Este trabalho foi apoiado pela divisão de pesquisa intramural no National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) e um Lenfant Biomédica bolsa pós concedidos a DAL.

1. Preparação de materiais necessários para Explante Brains terceiro instar larval <ol><li> Preparar as ferramentas necessárias para a microdissecção. <ol><li> Forjar duas ferramentas de dissecação (um bisturi e um gancho), colocando primeiro um único pino de dissecação em cada titular pino. Prenda os pinos firmemente com a mão ou com um alicate (Figura 1C). </li><li> Use um par de pinças de idade para dobrar um pino de dissecação de um ângulo de aproximadamente 120 °. Faça isso sob um microscópio de dissecação para garantir que a metade superior do pino fica plana quando o titular do pino é segurado na mão. Esta ferramenta deverá ser utilizada como um bisturi para soltar ou cortar através do tecido. </li><li> Utilizar um par de pinças de idade para dobrar o segundo pino para um gancho que vai ser utilizado para segurar e raspar o tecido. </li><li> Cobrir cada uma das ferramentas de dissecação com uma ponta de pipeta para proteger as ferramentas de danos. Com cuidado, ferramentas bem formadas podem ser usados ​​para dissecção indefinidamente. Substitua pinos danificados ou deformados, se necessário. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Prepare dissecando médio. <ol><li> Em uma capa de cultura de tecidos, diluir o suplemento de antibiótico-antimicótico em meios de cultura da Schneider. Agitar os meios de incorporar o suplemento. </li><li> Prepare várias alíquotas de 5 ml de meio suplementado. Guarde todos os meios a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Aquecer-se uma alíquota de 5 ml de meio de cultura suplementado para a temperatura ambiente. Desenhe o meio em um estéril seringa de 5 ml e parafuso em um filtro estéril seringa 0,2 m. </li></ol></li><li> Selecione larvas para dissecção. Use uma sonda dissecando para selecionar o rastreamento de larvas de terceiro estádio como o cérebro vai ser mais fácil de dissecar. Opcional: larvas de depósito em uma placa de ágar de uva. Nota: Não use frascos excessivamente cheia ou as garrafas com &quot;comida molhada&quot;, uma vez que estes tendem a forçar segundo ou primeiro larvas se arrastar para fora prematuramente. Nota: Algumas origens genéticas exigirá usando larvas mais jovens. Isso não afeta o protocolo, mas faz a dissection mais difícil. </li></ol> 2. Dissecção do Sistema Nervoso Central <ol><li> Em uma única lâmina de vidro, criar duas piscinas de 50 ml de meio de dissecação quentes, separadas por cerca de 3 cm. Uma piscina será utilizada para dissecção e outros utilizados para dissecção fina (Figura 1C). </li><li> Transferir várias larvas de uma das gotas de comunicação. </li><li> Mova a lamela com larvas de um microscópio de dissecação. Zoom na piscina contendo as larvas de tal modo que as extremidades anterior e posterior das larvas são discerníveis. </li><li> Use um pares de fórceps para apreender o meio-região de uma única larva. Tome um segundo par de pinças na outra mão e agarrar a larva perto da mesma região. Puxe os dois pares de fórceps para além de rasgar delicadamente a larva ao meio. Repita os dois passos acima para todas as larvas na lamela. </li><li> Descarte as metades posterior do corpo larval, transferindo-os para um tecido. </li><li> Zoom em uma larva de modo que poe mouthhooks anteriores são claramente visíveis. Usar dois pares de forceps para criar uma pequena incisão, ou entalhe, em lados opostos das mouthhooks larvais entre o terceiro torácica e bandas denticle primeiros anterior. </li><li> Segure as mouthhooks com a pinça na mão não-dominante. Use a pinça na outra mão para descascar suavemente a cutícula em uma direção ântero-a-posterior. Continue a remover lentamente cutícula até que o sistema