Os autores gostariam de agradecer o seguinte para financiar este trabalho: generoso arranque fundos do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Washington, um McDonnell Centro para Sistemas de Neurociência concessão, um Office of Naval Research Grant (Grant #: N000141210089) para BR

1. Preparação odor e Entrega <ol><li> Soluções diluídas de odor em óleo mineral, em volume, para atingir o nível desejado de concentração. Armazenar uma mistura de 20 ml de óleo mineral e o odorante num frasco de vidro de 60 ml. Insira duas agulhas de seringa em um tampão de borracha (calibre 19), um a partir da parte inferior e o outro a partir do topo, para proporcionar uma entrada e uma linha de saída. Selar a garrafa de vidro com rolha de borracha e deste anexar um personalizada filtro de carvão activado para a linha de entrada (Figura 1A). </li><li> O filtro de carbono é feito utilizando duas seringas 6 ml. Corte as seringas ao meio e descarte final êmbolo. Preencha cada um dos pedaços restantes com algodão e carvão ativado antes de conectá-los em conjunto, utilizando tubo termorretráctil. </li><li> Ligue a linha de saída da garrafa odor (utilizando tubagem de polietileno, ID 0,86 milímetros) para o tubo de plástico (Nalgene Tubing FEP, ID 5,8 mm), que fornece um fluxo de ar constante através da antena (Figura 1B </strong&gt;). </li><li> Directa carbono-filtrada ar desumidificado (gás portador; caudal, 0,75 L / min) na direcção do locusta, utilizando um tubo de plástico colocados dentro de poucos cm da antena gafanhoto. </li><li> Para a estimulação odor, deslocar um volume constante (0,1 L / min) do espaço de cabeça acima da solução estática odor na garrafa. Isto é conseguido através da injecção de uma quantidade igual de ar desumidificado dentro da garrafa utilizando uma bomba de Pico (WPI, PV-820). Os vapores do frasco odor são dirigidos através da linha de saída de fluxo de ar no tubo (Figura 1B). </li><li> Remover os vapores de odores emitidos pela colocação de um funil de vácuo ~ 10 cm atrás da antena gafanhoto. </li></ol> 2. Preparando Antena Locust para Gravação Sensillum Único <ol><li> Selecione um gafanhoto jovens adultos de ambos os sexos com totalmente crescidas asas, mas antes da fase de acasalamento de uma colônia lotado. Para conter o gafanhoto, primeiro amputar suas pernas. Selar os locais de amputação com adesivo de tecido (Vetbond, 3M). T seguroele gafanhotos para uma câmara projetado utilizando um pequeno pedaço de fita isolante envolto em torno de seu tórax (Figura 2A). </li><li> Sob um microscópio de dissecação, fazer um sulco raso na plataforma de cera (Figura 2A), para a colocação da antena. Coloque a antena no interior da ranhura e estabilizá-lo usando cera batik nas duas extremidades da antena (Figura 2B; uma electrowaxer é utilizado para fundir a cera). </li><li> Inserir um eletrodo de aterramento (fio de prata clorada) no tórax (~ 1 cm de distância da cabeça). Use cera batik tanto o selo do local da incisão e segure o fio terra no lugar (Figura 2A). </li></ol> 3. Gravação Sensillum única para acompanhar Odor evocadas respostas dos neurônios receptores olfativos (ORNs) <ol><li> Coloque a antena locust estabilizado sob um estereomicroscópio (Leica M205C) sobre uma mesa de isolamento de vibrações (TMC) (Figura 3A). Certifique-se de que a base do sensillum gravação é claraly visível (Figura 3B). </li><li> Use um extrator micropipeta (Sutter P-1000) para o fabrico de eléctrodos de vidro (impedância de 3-10 MQ quando preenchidos com a solução salina locust 9, ponta 1-3 um de diâmetro) usando um tubo capilar de vidro de borossilicato (1,2 mm OD, ID 0,69 milímetros). </li><li> Coloque o eléctrodo de vidro num suporte de micropipeta que está anexado a um micromanipulador motorizado (Sutter MP-285). Insira cuidadosamente o eléctrodo na base de uma sensillum (Figura 3B). Note-se que cada sensillum pode conter 3-50 ORNs em gafanhotos 10. </li><li> Amplificar o sinal (10000 vezes) usando um amplificador AC (Grass P-55). Filtrar o sinal entre 0,3-10,0 kHz e adquirir a uma taxa de amostragem de 15 kHz (Figura 3D), utilizando um sistema de aquisição de dados (LabView, cartões de PCI-MIO-16E-4 DAQ; National Instruments). </li></ol> 4. Procedimento Locust Dissecção para o lobo antenal e gravações corpo Cogumelo <ol><li> Siga o restraining procedimentos como descrito na seção 2.1. Posicionar o gafanhoto em uma câmara desenhada de encomenda, como se mostra na Figura 4A e B. </li><li> Para perfundir salina durante e após o procedimento de dissecção, construir uma xícara de cera ao redor da cabeça de gafanhotos. O copo de cera deve começar logo acima das partes da boca, e ultrapassam os olhos compostos que abrangem a região entre a duas antenas, como mostrado na Figura 4C. </li><li> Para permitir que as antenas de passar através do copo de cera, criar pequenos túneis em ambos os lados utilizando plástico (polietileno) tubagem (5 mm de comprimento, 0,86 mm de diâmetro interno). Certifique-se que o tubo plástico pode deslizar através da taça de cera. Este último é conseguido através de uma junta de borracha, que envolve estreitamente o tubo de plástico, mas está ligado à taça de cera (Figura 4C). </li><li> Usando a resina epóxi, anexar a base das antenas para a extremidade inferior do tubo de plástico. Este passo assegura que as antenas são mantidas no lugar, mesmo depois de a envolventecutícula é removido. </li><li> Mantenha o copo cera preenchido com solução salina 9 a partir deste ponto. Começar pela remoção de uma região central rectangular entre as antenas de dois (lado mais comprido do rectângulo alinhada com o eixo ântero-posterior). Subsequentemente, remover cutícula nas regiões vizinhas, sem perturbar os olhos compostos e cutícula na base da antena (Figura 4D). </li><li> Usando uma pinça fina, retire sacos aéreos e corpos de gordura que envolvem o cérebro. No final desta etapa, o cérebro locust deve ser claramente visto (Figura 