Este estudo foi apoiado pelo Edmond e Lily Safra Center for Brain Sciences (SB comunhão), The Legacy Heritage Ciências Biomédicas Programa de Parceria da Fundação Israel Science (Grant No. 378/11, a HS) e da Fundação Alemã de Israel for Scientific Pesquisa e Desenvolvimento (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).

1. Preparação lentivírus <ol><li> Cultivar células HEK-293FT a 90% de confluência. </li><li> No dia da transfecção meio celular alteração DMEM isento de soro suplementado com glutamina 1 mM e 50 mg / ml de penicilina-estreptomicina. </li><li> Co-transfectar as células com um vector pLKO.1-Puro e com plasmídeos que codificam para o delta R8.2 e VSV-G e radicais da miRNA de interesse, utilizando 10 ul de 1 mg / mL de polietilenimina como um transportador 9. </li><li> Recolhe lentivírus embalados às 24 horas e 48 horas pós-transfecção, filtrar através de um filtro de 0,45 um. </li><li> Concentrar os lentivírus utilizando ultracentrifugação em 70.000 xg, por 2 horas e 15 ° C, alíquotas e armazenar a -70 ° C. </li><li> Medida por titulação do vírus infectando células HEK-293T com preparações de virus diluídos em série (1 a 10 -6 ml de vector por poço). O título resultante (um mínimo de 1 x 10 ~ 9 partículas infecciosas por ml é recomendado) é avaliada para a expressão do gene de interesse, usando a seleção puromycin e da quantificação do vírus expressando GFP através da contagem de células fluorescentes. </li></ol> Para o protocolo mais detalhado de preparação lentivírus ver 10. 2. Preparando animais para a cirurgia <ol><li> Cirurgiões vestimenta deve incluir vestido cirúrgico, luvas estéreis, gorro e máscara. </li><li> Pesa-se o animal, depois anestesiam-lo com um IP-injecção de uma mistura de cetamina, com o volume proporcional ao peso do animal, tal como especificado para cada fármaco. Para uma mistura de cetamina / xilazina, um intervalo de doses de 80-200 mg / kg de cetamina e 7-20 mg / kg de Xilazina é geralmente usado para os ratos. </li><li> Espere até que o animal está totalmente anestesiado, em seguida, verificar a falta de reflexo de retirada do membro posterior do animal através da extensão do membro e, em seguida, pressionando-o com o dedo. </li><li> Injectar o animal por via subcutânea com Rimadyl, conforme especificado na caixa, para alívio da dor. Intervalo de dose típica para Rymadil é de 5-10 mg. </li><li> Colocar o animal em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal constante e umedecer os olhos com pomada. </li><li> Raspar a área entre as duas orelhas com uma máquina de corte. </li><li> Higienizar a pele com betadine. </li></ol> 3. Exposição da Caveira e perfuração <ol><li> Colocar o animal dentro do stereotact ajustando as barras nas fendas apenas anteriores aos ouvidos do animal. </li><li> Usar um bisturi para fazer uma incisão ântero-posterior de cerca de 1,5 cm entre as orelhas e mantê-la aberta com grampos cirúrgicos (serfines). </li><li> Limpe a superfície do crânio com um cotonete até a interseção entre a sutura coronal e suturas sagital, ou seja, o bregma ea interseção entre as suturas coronal e lambdóide, ou seja, lambda, são visíveis. </li><li> Saliente da ponta da seringa, realizada pelo stereotact, ao ponto bregma, em todos os três eixos. Anote as coordenadas. Este ponto seria considerado como o po de zeroint em todos os três eixos. </li><li> Levante a seringa no eixo vertical, de modo que um movimento planar não arranhar o crânio e mover a cabeça da seringa para o local correto. Injecções de CA1 do hipocampo requerem coordena o seguinte em relação ao bregma, em mm: -2 no eixo anterior / posterior, ± 1,8 no eixo lateral / medial e -1.5 no eixo dorsal / ventral. </li><li> Abaixe a ponta da seringa até que toque o crânio e marcar o local com um marcador. Retire a seringa para trás para evitar esfaqueamento. </li><li> Faça um buraco raso, só no osso do crânio com uma multa perfurador. Segure o perfurador