Este trabalho foi financiado por uma doação do DFG GMT

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li><li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. 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M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo:+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery.">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li><li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods:+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans.">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li><li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila.">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Uma grande vantagem da Drosophila como sistema modelo é que ele permite a análise do desenvolvimento e função do nível de células únicas. Isto é especialmente útil em relação ao sistema nervoso, onde a diversidade de tipos de células é excepcionalmente elevada e a função e morfologia de células vizinhas pode ser totalmente diferente. O método que apresentamos aqui permite a marcação de neurónios individuais, com um corante que pode ser transformada em uma mancha ...

O conhecimento da morfologia neuronal ao nível das células individuais é um requisito chave para a compreensão da conectividade neuronal e função do SNC. Assim, desde os primeiros dias da neurociência, os pesquisadores têm procurado desenvolver técnicas única célula de rotulagem (ver 7 para um tratamento histórico da questão). Os métodos clássicos, tais como a coloração de Golgi proporcionar excelente resolução da morfologia neuronal, mas não são adequados, se se procura identificar um tipo específico de neurónios de uma forma dirigida, tal como a coloração ocorre de uma forma aleatória. O desenvolvimento de métodos para a coloração de células isoladas através de injecção intra celular ou juxtacellular de corantes a partir de um microeléctrodo dirigida a exigência de rotulagem específico. A aplicação de uma única injecção de corante para neurónio Drosophila apresentou um desafio importante, devido ao tamanho pequeno de tanto o organismo e dos seus neurónios. No entanto, a coloração único neurónio de Drosophila embrionárias </em&gt; Neurônios foi alcançado em meados dos anos 1980 no laboratório de Corey Goodman 15. Enquanto o método tem sido eminentemente útil e forneceu algumas informações importantes sobre mecanismos de desenvolvimento neuronal em Drosophila ao longo dos últimos 20-30 anos (por exemplo, 2, 10), muitos trabalhadores têm se esquivado de que, em grande parte por causa de suas exigências técnicas. A disponibilidade nos anos mais recentes de técnicas genéticas para a rotulagem de neurônios em Drosophila também tem contribuído para a impopularidade da injeção único neurônio corante. Expressão GAL4-dirigido de construções de membrana-alvo GFP pode fornecer excelente resolução de morfologia neural 1, 20. No entanto, este método tem certas limitações: a expressão muitas vezes inevitável da GFP em células múltiplas podem obscurecer a estrutura de neurónios individuais e um condutor da linha de GAL4 pode não estar disponível para conduzir a expressão de um neurónio particular de interesse. O MarcM (Análise de mosaico com um representantemarcador de células ressible) Método 8 pode fornecer a rotulagem de qualquer neurónio essencialmente ao nível da célula individual, mas não pode ser utilizada com sucesso no embrião e larvas cedo por causa da rotação lenta da proteína GAL80. Dadas estas limitações de rotulagem genética, acreditamos que a injecção de corante único neurónio no embrião de Drosophila continua a ser uma técnica valiosa e merece uma aplicação mais ampla. Para promover este objectivo, oferecemos aqui uma descrição detalhada do método. Uma ilustração de sua energia é fornecida pela nossa recente de conta a morfologia do conjunto completo de interneurônios neuromeres abdominais do embrião de Drosophila tardio 14. Neste estudo, o que revelou a variabilidade tanto morfológica individuais tipos de células neuronais e os princípios da organização neuromere no SNC do embrião, não teria sido possível com qualquer outro método de marcação disponíveis.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml em 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Sondas Invitrogen / Molecular </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml em etanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldeído</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% em PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glicerina </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% em PBS </td></tr><tr><td> Heptano Cola </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> diluir ca. 1 a 1 com n-heptano </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> para visualizar e documentar bulas de fluorescência </td></tr><tr><td> DC - ummplifier </td><td> Dragan Corporação </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> para executar as bulas </td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> para preparar e disect embriões </td></tr><tr><td> Plana Capilares </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> diâmetro exterior 1 mm; glas espessura 0,1 milímetros </td></tr><tr><td> Injeção Capilares </td><td> Produtos ciência </td><td> 100 GB TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> R micromanipulador </td><td> Leica </td><td></td><td> para executar as bulas </td></tr><tr><td> Modelo P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> para puxar capilares </td></tr><tr><td> Slides objeto </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio científica </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> para ver bulas após fotoconversão </td></tr><tr><td> Microscópio científica </td><td> Olimpo </td><td> BX50 </td><td> para executar as bulas </td></tr><tr><td> Câmera de vídeo Sony MC3255 </td><td> Sony / AVT Chifre </td><td> Sony MC3255 </td><td> para gravar rotulamentos após fotoconversão </td></tr></tbody></table> Tabela 1.

labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster

Neste artigo vamos descrever como individualmente rotular neurônios no sistema nervoso central embrionário de Drosophila melanogaster por injecção juxtacellular do DiI marcador fluorescente membrana lipofílica. Este método permite a visualização da morfologia das células neuronais em grande detalhe. É possível marcar qualquer célula no sistema nervoso central: os corpos celulares dos neurónios-alvo são visualizadas sob óptica DIC ou por expressão de um marcador fluorescente tal como GFP genética. Após a marcação, o DiI pode ser transformado em um castanho mancha permanente por fotoconversão para permitir a visualização da morfologia das células, com luz transmitida e óptica DIC. Alternativamente, as células marcadas com DiI pode ser observada directamente em microscopia confocal, permitindo geneticamente introduzidos proteínas repórter fluorescentes a ser colocalised. A técnica pode ser usada em qualquer animal, independentemente do genótipo, tornando possível a análise fenótipos mutantes a resolução de células simples.

A Figura 4 ilustra os resultados típicos da técnica, é descrita aqui. Figura 4A mostra um exemplo de um interneurônio DiI cheio único que foi limpa photoconverted. Ele demonstra muito bem a quantidade de detalhes estas oferecem preparações. Quando visto sob óptica DIC contexto espacial da célula marcada no interior do tecido não-rotulada envolvente se torna visível, por exemplo, a posição do corpo da célula dentro do córtex e da projecção de fibras dentro do ne...

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Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC) de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões, o que permite a análise da morfologia neuronal ou por luz transmitida ou microscopia confocal.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

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Neuroscience

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

12.6K visualizações.  University of Mainz. Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC) de Drosophila Embriões, o que permite a análise da morfologia neuronal ou por luz transmitida ou microscopia confocal.