This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

NOTA: Todos os protocolos que envolvam animais foram seguidos de acordo com as orientações de cuidados de animais de The Pennsylvania State University, IACUC # 44057 1. Lentivírus Produção NOTA: O dia antes da transfecção, LentiX-293 deve ser a 80% de confluência. <ol><li> Lavar as células com DMEM apenas antes da transfecção e incubar em 10 ml de DMEM / 10% de FBS com penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 ug / ml) durante 5 min à TA. </li><li> Dilui-se o ADN e polietilenimina (PEI) (1 mg / ml) em 1: 3 de proporção (1 ug de ADN: 3 ul de PEI) em 1 ml de DMEM e vortex durante 1 min. O volume de ADN adicionada é dependente da concentração do DNA. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. <ol><li> Por exemplo, utilizar 20 ug de plasmídeo ADN, composta por 10 ug de vector de plasmídeo, 5 ug de plasmídeo psPax2 14, 5 ug de vírus da estomatite vesicular (VSV) com 60 ul de PEI por prato. </li></ol></li><li&gt; Misturar a solução de DNA e de PEI de novo com vortex durante 1 min. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Adicionar 1/10 total de volume de meio de cultura de DMEM (isto é, 1 ml para 10 ml de meio de cultura numa placa de 100 mm). Adicionar 1 ml de ADN-PEI mistura gota a gota para o prato e o prato de rodar em volta até ao meio de cultura é bem misturado com o ADN. </li><li> Incuba-se durante 6 horas à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Adicionar 5 ml de meio de cultura. </li><li> 48 h após a transfecção, recolher o sobrenadante viral e girar a 627 xg durante 5 min a 4 ° C em um tubo de 50 ml. Filtro de 30 ml de sobrenadante viral através de um filtro de seringa de 0,45 um para um tubo de ultracentrífuga. </li><li> Adicionar água estéril para equilibrar os tubos, e cobrir os tubos com pequeno pedaço de parafilme. Tubos giram a 11.249 xg durante 120 min a 4 ° C. Remover o líquido utilizando uma ponta de vácuo. </li><li> Adicione 100 ml de PBS frio do tubo. Agite suavemente o tubo a 4 ° CO / N. </li><li> Para voltar a suspender o vírus, pipeta tele PBS adicionado no passo 1,8 ao longo dos pellets 10 vezes, tomando cuidado para não tocar a pelota com a ponta. O pellet não será re-suspenso até que este esteja completo. </li><li> Alíquota o vírus em 10-20 ul por tubo, flash-congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 2. injeção estereotáxica 2.1) Preparação de Instrumentos <ol><li> Coloque um par de tesouras, pinças blunt-end, um porta-agulhas, bisturi, cotonetes, e um pano em um pacote selado com um indicador de esterilização e autoclave antes da cirurgia. Além disso, obter 10% de iodo povidona, álcool etílico 70%, suturas absorvíveis, uma almofada de aquecimento, lágrimas artificiais, um talão de vidro esterilizador, broca, uma broca, duas seringas descartáveis, uma seringa de injeção, barbeador elétrico, analgésico (cetoprofeno), anestésico (Avertin), luvas, e um aparelho de estereotaxia com bomba de injecção. </li><li> Faça solução 1,25% avertin fresco naquele dia, filtro em uma capa estéril usando um 0,2 &amp;# 181; m filtro de seringa estéril, e coloque em um frasco de soro estéril. Misture 2,5 g de álcool 2,2,2-tribromoetilo em 5 ml de álcool terc-amílico, em seguida, dissolvem-se em 200 ml de água. Manter o pH abaixo de 5. 15 </li></ol> 2.2) Preparação do Rato <ol><li> Administrar Avertin com base no peso do rato (375 mg / kg). 15 Injectar o rato com o avertina através de uma injecção intraperitoneal (IP) de injecção, e, em seguida, colocar volta para a sua gaiola até estar completamente anestesiado. </li><li> Dê um analgésico via injeção IP (ketaprofen, 5 mg / kg), e lugar de lágrimas artificiais sobre os olhos do mouse para evitar a secagem. </li><li> Certifique-se de que o mouse é totalmente adormecido por beliscar seu pé. Se o rato responde ao pé de aperto, em seguida, dar mais anestésico (em doses de 50 uL). Raspar a cabeça do rato usando um barbeador elétrico. Raspar a área a ser operada (tipicamente de apenas atrás das orelhas, a parte superior do focinho), e a área circundante. </li><li> Coloque o rato into do aparelho estereotáxica. Trava os dentes da frente para a braçadeira anterior, e abaixe a braçadeira e aperte-o de modo que a mandíbula é totalmente seguro. </li><li> Coloque as barras de ouvido no canal do ouvido para estabilizar completamente a cabeça. Tenha cuidado para não inserir as barras de ouvido demasiado para dentro, o que poderia danificar o ouvido interno. Uma vez terminado, o corpo do rato deverá ser capaz de ser movido ligeiramente sem interromper a posição da cabeça. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento sob o rato a fim de regular a temperatura do corpo do rato ao longo do procedimento. </li><li> Limpe a área cirúrgica completamente. Usando um cotonete, esfregar 10% de iodopovidona em um movimento circular, a partir do meio do local cirúrgico e movendo-se para o exterior. Em seguida, utilizando um pano de algodão para esfregar o álcool etílico a 70% no local da cirurgia da mesma maneira. Repita mais duas vezes. </li></ol> 2.3) A primeira incisão <ol><li> Uma vez que o rato está preparado, abra o saco de equipamento estéril. Mudar de luvas antes touching os instrumentos. Retire o pano estéril e coloque os instrumentos sobre o pano. Se qualquer instrumento toca uma superfície não-estéril, utilize o talão esterilizador de vidro por 15 segundos para esterilizar. </li><li> Tome o bisturi na mão e blunt-end fórceps dominantes na mão não-dominante. Use a pinça blunt-end para suavemente aderência da pele do rato, e fazer uma incisão usando o bisturi. Comece a incisão cerca de 1,5 cm acima das orelhas (em direção ao nariz) e se estendem até cerca de 0,5 cm abaixo das orelhas. Estender a incisão vertical no meio da cabeça do rato para expor bregma (Figura 1). </li><li> Uma vez bregma é visualizada, dê uma ponta de algodão estéril para remover suavemente todo o sangue cobrindo a superfície do crânio. Use duas pontas de algodão para empurrar a pele em direcção ao lado da cabeça. </li></ol> 2.4) Configuração de Equipamento <ol><li> Depois de todo o sangue é removido a partir da superfície do crânio, e é claramente visualizada bregma, preparar a seringa (CONcentração de 8 a 10 TU / ml, volume de 1 mL). Na hotte, encher a seringa com o vírus a ser injectado. Certifique-se que não há bolhas estão no interior. Coloque a seringa no aparelho estereotáxico, certificando-se de que está plenamente assegurada. </li><li> Lentamente inferior da seringa até que esteja bem acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha da seringa estéril é definido como a intersecção da bregma e a linha interaural. Definir este ponto como zero, e determinar as coordenadas a partir deste ponto. </li><li> Dependendo da área de cérebro de interesse, variar as coordenadas estereotáxicas. Determinar essas coordenadas, utilizando um atlas do cérebro 4. Uma vez que as coordenadas são determinados, mover a agulha da seringa para combinar essas coordenadas. Alvo do giro dentado usando as coordenadas: M / L = +/- 1 mm, de A / P = -1,82 mm. Abaixe a agulha para a direita acima do crânio para visualizar onde o buraco tem de ser perfurados. </li><li> Levante a seringa um pouco, tomar a broca e coloque a broca bit logo acima do local de perfuração alvo em cerca de um ângulo de 45 ° com o crânio. Começar a perfurar, e manter a perfuração até que o crânio dá lugar. Quando o crânio dá forma, uma queda na resistência pode ser detectada. Seja o cuidado de não perfurar o cérebro, de modo a evitar danos cortical. </li><li> Pegue um cotonete estéril e limpar qualquer sangue do buraco. </li><li> Abaixe a seringa de modo que a ponta fica na superfície do cérebro (não o crânio). Definir a coordenada D / V (profundidade) a 0. inferior a seringa para a profundidade desejada, com base nas coordenadas do atlas do cérebro. Para atingir o giro dentado, definida D / V para -1,79 mm. </li><li> Iniciar a injecção a uma velocidade de 0,2 ul / min. Relógio para garantir que a seringa não escorregar mais baixa do que a profundidade desejada. Se isto ocorrer, levantar suavemente a seringa para a profundidade desejada de novo. </li><li> Após a injecção está terminada, esperar cerca de 2 minutos para assegurar que qualquer vírus residual foi absorvido. Lentamente