constante para que ele não iria continuar a perfurar os debaixo dos tecidos moles. Você pode evitar isso, firmando um lado com o outro e através da perfuração em pulsos curtos. </li></ol> 4. A injecção do lentivírus <ol><li> Retirar 0,5 ml da solução concentrada de lentivírus. </li><li> Coloque a seringa por cima do buraco e, lentamente, abaixe-o verticalmente até que reateso a superfície do crânio. Continue a diminuir a seringa no cérebro muito lentamente. Neste passo, pode ocorrer alguma hemorragia o que não indica necessariamente uma penetração falhou. Se ocorrer sangramento contê-la com um cotonete. </li><li> Regular a bomba digital para 0,02 ml / min (0,5 ul seria injectado em 25 min) e iniciar a infusão. A perfusão lenta permite um espalhamento eficaz do vírus no tecido e impede o fluxo de retorno. Em alguns tipos de seringas considerar a inserção da seringa para uma profundidade extra de 0,5 mm antes de se retirar para as coordenadas originais e infundindo. </li><li> Depois de completada a infusão é aguardar mais 5 min para permitir que o material para se propagar no cérebro em vez de se retirar de volta para dentro do canal formado pela seringa. </li><li> Retire a seringa muito lentamente e observar os fluxos de volta. Se um fluxo de retorno é observada nesta etapa, uma fracção do material injectado foi provavelmente perdida. </li></ol> 5. Selagem de Feridas e Recuperação <ol><li> Seal ªe enrolada com histoacryl. Certifique-se de evitar o vazamento do histoacryl nos olhos. </li><li> Injectar a animais por via intraperitoneal (IP) com 1 ml de solução salina pré-aquecida, a fim de evitar a desidratação. </li><li> Colocar o animal numa gaiola de recuperação que está posicionada sobre uma almofada aquecida. Assista ao animal enquanto ele se recupera de uma hora. </li></ol> Em caso de perda de peso, inapetência, fraqueza / incapacidade de obter alimentos ou água, estado moribundo ou infecção, a eutanásia do animal deve ser realizada. Métodos aceitáveis ​​para a eutanásia de roedores são os barbitúricos, anestésicos inalatórios, CO 2, CO, ou cloreto de potássio em conjunto com anestesia geral. Após 4 a 6 semanas, avaliam a memória de navegação do animal é avaliado no labirinto aquático de Morris. Os lentivírus que normalmente infectam a maioria das células no interior da esfera de injecção. 6. Avaliação comportamental no labirinto aquático de Morris <ol><li> Treinar os animais no Morris labirinto aquático. Para a formação exata e protocolo de testes ver 11. Depois de cada ensaio, secar o animal com uma toalha seca e substituí-lo na sua gaiola e refrescar a água no tanque. </li><li> Testar os animais no labirinto aquático de Morris, durante 3 dias consecutivos, quatro ensaios por dia. Cada dia inserir o animal no labirinto em cada uma das quatro direções do labirinto (norte, sul, leste e oeste), em uma ordem de mudança, por exemplo, o primeiro dia: leste-oeste-norte-sul, o dia dois: oeste-sul -nordeste. Limpe os animais depois de cada julgamento. </li><li> Durante o ensaio, os ensaios controlar o animal com um sistema de rastreio, tais como o sistema de rastreamento Noldus. </li><li> Após o ensaio de teste no dia 12, inserir o animal dentro do tanque de água, sem a plataforma, durante um minuto. Isto será usado para analisar a estratégia de pesquisa está a tomar o animal. </li><li> Analisar os dados, tal como sugerido em 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Injeção estereotáxica de um lentivírus é um método relativamente rápido para a avaliação in vivo, tanto para down-regulação de diferentes genes e miRNAs cima ou. A principal alternativa é um rato geneticamente modificado que é uma técnica consome muito mais trabalhoso e demorado, em seguida, a injeção direta lentivírus. Além disso, a regulação para cima, na injecção de lentivírus, ocorre a um tempo específico no ratinho adulto e não inclui qualquer possibilidade de permeabilidade durant...