4D). Note-se que as regiões do cérebro que processam a informação olfactiva (com pigmentação amarela clara) estão situados entre as antenas de dois. </li><li> Em gafanhotos intestino corre abaixo do cérebro e ao longo do comprimento do corpo. Para impedir o movimento do intestino de potencialmente desestabilizar a preparação, puxe o estômago e cortar com uma tesoura fina. Fazer uma pequena incisão no abdómen apenasacima do recto e remover o intestino do intestino posterior, puxando com pinças grosseiras. Para evitar uma fuga de solução salina, amarrar o abdômen imediatamente anterior ao local da incisão com fios de sutura. </li><li> Use uma pequena plataforma feita de um arame fino revestido com uma fina camada de cera para elevar o cérebro e estabilizá-la durante 11 electrofisiologia, como mostrado na Figura 4D. </li><li> O cérebro de insectos é coberta por uma fina bainha de isolamento que tem de ser removido antes da experimentação. Para desheath cérebro, delicadamente espalhar uma pequena quantidade de uma enzima (protease 0,3-,4 mg, Sigma Aldrich) ao longo da superfície do cérebro com uma pinça fina 9. Depois de ~ 5-10 s de aplicação de enzima, lavar o cérebro completamente com solução salina. Usando super-finos fórceps muito aperte suavemente e puxe a bainha e, subsequentemente, rasgá-lo aberto sobre os locais de gravação (AL e MB; mostrado na Figura 4E, F). </li></ol> 5. Gravações multi-unidade do lobo antenal eCorpo Cogumelo <ol><li> Coloque a preparação locust (Figura 5A), sob um estereomicroscópio suspenso de um suporte de lança colocada sobre uma mesa de isolamento de vibrações. </li><li> Manter uma taxa constante de perfusão de solução salina (cerca de 0,04 L / h) durante toda a experiência. Use um fio de prata clorada imerso no copo cheio de cera salina como o eletrodo terra. </li><li> Para gravações PN, use um de 16 canais de silício sonda (NeuroNexus, item # A2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, Figura 5B). Antes de cada experiência, galvaniza os eléctrodos de ouro para conseguir impedâncias na gama de 200-300 kW. Usar o circuito mostrado na Figura 7 para a galvanoplastia. </li><li> Posicionar o eléctrodo próximo da superfície do lobo antenal e inseri-lo suavemente para dentro do tecido utilizando um micromanipulador manual (WPI, M3301R) (Figura 5D). </li><li> Avançar o eletrodo em ~ 10 passos jam. Espere 2-3 minutos em cada etapa e avaliar a adquirird qualidade do sinal. Em um local ideal a gravação, sinais extracelulares será apanhada por vários canais de gravação e terá uma relação sinal-para-ruído elevado (SNR&gt; 3-5 vezes o ruído SDs). </li><li> Para gravações de KC, use uma custom-made tetrode fio torcido (Figura 5C; passo-a-passo procedimento de fabricação apresentado na Seção 6). Galvaniza estes eléctrodos como discutido no passo 5.3. Coloque a tetrode sobre a superfície do MB (Figura 5E), como KC somata estão restritas à camada superficial do MB 8. </li><li> Ambos PN e gravações KC podem ser feitas simultaneamente de preparação locust mesma como mostrado esquematicamente na Figura 5A. </li><li> Espere pelo menos 15 minutos depois de encontrar o local de gravação para permitir a estabilização dos eletrodos. </li><li> Adquira todos os sinais extracelulares em 15 KHz, filtro entre 0,3-6 KHz, e amplificar (10.000 vezes) usando um amplificador de 16 canais AC (Biologia Eletrônica Shop; Caltech, em Pasadena, CA) (A Figura 6A, B). </li></ol> 6. Procedimentos para tornar arame trançado para gravações de KC <ol><li> Para criar uma unidade de multi-eletrodo para gravações de KC, use fio de cromo isolados níquel (RO800, 0,0005 filamento &quot;) 8. </li><li> Se oito eletrodos são desejados em seguida, enrole o fio em torno de um pedaço 10-15 cm de comprimento de papelão 4 vezes. As extremidades do cartão pode ser coberto com tubo de plástico para evitar que as arestas de corte do fio. Enquanto embalagem, certifique-se há pouco de folga, mas garantir que o fio não é tenso. Lidar com o fio com cuidado, pois quebra facilmente. </li><li> Bunch os fios juntos no topo da cartolina e usar um pedaço de fita (fita Tempo, T-534-RP) para mantê-los juntos. Corte os fios na outra extremidade. Retire os fios de arame e agrupar os fios no final corte bem usando outro pedaço de fita. </li><li> Usando um título agitador de placas (Thermo Scientific, modelo 4625Q), o vento os fios juntos (~ 72 rev / min para 3min), para formar um fio torcido. A parte inferior das costas gravadas pode ser cortada para a placa de titulação de rotor e a parte superior pode ser preso a um suporte de barra. Durante sinuoso, o fio deve ter pouco de folga, mas não devemos ser tenso. </li><li> Derreta o isolamento juntamente com uma pistola de calor (Weller 6966C) para furar as costas individuais juntos e formar um único fio. 3-4 passagens lentas (3-4 segundos cada) ao longo do comprimento do fio deve ser suficiente para aquecer e fundir os fios juntos. Em seguida, solte o fio a partir do fundo e permitir que ele relaxe. Apare o fio perto das extremidades para remover a fita. </li><li> Insira uma extremidade do fio através de um tubo de vidro de 5-6 cm de comprimento, capilar (OD 1,0 mm, 0,58 mm ID). Desmembrar o fio torcido em uma extremidade com uma pinça fina e remover o revestimento de forma muito breve torching final utilizando uma chama. Esta etapa deve ser feito com cuidado, expondo o fio à chama por muito tempo fará com que os fios derretam e emaranhado. </li><li> Suavemente separar os 8 fios na extremidade de um inflamadoª solda fio cada um separadamente em um soquete IC 8 pinos. Revestir a parte superior do encaixe IC com epoxi para segurar os fios de vidro capilar e no lugar. Também colocar uma pequena gota de epoxy na outra extremidade do capilar para manter o fio no lugar (Figura 5C). </li><li> Finalmente, corte a ponta do fio a um ângulo de 45 graus com o carboneto de tesoura de cerca de 0,5 cm da ponta capilar. </li></ol>

