BSS é suportado pelo NIH grant (R01 AI076457) e os fundos concedidos pela Universidade Stony Brook. Z.Q. é suportado pelo NIH conceder (K12 GM102778).

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as orientações do Instituto Nacional de saúde e aprovados pelo Comitê de uso e Stony Brook University institucional Cuidado Animal.
Nota: Certifique-se que todas as aprovações são concedidas antes da realização de procedimentos.
1. preparação da solução
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e gentamicina), 100 ×
	<ol>
<li>Misturar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g L-glutamina (200 mM final), 1 × 106 U penicilina (2.000 U/mL final), estreptomicina 1G (2 mg/mL final) e gentamicina 2,5 mg (5 µ g/mL final). Adicionar RPMI 1640 para 500 mL. Ajustar o pH a 7,5 usando NaOH (antes do ajuste, o buffer é amarelo/laranja com um pH em torno de 6.0). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,45 µm. Alíquota e loja a-20 ° C por até 1 ano ou a 4 ° C por até 1 mês.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampão HEPES-bicarbonato, 10 x
	<ol>
<li>
Misturar 23,8 g HEPES (100mm final), 21 g NaHCO3 (250 mM final) e adicionar água para 1.000 mL. Ajustar o pH para 7.2 com HCl. filtro esterilizar usando um filtro de 0,45 μm. Armazenar em temperatura ambiente. O pH é alterado ao longo do tempo. Re-ajuste o pH periodicamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colheita de mídia (~ 1 garrafa/2 ratos)
	<ol>
<li>A 500 mL de RPMI 1640, adicione 25 mL inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (5% final) e 5 mL 100 × HGPG. Armazenar até 6 meses a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de Dithioerythritol (DTE) (40 mL/pequeno intestino)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca2+- Mg2+-grátis 50 mL 10 × bicarbonato de HEPES buffer e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino (10% no final). Adicione 350 mL H2O e 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM no final). Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido (50 mL/pequeno intestino)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca2+- Mg2+-livre com 5 mL 100 × HGPG. Adicionar 445 mL H2O. Adicionar 260 µ l EDTA de 0,5 M/100 mL (final de 1,3 mM). Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de colagenase (30 mL/LP)
	<ol>
<li>A RPMI de 500 mL, adicionar 50 mL FBS (10% FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (final de 1 mM) e 1 mL 0,5 M CaCl2 (final de 1 mM). Adicionar a colagenase, tipo I (final de 100 U/mL). Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluções de (DG) gradientes de densidade
	<ol>
<li>Preparar 1 × DG solução misturando DG de 90 mL de solução (consulte a Tabela de materiais) com 10 mL de 10 × PBS. Manter estéril a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare a solução DG de 44% (8 mL/IEL, 8 mL/LP), misturando 44 mL da solução-mãe 1 × DG e 56 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.</li>
		<li>Prepare a solução DG de 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP), misturando 67 mL da solução-mãe 1 × DG e 33 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento dos linfonodos mesentéricos, intestinos e do Peyer Patches
<ol><li>Eutanásia o mouse usando narcose de dióxido de carbono e deslocamento cervical secundário. Coloque o mouse em suas costas e pulverizar com etanol a 70%. Use a tesoura para fazer uma incisão e abrir a pele e a parede abdominal para expor a cavidade peritoneal.</li>
	<li>Localize o ceco e use a pinça para puxar delicadamente o ceco. Use fórceps para deslocar cuidadosamente o intestino delgado para a direita, expondo toda a cadeia MLN, que é alinhada com o cólon. Nota: Um mapa dos gânglios linfáticos mesentéricos, cadeia e drenagem linfática do intestino foi anteriormente descrito13.</li>
	<li>Identifica o nó inferior da cadeia, localizado mais próximo ao ceco. Use um conjunto de pinças para agarrar o mesentério ou a gordura em torno dele e remova cuidadosamente a cadeia MLN do fundo ao topo por arrancas a gordura ao redor do nó de linfa com outro conjunto de pinças.</li>
