena camada de solução salina permaneça abaixo dos eletrodos para atuar como uma barreira contra o transbordamento de cola.
Coloque uma pequena gota de adesivo de silicone na sonda e cubra-a com um vidro de cobertura redonda de cinco milímetros. Empurre o vidro da tampa para baixo até que o silicone esteja uniformemente distribuído e a distância entre o vidro da tampa e a sonda seja mínima. Em seguida, aguarde 30 segundos para que o silicone se solidifique.
Para fixar o vidro da tampa, aplique rapidamente a supercola nas laterais e empurre-a para baixo até que a cola se torne sólida. Aplique super cola no pescoço da sonda usando um palito de dente tomando cuidado para que a super cola seja desenhada sob o pescoço para fornecer suporte estável. Cubra o crânio com cimento dentário para construir uma tampa crônica e tome cuidado especial para cobrir apenas as bordas do vidro da tampa.
Levante a parte de trás da sonda e aplique cimento sob o pescoço da sonda. Resto da sonda no cimento antes que ele cure. Empurre o pescoço da sonda suavemente para colocar sua superfície no mesmo nível que o vidro da tampa e não no caminho da objetiva do microscópio durante o experimento.
Cubra a parte superior do pescoço da sonda com não mais de 1,5 milímetros de camada de cimento dentário para obter uma fixação firme na sonda. Construa um poço de cimento apresentando uma crista de 1,5 milímetro a um a dois milímetros ao redor do vidro da cobertura para criar uma bacia para o fluido de imersão para as imagens de dois fótons. Após a cura do cimento, administrar analgesia pós-cirúrgica e manter o animal aquecido até a recuperação, envolvendo-o em uma toalha de papel e colocando-o perto de uma lâmpada infravermelha.
Os eletrodos revestidos com PEDOT:PSS mostram as regiões tipicamente capacitivas e resistivas dominadas separadas por uma frequência de corte, enquanto os eletrodos não revestidos apresentam apenas comportamento capacitivo. O crescimento dos esferoides observados com um microscópio de campo brilhante revelou que pelo menos dois ou três dias são necessários para obter esferoides esféricos e densos, dependendo da linhagem celular e do número de células semeadas. No modelo in ovo, o enxerto de esferoides na membrana corioalantóica pode ser avaliado por microscopia de fluorescência, pois as células vivas têm cálcio intracelular e a vascularização do tumor pode ser avaliada pela injeção de um corante fluorescente nos vasos sanguíneos.
Em comparação com a impedância em solução salina, espera-se um aumento da impedância in vivo em frequências acima de 100 hertz devido à presença de um ambiente biológico. O parênquima neural vascularizado e a infiltração tumoral podem ser observados e caracterizados através do substrato transparente ao longo de semanas por duas microscopias de fótons. O uso de animais transgênicos expressando proteínas fluorescentes em células de interesse pode demonstrar o processo inflamatório mínimo induzido apenas pelo implante de eletrodos.
Pode mostrar a presença de micróglia e monócitos 26 dias após o implante de campos elétricos pulsados estimulados eletrodo. Tanto as células microgliais derivadas de monócitos periféricos quanto as células microgliais ressonantes cerebrais foram encontradas ao redor e dentro do tumor. O ponto crítico para o sucesso no procedimento de implante é garantir a vedação e a planicidade da janela craniana e otimizar a qualidade do contato com a sonda.
Além da imagem intravital, o que poderia considerar a combinação de nosso protocolo com outras medidas e técnicas como as amostragens e medidas de exame de sangue para citocinas, estado imunológico por citometria de fluxo, ou mesmo análise comportamental. Este trabalho abre caminho para o uso de dispositivos implantáveis flexíveis para o câncer e abre novas perspectivas para o uso da medicina bioeletrônica para esta doença crônica.