O papel dos miRNAs particulares em funcionamento do sistema nervoso foi recentemente desafiado por injeção lentiviral em vários estudos. MiRNAs foram encontrados para ser crucial para a manutenção e re-moldar uma estrutura sinapse, sinaptogênese 2 e remodelação sinapse e manutenção 3. Estes estudos sugerem fortemente que miRNAs estão envolvidos, através de efeitos de regulação de vários níveis, tanto na formação e na manutenção da saída principal do sistema nervoso, a função cognitiva. Injeção estereotáxica de partículas lentivírus em regiões específicas no cérebro de roedores permite à procura de alterações na morfologia sinapse e atividade neuronal, e foi usado para estabelecer o significado funcional de transcritos sobre-expressos 4,5. Infecção direta de neurônios em áreas do cérebro bem definidas com miRNA-expressando lentivírus podem estar envolvidos em estudos de envelhecimento, distúrbios cerebrais e neurodegeneração; Estudos de miRNAs no campo da regulação comportamental 6-8 estão em um estado muito menos avançada, e injeção estereotáxica de miRNA-expressando partículas lentivírus seguidos por testes comportamentais podem ser úteis para tais fins. Um método muito mais trabalhoso para induzir sobre ou sub-expressão envolve a engenharia genética knock-in ou camundongos knockout. Sistemas genéticos podem ainda permitir o controlo condicional e temporal sobre a expressão (por exemplo, Cre-Lox, sistemas Tet), mas estes dificilmente oferecem a especificidade espacial do procedimento de injecção e existe quase sempre uma certa quantidade de fugas. Além disso, os procedimentos de engenharia não necessitam de cirurgia e pode ser usado em laboratórios com relativamente boa reprodutibilidade, no entanto, são lentos e exigem muito mais recursos humanos e financeiros. Além disso, o controlo temporal da sub-expressão em ratinhos injectados sobre ou é muito mais preciso em comparação com ratinhos geneticamente modificados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA de fita simples reguladoras pequenas cerca de 22 nucleotídeos de comprimento que podem cada alvo numerosas transcrições de mRNA e dim todo um gene de expressão da via pela destruição indução e / ou inibindo a tradução destes objectivos. Vários miRNAs desempenham papéis fundamentais na manutenção da estrutura e função neuronal e nas funções cerebrais de nível superior, e os métodos são procurados para manipular os seus níveis para explorar essas funções. Aqui, apresentamos uma relação direta método in vivo para examinar as consequências cognitivas de miRNAs aplicadas em excesso em ratos por injeção estereotáxica de partículas virais miRNA-codificação. Especificamente, o protocolo atual envolve a injeção na região CA1 do hipocampo, que contribui para a consolidação de mamíferos memória, aprendizagem, e as respostas ao estresse, e oferece um local de injeção conveniente. As coordenadas são medidas de acordo com a bregma rato e perfusão vírus é controlado digitalmente e mantido muito lento.Após a injecção, a ferida é selada a cirurgia e os animais recuperar. Lentivírus codificação silenciadores dos alvos de RNAm correspondentes servem para envolver a interação miRNA / target específico responsável pelo efeito observado, com camundongos normais, os camundongos injetados com solução salina e camundongos injetados com vetores lentivírus &quot;vazios&quot; como controles. Um mês após a injeção, os animais são examinados no labirinto aquático de Morris (MWM) para avaliar a sua aprendizagem de navegação e capacidades de memória. A MWM é um tanque redondo preenchido com água colorida com uma pequena plataforma submersa um centímetro abaixo da superfície da água. Estímulos visuais constantes ao redor do tanque permitem navegação espacial (som e do campo magnético da Terra pode também ajudar os animais a navegar). Monitoramento de câmeras de vídeo permite medir a rota de mergulho e o tempo para encontrar e atingir a plataforma. O mouse é ensinado pela primeira vez que a montagem da plataforma escondida oferece uma fuga da natação forçada, que é então testado para a utilização deste fuga e finalmente, a plataforma é removida e testes com sondas de examinar se o rato lembra sua localização anterior. Testes repetidos ao longo de vários dias consecutivos destacar melhorou o desempenho de ratinhos testados em menores latências para encontrar e montar a plataforma, e as vias mais directos como para alcançar a plataforma ou a sua localização. Fracasso para mostrar essa melhoria representa aprendizagem e memória prejudicada e / ou ansiedade, que pode então ser testada especificamente (por exemplo, no labirinto em cruz elevado). Esta abordagem permite a validação dos miRNAs específicos e transcrições alvo nos processos relacionados ao estresse cognitivo e / ou estudado.