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L., Joseph, J., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+a+temporally+structured+stimulus+with+a+temporally+structured+neural+representation.">Encoding a temporally structured stimulus with a temporally structured neural representation.</a> Nature Neuroscience. 8, 1568-1576 (2005).</li><li>MacLeod, K., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanism+for+synchronization+and+temporal+patterning+of+odor-encoding+neural+assemblies.">Distinct mechanism for synchronization and temporal patterning of odor-encoding neural assemblies.</a> Science. 274, 976-979 (1996).</li><li>Wehr, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+afferent+and+central+temporal+patterns+in+the+locust+olfactory+system.">Relationship between afferent and central temporal patterns in the locust olfactory system.</a> The Journal of Neuroscience. 19, 381-390 (1999).</li><li>Moreaux, L., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+firing+rates+from+calcium+signals+in+locust+projection+neurons+in+vivo.">Estimating firing rates from calcium signals in locust projection neurons in vivo.</a> Frontiers in Neural Circuits. 1, 1-13 (2007).</li><li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain.">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 76, 61-69 (1997).</li><li>Galan, R. F., Sachse, S., Galizia, C. G., Hez, A. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor-driven+attractor+dynamics+in+the+antennal+lobe+allow+for+simple+and+rapid+olfactory+pattern+classification.">Odor-driven attractor dynamics in the antennal lobe allow for simple and rapid olfactory pattern classification.</a> Neural Computation. 16, 999-1012 (2004).</li><li>Kuebler, L. S., Schubert, M., Karpati, Z., Hansson, B. S., Olsson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antennal+Lobe+Processing+Correlates+to+Moth+Olfactory+Behavior.">Antennal Lobe Processing Correlates to Moth Olfactory Behavior.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5772-5782 (2012).</li><li>Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Odor-evoked+Responses+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe.</a> J. Vis. Exp. (61), e2976 (2012).</li><li>Skiri, H. T., Galizia, C. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Estímulos sensoriais mais evocar respostas combinatórias que são distribuídos em conjuntos de neurônios. Por isso, a monitorização simultânea de múltiplos neurónios actividade é necessário compreender como estímulo específico informação é representada e processado por circuitos neuronais no cérebro. Aqui, nós demonstramos extracelulares técnicas de multi-unidade de gravação para caracterizar odor evocadas respostas para os três primeiros centros de processamento ao longo da via inseto olfativo. No...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Eletrofisiologia Equipamento </td></tr><tr><td> AC amplificador </td><td> GRAMA </td><td> Modelo P55 </td><td> para gravações sensillum individuais </td></tr><tr><td> Áudio monitor (modelo 3300) </td><td> Sistemas AM </td><td> 940000 </td><td></td></tr><tr><td> Feito por encomenda de 16 canais pré-amplificador e amplificador </td><td> Cal. Tech. Biologia Eletrônica Loja </td><td></td><td> para gravações de AL e MB </td></tr><tr><td> Unidade de aquisição de dados </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> Luz de fibra óptica </td><td> WPI </td><td> SI-72-8 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Fonte de luz 115 V </td><td> WPI </td><td> NOVA </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador manual </td><td> WPI </td><td> M3301R </td><td> para as gravações do cérebro de gafanhotos </td></tr><tr><td> Stereomicroscope1 em stand boom de </td><td> Leica </td><td> M80 </td><td> para as gravações do cérebro de gafanhotos </td></tr><tr><td> Stereomicroscope2 </td><td> Leica </td><td> M205C </td><td> para gravações sensillum individuais </td></tr><tr><td> Vibração isolamento tabela </td><td> TMC </td><td> 63-500 série </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador motorizada </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP285 / T </td><td></td></tr><tr><td> Osciloscópio </td><td> Tektronix </td><td> TD2014B </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Eletrodos / Ferramentas de construção &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> 16 canais eletrodo </td><td> NeuroNexus </td><td> A2x2-tet-3mm-150-121 </td><td> para as gravações do lobo antenal </td></tr><tr><td> Borosilicato tubos capilares com filamento, ID 0,69 milímetros </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td> para fazer eléctrodos de vidro </td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Gerador de função </td><td> Multímetro Armazém </td><td> SG1639A </td><td> por excesso de regulamentação eletrodos </td></tr><tr><td> Solução cosmética (não cianeto) </td><td> SIFCO Industries </td><td> NC SPS 5355 </td><td></td></tr><tr><td> Testador de impedância </td><td> BAK Electronics Inc. </td><td> IMP-2 </td><td> por excesso de regulamentação eletrodos </td></tr><tr><td> Comutador rotativo </td><td> Electroswitch </td><td> C7D0123N </td><td> para o ouro-plcionamento eletrodos </td></tr><tr><td> Pulso