	<li>Colocar a cadeia MLN sobre uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita. Remova o mesentério/gordura por rolando a cadeia da torre de papel e retirar a gordura com dois conjuntos de pinças. Coloque o MLN em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento. Nota: (i) direta manipulação de nós é desencorajada. Em vez disso, segure o mesentério ou a gordura em torno deles. (ii) é essencial para remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para melhorar a viabilidade celular.</li>
	<li>Corte o intestino abaixo do esfíncter piloro e acima o ceco com uma tesoura. Retire o intestino lentamente do íleo ao duodeno, usando um conjunto de pinças enquanto retira o mesentério/gordura anexado usando um outro conjunto de pinças.</li>
	<li>Coloque uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita o intestino e provocar qualquer mesentério/gordura restante fora com dois conjuntos de pinças. Nota: (i) Certifique-se de remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para o rendimento da célula ideal e viabilidade. (ii) manter o intestino umedecido durante esta e as etapas a seguir aplicando colheita mídia periodicamente.</li>
	<li>Colete de Peyer, removendo-as do intestino com uma tesoura curva. Use uma dissecação escopo ou lupa se necessário (iniciantes); a maioria de Peyer deve estar visíveis para o olho treinado. Colete 5-11 (típico) de Peyer do intestino. Patches do lugar Peyer em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento. Nota: De Peyer patches são pequenos, principalmente por protuberâncias na parede intestinal exterior em frente a linha de fixação do mesentério.</li>
	<li>Use o lado liso da pinça e delicadamente slide do duodeno para íleo para expelir muco e conteúdo fecal. Repeti uma vez para remover a maioria do muco. Nota: Remoção incompleta de muco pode diminuir a viabilidade celular e rendimento. No entanto, certifique-se de deslizar o intestino com cuidado para evitar descascamento vilosidades ou danificar a membrana basal.</li>
	<li>Use tesoura bem com um fim brusco em um ponto, insira a extremidade sem corte no intestino e corte o intestino aberto longitudinalmente do duodeno ao íleo. Lateralmente, corte o intestino aberto em ~ 2 cm. Coloque as peças intestinais em um tubo cónico de 50 mL com mídia de colheita frio 25 mL para etapas posteriores de isolamento. Nota: Manter a tesoura umedecida com mídia irá ajudá-los deslizar facilmente através do intestino.</li>
</ol>3. isolamento de linfócitos de Sites indutivos
<ol><li>Isole os linfócitos do MLN, dissociando suavemente através de um filtro de célula de 70 µm usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL. Lave o filtro de célula com 5 mL de mídia colheita frio.</li>
	<li>Pelota MLN-células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão. Nota: tampão de lise de células vermelhas do sangue pode ser usado para remover células vermelhas do sangue se o sangramento ocorreu durante a remoção.</li>
	<li>Isole os linfócitos de Peyer incubando de Peyer em um tubo cônico de 15 mL contendo solução de colagenase 5 mL pré-aquecido a 37 ° C e 220 rpm por 30 min.</li>
	<li>Vórtice por 15 s na configuração máxima e filtro digerido tecido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente, dissociar as restantes peças de tecido, usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL e lavar o filtro célula com 5 mL de mídia colheita frio.</li>
	<li>Células de Peyer remendo de pelotas por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão. Nota: Peyer do isolamento de patches pode ter algum contaminante linfócitos da lâmina própria e linfócitos intraepiteliais.</li>
</ol>4. isolamento de linfócitos intraepiteliais do intestino
<ol><li>Lave os pedaços de intestino três vezes com 25 mL de mídia colheita frio por inversão do tubo 10 vezes, deixando as peças intestinais resolver e decantar o líquido sobrenadante. Nota: Peças de tecido devem resolver prontamente à parte inferior do tubo. Se não o fizerem, é uma indicação que demasiada mesentério/gordura permanece anexada ou eles estão associados com uma bolha de ar.</li>
	<li>Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir para um balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>O tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante para um novo tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm tendo o cuidado de manter as peças de tecido no tubo original de vórtice. Não descartar o sobrenadante; o sobrenadante contém linfócitos intraepiteliais. Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 10 mL e armazenar no gelo.</li>