nervoso central está exposta. </li><li> Isolar o sistema nervoso central, a partir do resto da larva por rasgar os tecidos com a pinça. Tenha cuidado para não perturbar o sistema nervoso central. Passo crítico: Não puxe o sistema nervoso central! Descarte amostras danificadas com um cabo rompido ventral do nervo (Figura 2A) ou lóbulos ópticos distorcidas (Figuras 2B e 2B). </li><li> Repita os dois passos acima para todas as larvas na lamela. Transferir o tecido enxertado saudável para osegunda (limpo) piscina de meio na lamela para a fase de dissecação bem. </li><li> Use as ferramentas de pinos de dissecação para limpar os tecidos periféricos (por exemplo, olhos, asas e pernas discos) do cérebro. Deslize o bisturi entre o queria (cérebro) eo tecido indesejado, prendendo o tecido conjuntivo para a lamela. Use o gancho para provocar suavemente o tecido indesejado enquanto pressiona simultaneamente o bisturi para a lamela em movimentos de serra-like. </li><li> Passo crítico: Trabalhe lentamente e deliberadamente para remover todos os discos de cada cérebro. Tenha cuidado para não perturbar a morfologia do cérebro. Um cérebro saudável terá um cordão intacto ventral do nervo e simétrica, lobos ópticos redondos (Figura 2C). </li></ol> 3. Montagem Brains explantado for Imaging ao vivo <ol><li> Inverta a placa de cultura de 50 milímetros permeável ao gás com a película transparente virada para cima (Figura 2D). Pressione a seringa para depositar uma pequena queda (cerca de 30 mL) de meio em tele o centro do prato. </li><li> Transferir os cérebros isolados, um de cada vez, para a gota do meio do prato. Use a ferramenta gancho para pegar um cérebro sob os lóbulos ópticos. Em alternativa, utilize uma pinça para agarrar axônios se projetam a partir do cordão nervoso ventral. </li><li> Colete 5-10 cérebros na queda de meio. Submergir os cérebros usando as ferramentas de pinos de dissecação para empurrar cérebros individuais para a parte inferior da gota de meio como muitos deles serão presos no menisco (Figura 2E). </li><li> Orientar os cérebros utilizando as ferramentas de pinos de dissecação para alinhar cérebros dependendo do RN a ser trabalhada (Figura 3A). Para a imagem do RN dorsal, coloque o cordão nervoso ventral virada para baixo (ao longo da membrana). Para os RN imagem Antério-ventral, coloque o cérebro com o cordão nervoso ventral voltada para cima (longe de membrana). Alinhar o cérebro de modo a que todos os cordões nervosos ventrais apontam na mesma direcção no plano xy. </li><li> Use uma seringa ou de transferência de plástico pipette colocar 4 halocarboneto (HC) gotas de óleo (cerca de 30 mL cada) para a membrana permeável a gás. O volume de cada gota de óleo deve ser equivalente ao outro e para a gota de meio. Espaço as gotas de óleo correspondem aos quatro cantos de uma lamela centrado ao redor da gota de meio de cultura. Uma vez concluída, as cinco gotas (quatro gotas de óleo e uma gota de meio no centro) será semelhante as cinco facetas em estilo ocidental dados (Figura 3B). </li><li> Diminuir a # 1,5 22 milímetros lamela sobre a montagem de tal forma que ela atinge todos os 5 gotas, ao mesmo tempo. A manutenção de uma pressão uniforme através das amostras reduz a probabilidade de que eles serão interrompidos. Espera cerca de 3 minutos, como o petróleo e meio dispersar sob o peso da lamela. A forma de cruz-como dos meios de comunicação formarão (Figuras 3C e 3D). </li><li> Passo crítico: Abaixe a lamela sobre a superfície do cérebro, removendo o excesso de mídia usando um pavio de papel tissue (Figure 3C). Faça isso enquanto assistia a amostra sob o escopo de dissecação. Como a mídia é removido, a lamela vai diminuir. Pare de uma vez a lamela toca os cérebros. Não excesso de pavio, pois isso fará com que a distorção do tecido do cérebro ou explosões. </li><li> Se