A injecção de 0,5 ml no lentivírus região CA1 do hipocampo do rato, com a taxa de fluxo indicado na secção do protocolo produz uma esfera infectada de cerca de 1 mm no eixo rostral-caudal, e cerca de 0,5 mm, no médio-lateral e a anterior eixos-posterior (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figura 1. Ponto bregma e aparelhos de injeção. (A) É mostrado um mapa esquem...

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar a<em&gt; In vivo</em&gt; Efeitos de miRNAs sobre-expressos em regiões específicas do cérebro.

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

22.6K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem. MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar a In vivo Efeitos de miRNAs sobre-expressos em regiões específicas do cérebro.

Vídeo: Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of chronic CNS disorders, there is an increasing demand for murine models with high validity at the behavioral level. However, multiple pathogenic mechanisms and complex functional deficits often impose challenges to reliably measure and interpret behavior of chronically sick mice. Therefore, the assessment of peripheral pathology and a behavioral profile at several time points using a battery of tests are required. Video-tracking, behavioral spectroscopy, and remote acquisition of physiological measures are emerging technologies that allow for comprehensive, accurate, and unbiased behavioral analysis in a home-base-like setting. This report describes a refined phenotyping protocol, which includes a custom-made monitoring apparatus (Integrated Behavioral Station, INBEST) that focuses on prolonged measurements of basic functional outputs, such as spontaneous activity, food/water intake and motivated behavior in a relatively stress-free environment. Technical and conceptual improvements in INBEST design may further promote reproducibility and standardization of behavioral studies.

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Prolonged and comprehensive monitoring of mice in a home-cage environment provides a deeper understanding of aberrant behavior in murine models of brain diseases. This paper describes the Integrated Behavioral Station (INBEST) as the key component of contemporary behavioral analysis.

Behavioral Fenotipagem de modelos de doenças Murino com a Estação Integrada Comportamental (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Comportamento

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

Avaliação Comportamental do Envelhecimento Rato Sistema Vestibular

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the test mouse is placed in a standardized apparatus and relevant behaviors are assessed in three different sessions (called session I, II, and III).
The apparatus has three compartments (see Figure 1), the left and right compartments contain an inverted cup which can house a mouse (called &#34;stimulus mouse&#34;).
In session I, the test mouse is placed in the cage and its mobility is characterized by the number of transitions made between compartments. In session II, a stimulus mouse is placed under one of the inverted cups and the sociability of the test mouse is quantified by the amounts of time it spends near the cup containing the enclosed stimulus mouse vs. the empty inverted cup. In session III, the inverted cups are removed and both mice interact freely. The sociability of the test mouse in session III is quantified by the number of social approaches it makes toward the stimulus mouse and by the number of times it avoids a social approach by the stimulus mouse.
The automated evaluation of the movie detects the nose of the test mouse, which allows the determination of all described sociability measures in session I and II (in session III, approaches are identified automatically but classified manually). To find the nose, the image of an empty cage is digitally subtracted from each frame of the movie and the resulting image is binarized to identify the mouse pixels. The mouse tail is automatically removed and the two most distant points of the remaining mouse are determined; these are close to nose and base of tail. By analyzing the motion of the mouse and using continuity arguments, the nose is identified.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" /> 
Figure 1. Assessment of Sociability During 3 sessions. Session I (top): Acclimation of test mouse to the cage. Session II (middle): Test mouse moving freely in the cage while the stimulus mouse is enclosed in an inverted cup. Session III (bottom): Both test mouse and stimulus mouse are allowed to move freely and interact with each other.