	<li>Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir de volta para o balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL. Nota: DTE é um agente redutor que enriquece linfócitos intraepiteliais.</li>
	<li>Vórtice do tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante através de um filtro de célula de 70 µm no tubo anterior contendo células do sobrenadante do primeiro tratamento DTE (da etapa 4.3). Nota: As peças restantes intestinais são usadas para isolar linfócitos da propria do lamina. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais estão presentes e a membrana basal está intacta.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação o sobrenadante em 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% na temperatura de quarto (RT).</li>
	<li>A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG RT 67%. Centrifugar a 1600 × g por 20 min no RT sem usar o freio. Nota: Os tubos podem ser pré-tratados com soro bovino para impedir que as células aderindo às paredes do tubo.</li>
	<li>Note-se que células viáveis formam uma banda (buffy coat) na interface de 44% para 67%, células mortas e algumas células epiteliais estão em um filme mucoide na parte superior do gradiente e células vermelhas do sangue está na pelota. Remova a camada superior do gradiente para dentro de ~ 2 cm da interface por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco buffy na interface e transferi-los para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.</li>
</ol>5. isolamento de linfócitos da lâmina própria do intestino
<ol><li>Remova células epiteliais de pedaços de tecido intestinal adicionando-se 25 mL da solução de EDTA escaldada para o frasco contendo as peças restantes intestinais. Frasco de agitar a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético durante 30 min. Use um grande ímã do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e cuidadosamente, desprezar o sobrenadante, mantendo intestinais pedaços dentro do frasco. Nota: (i) o EDTA é um quelante de cálcio metas entroncamentos de cálcio-dependente e promove o desprendimento das células epiteliais intestinais. (ii) o sobrenadante deve ser nublado e pode ser usado para isolar o IEC se sua coleção for desejada.</li>
	<li>Repita a etapa 5.1. Nota: O sobrenadante deve ser menos nublado após esta incubação. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais intestinais foram removidas e a membrana basal está intacta. Uma amostra do líquido sobrenadante também pode ser avaliada por citometria de fluxo para confirmar que leucócitos (CD45+ células) estão ausentes.</li>
	<li>Adicione 50 mL de mídia de colheita de RT no balão. Mexa rapidamente com um ímã. Deixe pedaços intestinais resolver e cuidadosamente descartar o sobrenadante. Nota: Este passo garante a remoção de EDTA antes da digestão de colagenase EDTA inactivates colagenase por quelantes do cálcio que é essencial para a função de colagenase.</li>
	<li>Adicionar 30 mL de solução de colagenase escaldadas no balão e misture pedaços intestinais a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 45 min.</li>
	<li>Transferi tecido digerido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL por filtragem através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente dissocia os pedaços restantes do tecido usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL de mash através do filtro. Lave o filtro com 10 mL de mídia colheita frio.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% de temperatura ambiente.</li>
	<li>A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG de 67% de temperatura ambiente. Centrifugue os gradientes em temperatura ambiente e 1600 × g por 20 min com sem freio.</li>
	<li>Remova a camada de gordura na parte superior por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco de buffy para a interface e a transferência para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Um protocolo detalhado é apresentado para o isolamento de linfócitos do intestinal da mucosa indutivo (MLN e PP) e sites effector (compartimento de LP e IEL). O protocolo foi desenvolvido para equilibrar (tempo) de entrada e saída (viabilidade e rendimento) para maximizar a produtividade e resultados. O protocolo também garante mínima contaminação compartimental entre compartimentos LP e IEL.