levantar a seringa e use um cotonete para remover qualquer lilibras a partir do local de injecção. </li><li> Repita para o outro hemisfério. </li></ol> 2.5) Sutura <ol><li> Retirar o fio de sutura e agulha estéril da embalagem e prender a agulha usando os suportes da agulha. Enfrentar a borda afiada da agulha longe de suporte da agulha. Segure a pinça blunt-end na mão não dominante, e usá-lo para agarrar a pele do rato. Comece com a mão dominante. </li><li> Empurrar suavemente o fio de sutura através da pele e utilizam a pinça de extremidade romba para agarrar a pele do outro lado da incisão. Puxe o material de sutura através de até cerca de 0,75 polegadas permanece. </li><li> Deixe de lado a agulha, e usar a pinça blunt-end para envolver a sutura em torno do suporte de agulha uma vez, em seguida, pegue a sutura restantes 0,75 polegadas com suporte de agulha e puxe o fio de sutura através, de modo que o suporte da agulha e agulhas acabar no lado oposto da cabeça para que eles foram originalmente no. Isso deve formar um nó. </li><li> Repita este passomais três vezes, alternando o lado da cabeça de retenção da agulha termina-se em cada tempo. </li><li> Cortar o fio de sutura e repita os passos 2.5.1-2.5.3 até que a incisão é fechada. </li></ol> 2.6) cuidados pós-operatórios <ol><li> Remova cuidadosamente as barras de ouvido do rato, e remover a mandíbula da braçadeira anterior. </li><li> Mantenha o mouse sobre a almofada de aquecimento até que ele acorda e se move em torno de seu próprio. Monitorar o mouse diariamente, e manter e olho para fora para sinais de dor, como não preparação, comer ou beber. Dê analgésico adicional quando julgar necessário. </li></ol> 3. Abra Campo de Provas 3.1) Configurar <ol><li> Obter um quadrado vazio, arena de plástico com dimensões 50 centímetros x 50 cm, com 50 cm de altura paredes (mas pode ser um pouco maior). Limpar a arena com 70% de álcool etílico antes do início da experiência. Verifique se o álcool etílico esteja totalmente seca antes de colocar um mouse para a arena. </li><li> Coloque a arena nachão, e tentar garantir a iluminação está definido para minimizar sombras e reflexos. </li><li> Se estiver usando o software de rastreamento, posicione a câmera diretamente acima do campo aberto, cerca de 1,5 pés acima do campo aberto (longe o suficiente para abranger completo toda a arena, mas perto o suficiente para ter uma visão clara do mouse). </li><li> Configurar uma zona no centro da caixa (aproximadamente uma área de 30 cm x 30 cm). 16 Para definir uma zona, clique na guia zona 1 no painel lateral. <ol><li> Escolher um contorno da forma do painel superior, e o contorno do perímetro da zona central. Selecione adicionar a zona e clique no interior da zona centro. Usando as instruções do programa, nome da zona (isto vai ser referido como &quot;centro&quot; para este procedimento). Se o teste comportamental serão marcados com a mão, certifique-se o fundo do campo é dividido em 10 cm x 10 cm quadrados, marcado com fita. </li></ol></li><li> Configure o software para que as configurações estão corretas, eo mouse é facilmente visible na tela. Conseguir isso, ajustando as configurações de detecção na máquina para ser compatível com a arena de testes (iluminação) e cor mouse. NOTA: Quando as configurações estiverem corretas, o sistema deve rastrear apenas o mouse, e não quaisquer sombras ou urina / matéria fecal. As definições do software específicos dependem da iluminação da arena, e a cor do rato. </li></ol> 3.2) aclimatação e de ensaio <ol><li> Mova camundongos experimentais para o comportamental sala 1 hora antes do ensaio, a fim de aclimatar-los para os seus arredores. Deixe os ratos em sua gaiola para a aclimatação. </li><li> Ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental e coloque o mouse em direção à frente meio da arena, para que o rato está virado para a parede. </li><li> Ajustar o cronômetro para 5 min, e afastar-se da arena. Se possível, deixe o quarto para não acidentalmente influenciar o mouse. </li><li> Uma vez que 5 min estão em alta, remover o mouse e colocá-los em sua gaiola. </li><li> Use álcool etílico 70% a limpeza