imagem dorsal RN (Figura 3E), passar para o passo 3.9. Se imagem RN Antério-ventral, a lamela deve ser ligeiramente movido (por gentilmente empurrando-o com uma pinça) na direção das pontas do cordão nervoso ventral. Isso faz com que o cérebro a girar, que traz os lóbulos cerebrais em contato direto com a lamela para facilitar a imagem (Figura 3F). </li><li> Selar a câmara cercando a lamela com pequenas quantidades de óleo de hidrocarbonetos halogenados (Figura 3D). O excesso de exsudação do óleo lamela deve ser minimizado e apagou afastado com um lenço de papel. </li></ol> 4. Imagens ao vivo da Central Neuroblastos cérebro Nota: Para este trabalho, a fiação de disco Nikon Eclipse Timicroscópio confocal (microscópio invertido) foi usado para imagens em tempo real; detalhes de nossa configuração foi publicado anteriormente 31. Alternativamente, a amostra pode ser visualizada usando um sistema vertical. <ol><li> Adicionar uma gota de óleo de imersão para a lamela logo acima dos cérebros montados. Isso ajudará a centrar o objetivo diretamente acima da amostra. </li><li> Passo crítico: Manter os cérebros a uma temperatura constante de 25 ° C, com uma fase de incubadora. Suavemente posicionar a amostra montada na incubadora fase e cobrir a câmara com a sua tampa. </li><li> Localize RN cerebrais centrais usando luz transmitida, concentrando-se sobre as células grandes e redondas que residem nas áreas centrais e mediais dos lobos ópticos, não use epi-fluorescência. Isto torna-se mais fácil com a prática. É muito importante para expor a amostra para a menor quantidade de luz possível. Não perca tempo cérebros de imagem que estão danificados. </li><li> Uma vez no local, tomar posições rápidas usando o confocal adeterminar a localização adequada e profundidade. Limitar a profundidade para o primeiro de 10-15 ^ m. Ajuste conforme o necessário, e ter outra imagem de teste. <ol><li> Etapa opcional: Colete um filme teste do cordão nervoso ventral para garantir que não haja desvio xy. Se deriva é detectado, esperar 15-30 min para a amostra para resolver. Se a deriva não resolve em 30 minutos, preparar uma nova amostra. Maior deriva geralmente pode ser rastreada até a adição de excesso de óleo, ou o tamanho desigual de gotas de óleo durante a montagem. </li></ol></li><li> Para eliminar desvio axial (z-drift) usar um dispositivo com foco automático contínuo que usa um LED infravermelho. Alternativamente, corrigir manualmente o plano focal. </li><li> Uma vez que um NB de interesse é identificado, prossiga com regime de imagem. Tal como acontece com todas imagens de células vivas, a quantidade de luz laser, tempo de exposição, câmera binning, ampliação objetiva, tempo e / ou intervalo z-passo devem todos ser empiricamente otimizado para uma experiência particular para responder à pergunta em questão. O objetivo é minimizar barragem luzidade, enquanto ainda a coleta de dados úteis. Veja a discussão para orientação adicional. <ol><li> Imagem de todo o volume do RN através da recolha de 12-14 imagens espaçadas de 1 mícron no eixo z. Ajustar o tempo de resolução para captar os ciclos celulares simples ou múltiplos de um mesmo NB. Como orientação geral, use 10-30 intervalos seg para a imagem latente do ciclo celular única e 1-3 minutos de intervalo para vários ciclos celulares. </li></ol></li><li> Passo crítico: Confirme se a amostra é saudável, monitorando a duração da mitose. Se mitose leva mais de 15 minutos, passar para outro cérebro. Um cérebro saudável vai mostrar muitos RN dentro do mesmo campo de visão passando por várias rodadas de mitose. Note-se que cada ciclo celular é ligeiramente mais longo do que o anterior, devido a danos provocados pela luz. </li><li> Depois de imagens estiver concluída, desmontar a câmara de incubação, e descartar tudo, mas os pratos de cultivo gás-permeáveis. Lavar