Vários protocolos para o isolamento de células do sistema imunológico do intestino de rato foram publicados3,4,5,6,7. A maioria desses protocolos concentrar-se em isolar as células imunes do LP. O epitélio intestinal é um compartimento distinto da LP que é exposto diretamente para o ambiente externo e consiste em uma composição única de linfócitos. Abordagens recentes têm procurado uma análise mais global da função imune nos intestinos, examinando distintos compartimentos intestinais simultaneamente para entender os aspectos únicos de respostas imunes, ocorrendo nesses compartimentos e as relações entre eles. Portanto, um protocolo confiável para o isolamento de células do sistema imunológico de todos esses compartimentos é desejado. Dois tratamentos DTE são suficientes para isolar > 95% do IEL e alguns IEC. EDTA cálcio-dependente junções-alvo e é eficiente para desanexar IEC. Portanto, o sobrenadante dos tratamentos subsequentes de EDTA compreendem principalmente IEC. Um pequeno número de linfócitos pode ser encontrado no sobrenadante após tratamento de EDTA; no entanto, cerca 20-fold mais linfócitos são obtidos a partir da fração DTE. Além disso, os linfócitos do tratamento de EDTA assemelham-se populações mistas de linfócitos IEL e LP (Figura 4), que sugere a contaminação do LP de vilosidades e cripta danos. Portanto, neste protocolo, IEL são recolhidos a partir do tratamento de DTE antes do tratamento de EDTA, maximizando a pureza, minimizando a contaminação cruzada-compartimento. Outros protocolos usam sequencial ditiotreitol (DTT)-tratamentos de EDTA ou tratamento combinado de TDT-EDTA para a isolação do IEL5,6,7. TDT é um epímero da DTE e ambos atuam como agentes redutores. Estes protocolos, TDT é relatado apenas remover o muco e EDTA é usado para isolar o IEL. Embora o efeito da TDT e DTE não foi diretamente comparado, IEL após tratamento de DTE ou tratamento combinado DTE-EDTA foi avaliada. Não surpreendentemente, tratamento combinado DTE-EDTA aumenta a contaminação de IEC na preparação IEL (Figura 5) e a presença de grandes números de IEC diminuição IEL rendimentos após centrifugação gradiente de densidade. Como EDTA pode danificar algumas vilosidades e criptas, tratamento combinado DTE-EDTA também pode resultar na contaminação de linfócitos de LP na preparação IEL ou perda de células do LP do isolamento de LP. Além disso, como > 95% de IEL foram isoladas a partir da fração DTE, tratamentos DTE e EDTA separados são preferidos. Alguns protocolos isolam linfócitos sem usar centrifugação gradiente de densidade para enriquecer as células imunes6. Centrifugação de gradiente de densidade leva mais tempo e poderá ocorrer perda de algumas células. No entanto, ele remove as células mortas, as células epiteliais e muco, levando a populações de linfócitos altamente enriquecido (Figura 6), que ajuda a melhorar a detecção de pequenas populações de células e diminui substancialmente o tempo de aquisição para o fluxo de citometria. Relatou-se centrifugação gradiente de densidade para resultar em relação alterada de fagócitos mononucleares subconjuntos7; no entanto, composição de subconjunto de linfócitos aparentemente normal. É particularmente útil realizar centrifugação gradiente de densidade para o isolamento do IEL. Em geral, apresenta-se um protocolo completo para isolar linfócitos altamente enriquecidos e perfeitamente viáveis de todos os tecidos intestinais, incluindo o LP e IEL com mínima contaminação cruzada-compartimental.
Cuidados e tempo substancial devem ser tomadas durante as etapas de isolamento de tecido para limitar a contaminação entre as preparações. Remoção incompleta de PP grandemente pode distorcer os linfócitos LP. ILF também pode contaminar os preparativos do LP. No entanto, IIF não pode ser visto a olho nu e, portanto, não pode ser removida cirurgicamente antes da digestão. Estirpes de mouse diferente têm diferentes números de ILF14, que pode contribuir muito para a composição variável de linfócitos LP entre estirpes de rato. Ao remover o muco, certifique-se de deslizar suavemente o intestino para evitar danificar a membrana basal e o LP, que poderia resultar na contaminação do LP do IEL. Uma indicação de contaminação é a presença de um grande número de células B na preparação IEL. IEL contêm poucas células B (~ 1% ou menos), enquanto que LPL pode ter até 60% B células, dependendo da estirpe de rato. CD19 mas B220 não deve ser usado para identificar células B no compartimento do LP e IEL, como células T intestinais também podem expressar B22015. Além disso, muitas células T intestinais podem exprimir o macrófago tradicional e marcadores de DC como CD11b e CD11c, respectivamente16. Portanto, deve utilizar-se a lixeira adequada retenção de estratégias para garantir a análise adequada.
