Este protocolo é significativo porque demonstra um método central de lesão cerebral que desencadeia neurogênese adulta em Drosophila, onde normalmente não há nenhum. Prevemos que o uso dessa técnica para entender os mecanismos moleculares subjacentes à neurogênese adulta será relevante para a regeneração neural humana. Aprender essa técnica requer paciência e perseverança.
Recomendamos praticar em cinco a 10 cérebros diariamente por várias semanas antes de coletar cérebros para análise. Depois de anestesiar as moscas em uma almofada de dióxido de carbono. Classificar moscas jovens machos de F1 recém-fechados dentro de seis horas de eclosão e colocá-los em frascos limpos contendo alimentos com 40 ou menos moscas por frasco.
Se o planejamento de rotular células divisórias com EdU preparar 200 microlitres de 50 milhões ou mais de EdU em 10% de sacarose e colocar a solução preparada em um papel filtro de grau três redondo de 23 milímetros em um frasco vazio, em seguida, coloque as moscas machos no frasco para pré-alimentação seis horas antes da lesão. Em seguida, higienize os Pinos Minutien colocando aproximadamente 100 pinos em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro preenchido com 70% de etanol por cinco minutos. Em seguida, higienize a almofada de dióxido de carbono e o pincel pulverizando 70% de etanol e limpando seco com um tecido limpo sem fiapos.
Uma vez que as ferramentas estejam limpas e secas, transfira 40 ou menos machos de F1 classificados para a almofada limpa e separe-os em dois grupos. Um grupo servirá como o controle de moscas não feridas. E o segundo grupo experimental será submetido a lesões cerebrais traumáticas penetrantes.
Em seguida, usando fórceps puxam quatro a cinco novos pinos Minutien para fora do tubo de micro centrífuga e os colocam perto da borda da almofada de dióxido de carbono. Em seguida, sob o escopo de dissecação escolha um pino minutien liso com um ponto afiado. Reutilize pinos afiados e coloque pinos danificados ou sem corte em um tubo separado contendo 70% de etanol para descarte seguro.
Em seguida, para moscas com o interruptor de genótipo transversal padrão na lâmpada LED de microscópio estéreo equipada com os filtros de excitação e emissão adequados para a proteína de fluorescência verde que permite excitação entre 440 e 460 nanômetros e permite a visualização entre 500 e 560 nanômetros. Em seguida, escolha uma mosca do grupo experimental e posicione a mosca de tal forma que o experimentador tenha uma visão dorsal da cápsula da cabeça com as moscas cabeça para a direita. Usando fórceps, pegue e segure o pino Minutien selecionado em uma mão, e o pincel na outra mão.
Em seguida, coloque o pincel no anterior do tórax dorsal e empurre suavemente para baixo para estabilizar a mosca. Mire a ponta do pino Minutien nos corpos das células dos corpos de cogumelos no lado direito da cabeça e penetre a cápsula da cabeça. Se usar pontos de referência, a cutícula dorsal da cabeça entre o ocelli e a borda dorsal do olho.
Após completar a lesão, use o pincel para empurrar a cabeça suavemente para fora do pino Minutien. Se usar o cérebro para sequenciamento de RNA ou QRT PCR nos fazem a segunda lesão no lado esquerdo da cabeça. Uma vez que todas as moscas experimentais foram feridas colocam o controle e moscas feridas em frascos rotulados separados contendo alimentos.
Coloque os frascos horizontalmente para evitar que as moscas se apanhem na comida. Coloque a cruz padrão voa a 25 graus Celsius e permatwin voa a 30 graus Celsius para envelhecer. Se envelhecer mais de 24 horas, transfira as moscas em alimentos limpos a cada um a dois dias.
Observou-se aumento significativo na proliferação 24 horas após a lesão usando anti pH3 um marcador para células submetidas ativamente à mitose. Aproximadamente três células positivas de pH3 são observadas em cada um dos cérebros centrais de controle. E 11 células positivas de pH3 em cada um dos cérebros centrais feridos.
Em sete dias, uma média de duas células positivas da EdU estão presentes em cada um dos cérebros das células de controle. E 11 células positivas de EdU em cada um dos cérebros centrais feridos, o que é semelhante aos resultados obtidos 24 horas após a lesão com anticorpo pH3. Aos 14 dias, os controles medianavam uma célula positiva da EdU por cérebro central, e cérebros feridos mediam 29 células positivas EdU por cérebro central.
Demonstrando que a proliferação celular continua pelo menos até a segunda semana após uma lesão cerebral traumática penetrante. A resposta proliferativa mais forte no cérebro central é observada quando os cérebros são feridos nas primeiras 24 horas após a eclosão. Em sete dias após a eclosão, uma lesão penetrante ainda causa um aumento significativo na proliferação.
No entanto, em 14 dias, a capacidade das células de dividir diminui significativamente para uma célula divisória por cérebro. O que é semelhante ao dos cérebros de controle. Usando o sistema de rotulagem permatwin mais clones permatwin foram detectados em amostras feridas em dois dias, em duas semanas, em comparação com os controles.
Com o número de clones aumentando ao longo do tempo após a lesão. Duas semanas após a lesão, havia novos neurônios do corpo de cogumelos em 50% dos cérebros feridos. Esses novos neurônios projetaram seus dendritos aproximadamente para o calyx do corpo do cogumelo, e axônios para os lobos do corpo do cogumelo.
Outras áreas do cérebro que pareciam se regenerar incluem o corpo elipsoide lóbulos antennal e chifre lateral. Certifique-se de usar um pino minutien afiado ao fazer as lesões cerebrais como uso de um pino maçante ou dobrado aumentará a mortalidade. Certifique-se também de não pressionar muito as moscas com o pincel, pois isso também aumentará a mortalidade.
Após esse procedimento, a imunohistoquímica pode ser usada para quantificar a auto proliferação e também para identificar novos neurônios e glia.