superfície prato da cultura com 95% de etanol e limpar bem com um tecido. Repita mais duas vezes. </li&gt; </ol> 5. Preparação de cérebros para Imunofluorescência <ol><li> Colete 20 ou mais explantes cérebros em um tubo de 1,5 ml contendo aproximadamente 0,2 ml de meio suplementado. </li><li> Remova o meio a partir do tubo e lavar uma vez com cérebros 0,5 ml PBSTx (Tampão fosfato salino, PBS, com 0,3% de Triton X-100). Vamos cérebros assentar no fundo do tubo de entre todas as trocas de líquido. O detergente Triton X-100 é usado para permeabilizar o tecido. A lavagem geralmente leva menos de 30 seg; simplesmente remover o PBSTx uma vez cérebros se instalaram para o fundo do tubo. </li><li> Substitua a solução com 0,5 ml de 9% elétron paraformaldeído grau microscopia diluído em PBSTx. Incubar com nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Descarte de fixador acordo com os regulamentos de resíduos perigosos. </li><li> Lavar as amostras com 0,5 ml PBSTx durante 15 min. Repita o passo de lavagem com PBSTx fresco mais duas vezes. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de PBT (PBS, 1% Albumina de Soro Bovino (BSA), e 0,1% de Tween-20). Incubar com nutação durante 1 hora à temperatura ambiente. Bloqueia a ligação não específica de anticorpos para o tecido esta etapa. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de anticorpo primário diluído em PBT suplementado com 4% de soro de cabra normal (NGS). Incube com nutação durante a noite a 4 ° C. </li><li> Descarte ou salvar o anticorpo primário diluído. </li><li> Lavar as amostras com 0,5 ml de PBT durante 15 min. Repita o passo de lavagem com PBT fresco mais duas vezes. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de modificada PBT (PBS, BSA a 2%, 0,1% de Tween-20 e 4% de NGS). Incubar com nutação durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de anticorpo secundário diluído em PBT modificado. Incubar com nutação durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de PBST (PBS com 0,1% de Tween-20). Incubar com nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem com PBST fresco mais duas vezes. </li></ol><ol><li> Transferir cuidadosamente as amostras, tal como uma gota sobre uma lâmina de vidro, limitando a queda para o lado esquerdo do centro da lâmina. </li><li> Adicionar uma grande gota (cerca de 2 cm de diâmetro) de meio de montagem (por exemplo, Aqua-Poly/Mount) para o centro da lâmina. Evite a piscina de PBST que é para a esquerda. </li><li> Use uma pinça para transferir os cérebros a partir da piscina de PBST para o tanque de meio de montagem. A adição de meio de montagem directamente na parte superior do cérebro pode perturbar a sua orientação e deve ser evitada. </li><li> Sob um microscópio de luz, providenciar as amostras no meio de montagem com o lado que vai ser trabalhada voltada para cima. </li><li> Com a lâmina sob o microscópio de luz, abaixe lentamente uma lamela de vidro # 1.5 no topo das amostras. Etapa opcional: Desalojar bolhas de ar menores levemente empurrando a lamela. </li><li> Permitir que o meio de montagem para polimerizar por várias horas, ou durante a noite, por mentir lâminas planas, de luzprotegida, à temperatura ambiente. </li><li> As lâminas podem ser visualizados no dia seguinte, ou armazenados para imagem. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Imagens de células vivas é uma abordagem valiosa usada para estudar os mecanismos que regulam a ACD de células-tronco, a diferenciação de linhagens celulares, ea morfogênese de tecidos complexos. Embora os grupos de pesquisa têm historicamente utilizada uma variedade de técnicas para visualizar NB ACD, estas abordagens podem ser geralmente agrupadas em duas categorias que diferem principalmente no que diz respeito ao facto de o tecido cerebral é deixada intacta ou dissociada. Imagem...