Passos podem ser modificados para acomodar as necessidades dos investigadores. Digestão mecânica pode ser suficiente para o isolamento de linfócitos PP no estado estacionário ou digestão de colagenase dos gânglios linfáticos pode facilitar o isolamento de alguns subconjuntos de leucócitos durante a inflamação. O tipo de colagenase usado pode ter impacto substancial na expressão do marcador de superfície celular e a viabilidade e a pureza do LP linfócitos5,17. O intestino pode ser cortado em pedaços pequenos para a digestão de colagenase, podendo aumentar o rendimento da célula. No entanto, ele também reduz a viabilidade. O tempo de incubação com colagenase pode ser otimizado para maximizar o rendimento enquanto minimiza a morte celular, levando a máxima recuperação de células vivas. Laboratórios diferentes usam gradientes de densidade ligeiramente diferentes para isolar linfócitos. Um protocolo de gradiente bem-estabelecida 44 67% de densidade é aqui apresentado. Pesquisadores podem testar gradientes de densidade diferentes para melhor atender as suas necessidades individuais. Se desejar um número maior de linfócitos, dois intestino pode ser combinado para DTE tratamentos, tratamentos de EDTA e digestão de colagenase. Se mais de dois intestinos são necessários para examinar eventos extremamente raros, então é recomendável que suspensões celulares único são agrupadas após o isolamento.
Linfócitos isolados podem ser usados para posterior análise fenotípica, funcional e genômica. Ao realizar a análise de fluxo cytometric, é altamente aconselhável sempre uso que uma viabilidade corantes e anticorpo anti-CD45 para excluir as células mortas e células não-hematopoiéticas, que irão aumentar consideravelmente a análise. Se as populações de linfócitos puro são necessários, célula classificação de CD45+ células juntamente com outros marcadores de escolha podem ser executadas. Garimpando no anti-CD8α-placas com revestimento em também pode ser usado para isolar puras células T de preparação do IEL, como a maioria destes T células CD8α express. Panning ou célula classificação é geralmente necessário para a cultura do IEL como contaminar células epiteliais pode inibir o crescimento do IEL. Células do alimentador como ingênua splenocytes também podem ser adicionadas para promover a sobrevivência do IEL na cultura. Se alimentadores são utilizados, é importante utilizar células congenically incompatível para distinguir as populações. Contaminação bacteriana é raramente um problema nestes estudos funcionais de curto prazo como mídia de colheita contém penicilina, estreptomicina e gentamicina. Além disso, várias etapas de lavagem e centrifugação gradiente de densidade removem a maioria das bactérias.
O processo de isolamento é demorado e exige um equilíbrio de cuidado, precisão e velocidade para obter melhores resultados. Tempo suficiente deve ser gasto para assegurar a manipulação adequada de cada etapa, enquanto minimizando o tempo entre o sacrifício de rato e obtenção de uma suspensão de célula única para maximizar o rendimento e a viabilidade celular. Este é um equilíbrio delicado que também é um gargalo para iniciantes tentando obter consistência em isolar linfócitos com rendimento e alta viabilidade. Um processo de isolamento toda a partir eutanásia de rato para obtenção de uma suspensão de contagem única célula leva um investigador experiente aproximadamente 8 h para 8 ratos. É aconselhável obter assistência para mais de 8 ratos para gerar alta qualidade e resultados reprodutíveis. É importante usar cuidado quando comparar linfócitos destes tecidos com linfócitos de baço, sangue ou outros tecidos linfoides como a incubação do extenso pode levar a alterações artificiais associadas com o procedimento de isolamento17. Comparações de rotina das populações LP e IEL similarmente tratados os tecidos linfoides iria avaliar se o marcador de interesse é modulado durante o isolamento de linfócitos dos tecidos intestinais. Questões semelhantes são também um grande interesse ao comparar perfis de RNA do intestino com as dos tecidos linfoides.