isolador </td><td> WPI </td><td> A365 </td><td> por excesso de regulamentação eletrodos </td></tr><tr><td> Q porta eletrodo série </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-1091 </td><td></td></tr><tr><td> Fio de prata 0,010 &quot;de diâmetro </td><td> Sistemas AM </td><td> 782500 </td><td> eletrodo terra </td></tr><tr><td> 8 pinos DIP tomada IC </td><td> Digikey </td><td> ED90032-ND </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato tubos capilares com filamento, ID 0,58 milímetros </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0787 </td><td> construção tetrode trançado </td></tr><tr><td> Pistola de calor </td><td> Weller </td><td> 6966C </td><td></td></tr><tr><td> Rediohm-800 arame </td><td> Kanthal Precision Technologies </td><td> PF002005 </td><td></td></tr><tr><td> Título placa do vibrador </td><td> ThermoCientífico </td><td> 4625Q </td><td> fios de torção </td></tr><tr><td> Carbide tesoura, 4,5 &quot; </td><td> Pesquisa Biomédica Instr </td><td> 25-1000 </td><td> para o corte de fios torcidos tetrode </td></tr><tr><td> Finas pinças de ponto </td><td> HECO </td><td> 91-EF5-SA </td><td> para fios tetrode provocando além </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Entrega odor </td></tr><tr><td> 6 seringa ml </td><td> Kendall </td><td> 1180600777 </td><td> projetado para filtro de carvão ativado </td></tr><tr><td> Brown garrafas odor </td><td> Pescador </td><td> 08-912-165 </td><td></td></tr><tr><td> Carvão vegetal </td><td> <a href="http://BuyActivatedCharcoal.com" target="_blank">BuyActivatedCharcoal.com</a> </td><td> GAC-48C </td><td></td></tr><tr><td> Dessecante </td><td> Drierite </td><td> 23005 </td><td></td></tr><tr><td> Gás Drierite secagem jar </td><td> Fischer Scientific </td><td> 09-204 </td><td></td></tr><tr><td> Dissipadores de calor tubulação </td><td> 3M </td><td> EPS-200 </td><td> preparação odor filtro </td></tr><tr><td> Hipodérmica hub de alumínio agulha, calibre 19 </td><td> Kendall </td><td> 8881-200136 </td><td> para fornecer linhas de entrada e de saída para as garrafas de odor </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Mallinckrodt Chemicals </td><td> 6357-04 </td><td> por diluição odor </td></tr><tr><td> Tubos de plástico Nalgene, 890 FEP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8050-0310 </td><td> para fornecimento de gás portador </td></tr><tr><td> Pneumático picopump </td><td> WPI </td><td> sys-pv820 </td><td> para entrega odor </td></tr><tr><td> Polietileno tubagem ID 0,86 milímetros </td><td> Intramedic </td><td> 427421 </td><td> para o odor garrafa tomada connections e tubos profusão salina </td></tr><tr><td> Rolhas </td><td> Laboratório Pure </td><td> 97041 </td><td> para vedar garrafas de odor </td></tr><tr><td> Fita de tempo </td><td> PDC </td><td> T-534-RP </td><td></td></tr><tr><td> Luer tubulação </td><td> Cole-Parmer </td><td> 30600-66 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de vácuo </td><td> McMaster-Carr </td><td> 5488K66 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Preparação / Dissection </td></tr><tr><td> 100 x 15 mm placa de Petri </td><td> VWR International </td><td> 89000-304 </td><td></td></tr><tr><td> 18 fio de cobre AWG </td><td> Lapp Kabel </td><td> 4510013 </td><td> isolamento do fio é utilizado como juntas de borracha </td></tr><tr><td> 22 AWG conexão encalhado </td><td> AlphaWire </td><td> 1551 </td><td> cérebroplataforma </td></tr><tr><td> Batik cera </td><td> Jacquard </td><td> 7946000 </td><td></td></tr><tr><td> Cera periferia Dental </td><td> Henry Schein-dental </td><td> 6652151 </td><td></td></tr><tr><td> Electrowaxer </td><td> Almore Internacional </td><td> 66000 </td><td></td></tr><tr><td> Epóxi, 5 min </td><td> Permatex </td><td> 84101 </td><td></td></tr><tr><td> Hipodérmica hub de alumínio agulha </td><td> Kendall </td><td> 8881-200136 </td><td></td></tr><tr><td> Protease de Streptomyces griseus </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td> para desheathing cérebro de gafanhotos </td></tr><tr><td> Fio de sutura não estéril </td><td> Pescador </td><td> NC9087024 </td><td> para amarrar o abdômen após a remoção do intestino </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td> para vedar amlocais putation </td></tr><tr><td> Dumont # 1 pinça (grossa) </td><td> WPI </td><td> 500335 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n º 5 de titânio fórceps (multa) </td><td> WPI </td><td> 14096 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5SF pinça (super fino) </td><td> WPI </td><td> 500085 </td><td> desheathing cérebro de gafanhotos </td></tr><tr><td> 10 centímetros dissecando tesoura </td><td> WPI </td><td> 14393 </td><td> para a remoção de pernas e asas </td></tr><tr><td> Vannas tesoura (fino) </td><td> WPI </td><td> 500086 </td><td> para a remoção de cutícula, cortar o foregut </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Profusão salina </td></tr><tr><td> Conjunto de extensão com regulador de vazão </td><td> Moore Médica </td><td> 69136 </td><td> para regular o fluxo de solução salina </td></tr><tr><td> IV administração definido comY local de injecção </td><td> Moore Médica </td><td> 73190 </td><td> para regular o fluxo de solução salina </td></tr></tbody></table>

multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (schistocerca americana) olfactory circuits

Detecção e interpretação de sinais olfativos são críticos para a sobrevivência de muitos organismos. Notavelmente, espécies em filos têm notavelmente semelhantes sistemas olfativos sugerindo que a abordagem biológica para sensoriamento químico foi otimizado ao longo do tempo evolutivo 1. No sistema de insecto olfactivo, odorantes são transduzidas por neurónios receptores olfactivos (ORN) na antena, que convertem a estímulos químicos em trens de potenciais de acção. Entrada sensorial dos ORNs é então enviada para o lobo antenal (AL; uma estrutura análoga ao bulbo olfativo de vertebrados). Na AL, representações neurais para odores assumir a forma de espaço-temporais padrões de disparo distribuídos em conjuntos de neurônios principais (PNs, também referido como neurônios de projeção) 2,3. A saída AL é posteriormente processado por células de Kenyon (KCS) no corpo de cogumelo a jusante (MB), uma estrutura associada com a memória e aprendizagem olfactiva 4,5. Suae, apresentamos as técnicas de gravação eletrofisiológicos para monitorar odor evocadas respostas neurais nesses circuitos olfativos. Em primeiro lugar, apresenta-se um método de gravação única sensillum para estudar as respostas evocadas de odor ao nível das populações de ORNs 6,7. Discute-se o uso de soro fisiológico cheios pipetas de vidro afiados como eletrodos para monitorar as respostas extracelularmente ORN. A seguir, apresentamos um método para monitorar as respostas extracelularmente PN usando um eletrodo de 16 canais comerciais 3. Uma abordagem semelhante, usando uma custom-made tetrode fio de 8 canais torcida é demonstrado para Kenyon célula gravações 8. Nós fornecemos detalhes de nossa montagem experimental e traços representativos presentes de gravação para cada uma destas técnicas.