As células-tronco manter um equilíbrio de diferenciação e auto-renovação para gerar diversidade celular durante o desenvolvimento precoce e substituir as células danificadas em tecidos adultos. A regulação deste homeostase impede tanto a perda como sobre-expansão da população de células estaminais, o que pode resultar em degeneração de tecido nocivo ou tumorigénese. Os neuroblastos (RN), são as células estaminais neurais amplamente estudadas do sistema nervoso central de Drosophila (Figura 1A), que durante a primeira forma estágios embrionários 1, 2. RN submetidos a repetidos ciclos de divisão celular assimétrica (ACD) para produzir duas células desigualmente predestinadas: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação celulares. ACD é guiado por centrossomas, as organelas não-membranosas que atuam como centros de microtúbulos-organização da maioria das células 3. Durante a mitose, centrossomas NB organizar e orientar o fuso mitótico bipolar ao longo do apical-basal polareixo dade. Após a clivagem da NB dividindo, determinantes destino apicais que especificam o destino de células-tronco, e determinantes destino basais que especificam diferenciação, são segregados em células filhas desiguais. No cérebro central larvar, dois tipos de RNs podem ser distinguidas pelo seu número, posição, expressão do factor de transcrição, e da linhagem de células (Figura 1A) 4-6. Tipo I RN são os mais abundantes, e cerca de 90 deles preencher os anteriores e posteriores lados de cada lóbulo óptico do cérebro 7. Estes RN expressar o fator de transcrição Asense (ASE), e eles caracteristicamente se dividem em uma auto-renovação NB e um menor célula-mãe gânglio (GMC; Figura 1B). Cada GMC passa por uma única divisão terminal para gerar dois neurônios ou células gliais (Figura 1B). Em contraste, os RN oito do tipo II que povoam o lado posterior de cada lobo óptico falta Ase expressão 5. Eles sofrem ACDpara produzir um NB auto-renovação e um progenitor neural intermediária (INP). O INP, por sua vez, divide assimetricamente três a cinco vezes. Cada uma dessas divisões conduz à regeneração do INP e a produção de um único GMC 4. Colectivamente, a identidade específica NB e a ordem temporal de GMC nascimento dá origem à diversidade surpreendente neuronal do sistema nervoso central adulto. Compreender a biologia das células que subjaz NB ACD foi vastamente melhorada através do uso de técnicas de imagem de células vivas. Publicado protocolos utilizados pelos pesquisadores para a imagem RN ao vivo variam muito. Em geral, no entanto, estes métodos podem ser agrupados em duas categorias gerais que se distinguem pelo facto do cérebro larval é deixada intacta ou mecanicamente dissociadas. Ambas as técnicas apresentam vantagens e desvantagens distintas, dependendo da aplicação do pesquisador. Os primeiros relatos revelam divi célula NB ao vivoes envolvem um certo grau de dissociação Manual do cérebro larval. Estes protocolos detalhes manchas 8 ou 9 provocando além do cérebro, a fim de crescer culturas primárias de curto prazo do RN em lamínulas. Para melhorar a imagem, os RN redondas são geralmente achatado nas lamelas em que suas lâminas de vidro 8 ou almofadas de agarose 9. Embora as células achatadas têm melhorado óptica, estas técnicas conduzem frequentemente a defeitos mitóticas RN, incluindo a regressão do sulco de clivagem e a incapacidade para se dividem mais do que uma vez. Por conseguinte, os protocolos que envolvem a dissociação manual e distorção física do tecido cerebral de larvas são geralmente apenas adequados para a muito curto prazo (isto é., Um ciclo de célula ou menos) aplicações. Da mesma forma, semi-esmagamento ou achatamento completamente cérebros intactos entre lâminas de vidro e lamelas limita o tempo pode-se passar a imagem de um dado espécime para um período de 10 minutos, aproximadamente, 30. Apesar desta limitação, this abordagem tem sido utilizada com sucesso 11-14. Esforços recentes para a imagem ao vivo dissociada limite RN distorção física das células isoladas. Estas técnicas são particularmente úteis para aplicações em que é necessária para sustentar a culturas de células de múltiplos ciclos de divisão celular. Por exemplo, as células dispersas do cérebro dissociados manualmente pode ser parcialmente