Tracto gastrointestinal (GI) tem muitas dobras e saliências que representa a maior interface separando o corpo interno e o ambiente externo. O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto GI. Ele é constantemente exposto a antígenos alimentares, bactérias comensais e micróbios patogênicos. Como tal, deve continuar a ser tolerante aos antígenos alimentares e bactérias comensais, preservando a capacidade de rapidamente gerar uma resposta imune eficaz para micróbios enteropatogênica1. O sistema imunitário intestinal pode ser dividido anatomicamente em sites indutivos, onde ingênuo linfócitos são ativados por transportar antígenos da mucosa intestinal de células apresentadoras, e efetoras sites, onde os linfócitos ativados exercem específicas de funções efetoras2. Os sites indutivos compõem a estrutura linfoide organizada de Peyer (PP) que examina o lúmen intestinal diretamente através da ação de células especializadas de M e os regionais drenagem linfonodos mesentéricos (MLN). Os sites de efetor consistem na lâmina própria (LP), que é o tecido conjuntivo abaixo da membrana basal e o epitélio intestinal, uma camada única célula localizada acima da membrana basal que contém linfócitos intraepiteliais (IEL). Os linfócitos são grandes jogadores de imunidade adaptativa que mediam a proteção contra infecções e cancros e também podem contribuir para Imunopatologia em doenças inflamatórias. É importante e altamente relevantes para o estudo de linfócitos nestes distintos compartimentos da mucosa anatômicos para melhor entendem suas funções efetoras e de indução.
Um protocolo relativamente simples e unificado para o isolamento de linfócitos desses compartimentos é necessário que o número de investigadores explorar imunes eventos que ocorrem no intestino está acelerando. Diversos grupos de pesquisa tem publicado os protocolos que compartilham diversos processos semelhantes para isolar as células imunes do rato pequenos compartimentos intestinal3,4,5,6,7 . No entanto, existem várias diferenças técnicas entre eles dependendo do foco do protocolo individual. Por exemplo, com o foco em isolar as células imunes do LP, um protocolo examina o impacto de vários digestões enzimáticas na viabilidade celular, expressão marcador de superfície de célula e a composição das células imunes isolado5. Outro protocolo destaca um método rápido e reprodutível para isolamento dos linfócitos sem densidade centrifugação6. Finalmente, protocolos específicos também existem com a finalidade de isolar os fagócitos mononucleares de camadas de tecido diferente do intestino delgado7. Aqui, apresenta-se um protocolo altamente reprodutível que permite isolamento sequencial das populações de linfócitos do compartimento do MLN, PP, LP e IEL do intestino delgado.
Focamos em isolar populações altamente purificadas de compartimentos do LP e do IEL, que são em grande parte livres de contaminantes de outros compartimentos intestinais. Isto amplamente utilizado protocolo produz um alto rendimento de linfócitos màxima puros e viáveis dentro de tempo aceitável restrições4,8,9,10,11,12. Este protocolo também garante o isolamento dos linfócitos do compartimento do LP e IEL com mínima contaminação cruzada compartimental, permitindo uma oportunidade genuína estudar os linfócitos nesses compartimentos distintos. Os linfócitos isolados podem ser submetidos a outras manipulações como fluxo cytometric análise ou análise funcional. Este protocolo foi aplicado sucesso ao isolamento de linfócitos de rato do intestino delgado e cólon durante infecções bacterianas como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriume pseudotuberculosis Yersinia infecções e condições inflamatórias, como a colite química e patógeno-induzida. Este protocolo também pode ser usado para isolar as células imunes inatas como células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e monócitos do rato do intestino delgado e cólon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto gastrointestinal, gerando respostas tolerantes aos antígenos alimentares e bactérias comensais enquanto montagem eficazes respostas imunes a enteropatogênica micróbios. Além disso, é evidente que a imunidade intestinal local tem um profundo impacto na imunidade sistêmica e distante. Portanto, é importante estudar como uma resposta imune intestinal é induzida e qual é o resultado da resposta imunológico. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o isolamento de linfócitos de intestino sites indutivo como o tecido linfoide associado intestino de Peyer e a drenagem de linfonodos mesentéricos e efetoras sites como a propria do lamina e o epitélio intestinal. Essa técnica garante o isolamento de um grande número de linfócitos pequenos tecidos intestinais com pureza ideal e viabilidade e mínima contaminação compartimental dentro de restrições de tempo aceitável. A capacidade técnica para isolar linfócitos e outras células do sistema imunológico dos tecidos intestinais permite a compreensão das respostas imunes, infecções gastrintestinais, cancros e doenças inflamatórias.