Respostas evocadas de odor de um único ORN para dois álcoois diferentes são apresentados na Figura 3D. Dependendo do local de gravação (sensilas tipo, a colocação do eléctrodo) com várias unidades gravações podem ser alcançados. Uma forma de onda em bruto extracelular de uma gravação AL é mostrado na Figura 6A. Os potenciais de acção ou picos de amplitudes diferentes provenientes de diferentes PNs pode ser observado neste rastreio de tensão...

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Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Nós demonstramos as variações da técnica de gravação extracelular de multi-unidade para caracterizar odor evocadas respostas nas três primeiras etapas da via olfactiva invertebrado. Estas técnicas podem ser facilmente adaptados para examinar a actividade conjunto de outros sistemas neurais também.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

multi-unit-recording-methods-to-characterize-neural-activity-locust

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

26.9K visualizações.  Washington University in St. Louis. Nós demonstramos as variações da técnica de gravação extracelular de multi-unidade para caracterizar odor evocadas respostas nas três primeiras etapas da via olfactiva invertebrado. Estas técnicas podem ser facilmente adaptados para examinar a actividade conjunto de outros sistemas neurais também.

Vídeo: Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Implante cirúrgico de crônicas Eletrodos Neurais para registrar a atividade única Unidade e Sinais eletrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Neurociência

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Registro e análise dos ritmos circadianos em Running rodas Atividade em Roedores

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...