incorporado num coágulo feita a partir da mistura de fibrinogénio e trombina 15 para geração de imagens de longo prazo 16. Alternativamente, os cérebros explantados pode ser primeiro quimicamente dissociados com a enzima colagenase, próximo interrompido manualmente, por passagem repetida através de uma ponta de pipeta, e subsequentemente semeadas em poli-L-lisina-revestidas de vidro pratos de fundo 17, 18. Revestimento pratos de vidro com ou fibrinogênio ou poli-L-lisina promove o anexo e leve disseminação de células redondas, trazendo-o mais próximo da lamela quanto possível, sem grande distorção física. Em comum, alémem, estes métodos envolvem a cultura da RN em meio que pode ser facilmente trocado por experimentos de perturbação farmacológicas 18. No geral, chapeamento diretamente dispersa RN melhora óptica de imagem sem sacrificar a capacidade de imagem de longo prazo. Recentemente, um protocolo descrevendo a cultura de longo prazo de dissociada RN foi detalhado 19. No entanto, esta abordagem não é sem as suas limitações. Existem várias ressalvas à imagem RN ao vivo dissociados. Num campo de células dispersas, por exemplo, é difícil identificar linhagens NB específicos que são espacialmente organizadas no cérebro intacto 1. Da mesma forma, distinguir o tipo I versus Tipo II RN no tecido dissociado é também um desafio, sem a expressão de marcadores de linhagem ou transgenes específicos do subtipo, como worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Embora esses transgenes são bastante úteis para algumas aplicações, eles não limitam aos investigadores transgenes expressionado sob o controlo do elemento intensificador UAS 21 e exigem sistemas genéticos mais complexos. Estudos que dizem respeito ao desenvolvimento espacial ou temporal de RN, portanto, exigem in vivo de imagens no contexto de um tecido intacto. Além disso, estudos de RN embrionárias dissociadas indicam que o contacto físico das células adjacentes é crítica para a localização da interfase de polaridade chave determinantes 22, 23. Esses estudos mostram completamente isolado RN não mais manter o eixo do fuso mitótico invariante. Em vez disso, estas células apresentam um eixo de fuso mais aleatórios e largos ângulos de separação entre as sucessivas gomos GMC, talvez devido à perda de apicais posicionamento centrossoma 22. Embora a relação entre os RN de larvas e suas células vizinhas não tem sido extensivamente estudada, vale a pena considerar que o microambiente de células-tronco larval pode invadir a polaridade celular ou outrocomportamentos. Para manter o contexto fisiológico de larvas RN, que imagem a partir de cérebros inteiros de ACD. Dadas as limitações inerentes a imagem dissociada RN, o nosso laboratório e outras estabeleceram protocolos de imagem sucessivas rondas de NB ACD de cérebros larvas inteiras. Técnicas para a imagem cérebros intactos, muitas vezes substituir a superfície rígida de vidro de um lado da câmara de cultura com uma membrana flexível, para evitar a distorção do tecido ou danos e para permitir a troca de gás. Alguns métodos envolvem a montagem cérebros explantados em uma mistura de meio de insecto de cultura, soro, e ácido ascórbico com os corpos gordos isolados a partir de dez larvas 24. Os corpos gordos isolados são adicionados porque eles secretam um mitógeno conhecido por estimular a divisão celular NB 25. Este protocolo preserva a integridade do tecido por mais de 3 horas e é, por isso, passíveis de imagens de longo prazo 24, 26-28. Recentemente, um protocolo descrevendo o lonimagiologia g prazo de cérebros larvais intactas na presença de ácido ascórbico, o soro, e corpos gordos foi detalhado 29. Importante, porque o tecido é exposto nem nem imobilizados, esta abordagem é menos útil para aplicações onde o meio de cultura é trocado (por exemplo, estudos de drogas, imunodepleção, etc.). Nosso laboratório simplificou toda a preparação monte de cérebros de larvas vivas para imagens de longo prazo 30, 31. A principal vantagem para o nosso protocolo sobre os outros é a sua simplicidade: as nossas observações indicam nem soro, ácido ascórbico, a insulina, nem corpos gordos são aditivos necessários à Imagem sucessivas rondas de NB ACD. Apesar de aditivos, tais como insulina, têm sido úteis para a imagem