Uma representação esquemática do protocolo é retratada (Figura 1). Linfócitos dentro da mucosa intestinal indutivo e sites effector organizam-se distintamente. Peyer do patches (PP) e linfonodos mesentéricos (MLN) contêm linfócitos em áreas bem organizadas de células T e células B folículos, enquanto que o epitélio intestinal contém linfócitos que são mais difusamente distribuídos. A lâmina própria (LP) contém linfócitos difusamente distribuídos e linfócitos contidos em estruturas linfoides organizadas como folículos linfoides isolados (ILF) e cryptopatches. Cada compartimento imune intestinal também é caracterizado por uma composição única de subconjuntos de linfócitos (Figura 2). O MLN é predominantemente composto por pilhas de T αβ (~ 70%), enquanto que os linfócitos PP são principalmente células B (~ 80%). Composição de linfócitos de LP é largamente dependente da tensão, mas principalmente composto de células αβ T e células B. Distinto dos outros compartimentos intestinais, linfócitos que residem no epitélio são principalmente as pilhas de T do γδ (~ 60%) e as células T αβ com essencialmente nenhuma célula B. Diferentes proporções de subconjuntos de célula T αβ também existem dentro de posições anatômicas distintas dos intestinos. As células αβ T no LP são principalmente CD4+ T células (~ 70%), enquanto CD8α+ T células (~ 85%) predominam no compartimento de linfócitos intraepiteliais (IEL). CD8α+ células αβ T dentro de compartimentos do LP e IEL expressam o homodímero de CD8αα ou o CD8αβ heterodímero considerando indutivo local CD8α+ αβ T células predominantemente express o heterodímero CD8αβ (Figura 3). A maioria das células γδ T no compartimento do IEL também express CD8α, enquanto as células γδ T encontraram em falta o MLN CD8α (Figura 3). Independentemente de Generalidades, a composição dos subconjuntos de linfócitos pode variar entre estirpes de rato e pode ser alterada com a idade ou doença. Como tal, deve efectuar-se uma análise cuidadosa das populações de linfócitos na mucosa intestinal no estado estacionário na estirpe de fundo utilizada para as manipulações experimentais.
Rendimento de célula pode variar muito, dependendo da estirpe e da idade dos ratos e condições experimentais utilizadas. Única, ao vivo as células podem ser contadas em um hemocytometer ou uma máquina de contagem de célula automatizada utilizando trypan azul exclusão. O número de linfócitos é calculado como: célula contagem × CD45+ células (%) no portão 3 × linfócitos (%) no portão 4 (Figura 2). Aproximadamente 15 × 106 MLN linfócitos, os linfócitos do PP6 × 10 5-10, 2-5 × 106 LP linfócitos e 3-6 × 106 IEL podem ser obtidos de um rato de C57Bl/6 ou Balb/c ingênuo de 8 a 12 semanas de idade. Alternativamente, grânulos de contagem baseado em fluxo podem ser usados para quantificar populações de células, com a ressalva de que a perda celular ocorre durante o processo de coloração. Em última análise, consistência na técnica de contagem deve ser mantida dentro do laboratório para garantir que as comparações adequadas podem ser feitas através de experimentos.