This protocol describes a method to quantify mouse sociability. Mice are videotaped as they move and interact in a special cage. Movie processing allows for the automated quantification of sociability with excellent accuracy and reliability.

Avaliação experimental de rato Sociabilidade utilizando uma abordagem de processamento de imagem automatizado

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human auditory development for these age groups. This paper describes an observer-based procedure for measuring hearing sensitivity with a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm. Young children are trained to perform a play-based, motor response (e.g., putting a block in a bucket) whenever they hear a target signal. An experimenter observes the child&#39;s behavior and makes a judgment about whether the signal was presented during the first or second observation interval; the experimenter is blinded to the true signal interval, so this judgment is based solely on the child&#39;s behavior. These procedures were used to test 2 to 4 year-olds (n = 33) with no known hearing problems. The signal was a 1,000 Hz warble tone presented in quiet, and the signal level was adjusted to estimate a threshold corresponding to 71%-correct detection. A valid threshold was obtained for 82% of children. These results indicate that the two-interval procedure is both feasible and reliable for use with toddlers and preschoolers. The two-interval, observer-based procedure described in this paper is a powerful tool for evaluating hearing in young children because it guards against response bias on the part of the experimenter.

This paper describes a procedure for measuring hearing sensitivity in 2 to 4 year-old children. Children are trained to perform play-based responses when they hear a target signal. Thresholds are then estimated in a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm, based on observations of the child&#39;s behaviors.

Avaliação do comportamento auditivo em 2 a 4 anos de idade Crianças: um procedimento de dois intervalo, com sede em Observer Usando respostas condicionadas à base de Reprodução

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

Uma bateria de testes comportamentais para a avaliação repetida das habilidades motoras, humor e cognição em ratos

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Utilizing a Reconfigurable Maze System to Enhance the Reproducibility of Spatial Navigation Tests in Rodents

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze shape, thus requiring several separate mazes in different configurations. The maze geometry cannot be reconfigured in a single environment to accommodate scalability and reproducibility. The reconfigurable maze is a unique approach to address the limitations, allowing quick and flexible configurations of maze pathways in a repeatable manner. It consists of interlocking pathways and includes feeders, treadmills, movable walls, and shut-off sensors. The current protocol describes how the reconfigurable maze can replicate existing mazes, including the T-shaped, plus-shaped, W-shaped, and figure-eight mazes. Initially, the T-shaped maze was constructed inside a single experimental room, followed by modifications. The rapid and scalable protocol outlined herein demonstrates the flexibility of the reconfigurable maze, achieved through the addition of components and behavioral training phases in a stepwise manner. The reconfigurable maze systematically and precisely assesses the performance of multiple aspects of spatial navigation behavior.

The present protocol describes a reconfigurable maze, a unique system for testing spatial navigation and behavioral phenotypes in rodents. The adaptability of this maze system enables the execution of various experiments in a single physical environment. The ease of structural rearrangement generates reliable and reproducible experimental results.

Utilizando um sistema de labirinto reconfigurável para melhorar a reprodutibilidade dos testes de navegação espacial em roedores

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze ...

Validando um modelo murino da síndrome de Angelman usando testes comportamentais

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

Autor em destaque: uma bateria de testes comportamentais altamente reproduzíveis para validar um modelo murino da síndrome de Angelman 

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.

Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...