prolongado de divisões de células-tronco 32 e migração celular colectivo em Drosophila ovários 33, eles parecem ser dispensável para NB ACD, como nosso meio de imagem consiste de uma mistura simples de standard meio de cultura de células de inseto suplementado com antibiótico-antimicótico para evitar a contaminação. Através do uso de placas de cultura de fundo gás-permeáveis ​​ou de vidro reutilizáveis, temos sido capazes de sustentar várias rodadas de sucessivas NB DACs. As mesmas amostras de explante pode ser prontamente utilizado para imunofluorescência e outros procedimentos com tecido fixado. Neste protocolo, detalhamos a dissecação de cérebros de larvas intactas, bem como a preparação de cérebros para a análise tanto ao vivo e fixo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td style="width:167px;">A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Schneider&#39;s S2 Medium</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider&#39;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Glass coverslips, #1.5 22X22 mm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Minutien dissecting pins</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissecting needle/probe with plastic handle</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe filter, 0.22 mm pore size</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">plastic transfer pipet</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S30467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:380px;">paraformaldehyde, 32% EM-grade</td>
			<td style="width:185px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714</td>
			<td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">DAPI (4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18606-20</td>
			<td>A water-soluble mounting medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

As células-tronco se dividem de forma assimétrica para gerar duas células de progênie com desigual potencial destino: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação de uma célula. Dada a sua relevância para o desenvolvimento e da doença, compreender os mecanismos que regem a divisão de células-tronco assimétrico tem sido uma área forte de estudo. Porque eles são geneticamente tratável e submetidos a ciclos sucessivos de divisão celular uma vez a cada hora, as células estaminais do sistema nervoso central, de Drosophila, ou neuroblastos, são modelos indispensáveis ​​para o estudo da divisão de células estaminais. Cerca de 100 células estaminais neurais estão localizadas próximo da superfície de cada um dos dois lobos cerebrais larvais, tornando este sistema modelo particularmente útil para estudos de microscopia de imagens em tempo real. Neste trabalho, nós revisamos várias abordagens amplamente utilizado para visualizar as divisões de células-tronco, e abordar as vantagens e desvantagens relativas as técnicas que empregam dissociados contra tecidos cerebrais intactas. Nós também detalhar nossa simplifprotocolo IED usado explantar cérebros inteiros a partir de larvas de terceiro estádio de imagens de células vivas e aplicações de análise fixos.

Imagens ao vivo elucidou uma série de mecanismos que regulam NB ACD. Antes da aquisição da imagem, é necessário determinar as condições de imagem ideal. É necessário equilibrar a taxa de captura de quadro com a duração de imagens de células vivas. Para a análise celular fina, por exemplo, o aumento temporal e resolução óptica pode ser necessária. Ao visualizar um único ciclo celular NB (Figura 4A), a taxa na qual as imagens são captadas pode ser aumentada, sem a introdução de fotoen...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.7K visualizações.  National Institutes of Health.  Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados. 

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Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

Espectroscopia de Ressonância Magnética de viver Drosophila melanogaster Usando Angle Spinning Magia

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Neurociência

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Usando Canais Linear de agarose para o Estudo<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larval Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.