Neste protocolo, DTE tratamento é usado para enriquecer o IEL, que é seguido por tratamento de EDTA para remover IEC para isolamento ideal de linfócitos altamente enriquecidos. Dois tratamentos DTE são suficientes para isolar > 95% do IEL. Um número muito pequeno de linfócitos também pode ser encontrado no tratamento EDTA. Estes linfócitos assemelham-se a uma mistura de linfócitos IEL e LP (Figura 4). Também foi realizada uma comparação do tratamento de DTE e tratamento combinado de DTE-EDTA para isolar o IEL. Tratamento combinado de DTE-EDTA aumenta a contaminação de IEC na preparação IEL (Figura 5) e reduz o rendimento final das células imunes ao vivo após a centrifugação gradiente de densidade. Recomenda-se a centrifugação gradiente de densidade para isolar linfócitos de compartimentos do intestinais. Ele remove as células mortas, muitas células epiteliais e muco, promovendo o isolamento dos linfócitos altamente enriquecidos e diminuindo drasticamente a citometria de fluxo aquisição vezes (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig1.jpg"> Figura 1 . Carta de fluxo do protocolo de isolamento. DTE, dithioerythritol. EDTA, ácido etilenodiaminotetracético. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57281/57281fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig2.jpg"> Figura 2 . A citometria de fluxo, retenção de estratégia para as populações de linfócitos dos tecidos intestinais. Suspensões de célula única preparadas dos linfonodos mesentéricos (MLN), lâmina própria (LP), de Peyer patches (PP) e compartimento de linfócitos intraepiteliais (IEL) foram coradas com corante de viabilidade fixável (por exemplo, vivo/morto) e o seguinte anticorpos fluorescentes-Etiquetado: CD45 para identificação de células hematopoiéticas, CD19 por células B, CD3ε para T cells, T-cell receptor (TCR) β para células αβ T, TCRδ para as células γδ T, CD8α para CD8α+ αβ T células e CD4 para CD4+ células αβ T. Propriedades de A - A/side scatter (CCD) - dispersão (FSC) portão 0 mostrou-se para a frente. Portão 1 identificadas células únicas. Portão 2 identificadas células vivas. Portão 3 identificadas células hematopoiéticas. Portão 4 linfócitos identificados com base nas propriedades de FSC-um/SSC. Portão 5 identificadas células T e células B. Portão 6 células identificadas αβ T e células γδ T entre as pilhas de T totais. Portão 7 identificado CD8α+ e CD4+ T células na população de células T αβ. Percentagens (em fonte vermelha) dentro pseudocolorida parcelas correspondem à frequência de células dentro do portão indicado entre a população parental anterior. Portão 0 e portão 1 exibem eventos totais. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57281/57281fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig3.jpg"> Figura 3 . O fenótipo ofCD8α+ em tecidos intestinais células células αβ T e γδ T. A expressão de CD8β por CD8α+ αβ T células e a expressão de CD8α pelas células T de γδ são retratados. Percentagens (em fonte vermelha) dentro de histogramas correspondem à frequência de células que expressam o marcador indicado entre a população parental indicado. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57281/57281fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig4.jpg"> Figura 4 . A composição de linfócitos de tratamentos DTE, EDTA e colagenase. a estratégia associada parental é o mesmo como ilustrado na Figura 2. Portão 5 identificadas células T e células B. Portão 6 células identificadas αβ T e células γδ T entre as pilhas de T totais. Portão 7 identificado CD8α+ e CD4+ T células na população de células T αβ. Percentagens (em fonte vermelha) dentro pseudocolorida parcelas correspondem à frequência de células dentro do portão indicado entre a população parental anterior. Os linfócitos do isolamento de EDTA semelhança a uma mistura de linfócitos IEL e LP isoladas de tratamentos DTE e colagenase, respectivamente. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57281/57281fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig5.jpg"> Figura 5 . Uma comparação do tratamento de DTE e tratamento combinado de DTE-EDTA para a isolação do IEL. DTE tratamento foi realizado de acordo com este protocolo. IEL foram coletadas após tratamentos DTE e antes de tratamentos de EDTA. Tratamento combinado de DTE-EDTA foi realizado às mesmas concentrações empregadas neste protocolo, mas ao mesmo tempo. As propriedades de FSC-um/SSC, viabilidade e a porcentagem de CD45+ células hematopoiéticas são mostradas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57281/57281fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig6.jpg"> Figura 6 . O impacto da centrifugação gradiente de densidade na pureza das preparações de linfócitos IEL e LP. Suspensões de única célula isoladas de acordo com este protocolo foram submetidas a centrifugação gradiente de densidade ou analisadas por citometria de fluxo diretamente. As propriedades de FSC-um/SSC, viabilidade e a porcentagem de CD45+ células hematopoiéticas são mostradas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57281/57281fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

isolating-lymphocytes-from-the-mouse-small-intestinal-immune-system

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.3K visualizações.  Stony Brook University. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Vídeo: Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imunologia e Infecção

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;