profunda de todo o campo antes de prosseguir para a próxima mouse. Verifique se o álcool etílico esteja totalmente seca. </li></ol> 3.3) Scoring <ol><li> Considere o rato como estando no centro do campo quando todas as quatro patas estão dentro do meio de 30 cm x 30 cm. </li><li> Quantificar a quantidade de tempo que o rato gasta no centro. Alternativamente, determinar desta vez usando software de monitoramento (como Noldus ethovison). <ol><li> Para fazer isso, vá até a guia análise e clique em &quot;movimento&quot; em perfis de análise. Excluir as categorias definidas atualmente, e em seguida, selecione &quot;na zona&quot; sob a guia de localização. Selecione a zona centro. Em seguida, selecione &quot;saída da análise&quot; (na guia resultados) para ver os resultados. Uma tabela listando o tempo gasto imóvel para cada ensaio deve aparecer. </li></ol></li><li> Caso contrário, marcar o OFT à mão. O campo aberto deve ter 25 10 cm x 10 cm quadrados descritas na parte inferior da abercampo n (conforme descrito no passo 3.1.3). Quantificar a quantidade de tempo que o rato gasta no centro, para além do número de entradas para o centro da arena. 16 NOTA: O centro de 30 cm x 30 cm área é considerada o centro do campo aberto. Um rato é considerado como habitando a região do centro, se todas as quatro patas estão dentro da área cm a 30 x 30. </li></ol> 4. Teste de Natação Forçada NOTA: Permitir que um mínimo de cinco dias entre tarefas comportamentais. 4.1) Configurar <ol><li> Obter um balde de 2 L claro, e preencha com 22 ° C de água. Coloque o balde sobre uma mesa, e tentar garantir a iluminação está definido para minimizar sombras e reflexos. </li><li> Se estiver usando o software de rastreamento, posicione a câmera diretamente em cima do balde. </li><li> Configurar o seu software de modo que o mouse é facilmente visível no ecrã. </li></ol> 4.2) aclimatação e de ensaio <ol><li> Mova camundongos experimental no ro comportamentalom 1 hora antes do teste para aclimatar os arredores. Deixe os ratos em sua gaiola para a aclimatação. </li><li> Ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental. Delicadamente, coloque o mouse no meio do balde de água. Certifique-se de não deixar cair o mouse em. Lentamente, abaixe o mouse, para que seus pés dianteiros tocar a água em primeiro lugar. Tome cuidado para evitar a sua cabeça fique submerso. </li><li> Ajustar o cronômetro para 6 min, e afastar-se da área comportamental. </li><li> Uma vez que 6 min são para cima, remova o mouse do balde, e limpe o excesso de água antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola. </li></ol> 4.3) Scoring <ol><li> Se você estiver usando software de monitoramento, definir por cento imobilidade a 11%, como sugerido por Noldus (esta deve ser a configuração padrão), para quantificar o tempo flutuante vs. natação. </li><li> Para quantificar usando o sistema de rastreamento, vá para a aba análise, e clique em circulação em regime de perfis de análise. Excluir as categorias definidas atualmente, e em seguida, selecione Estado da mobilidade, emo painel do lado esquerdo (em comportamento individual). Definir a imobilidade até 11%. </li><li> Selecione a visualização da trilha, sob a guia resultados. Selecione saída de análise (na guia resultados) para ver os resultados. Uma tabela listando o tempo gasto imóvel para cada ensaio deve aparecer. </li><li> Se marcar lado, medir o tempo passa o mouse natação ou escalada, ea quantidade de tempo gasta o mouse imóvel. Além disso, medir a latência para o primeiro tempo de imobilidade. Veja a Figura 2 em resultado secção. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Injecções estereotáxicas de sucesso dependem de três fatores: manter o rato vivo, definindo o ponto zero correto para coordenadas (ponta da agulha na intersecção de bregma ea linha interaural), e definir a profundidade direito ao ponto zero (ponta da agulha apenas a tocar o exterior do tecido cerebral). A viabilidade dos murganhos é importante. Sobrevivência cirurgia pode ser auxiliada por certificando-se de que o mouse está devidamente anestesiados e recebe analgésica adequada. A dor é conhecido por ser uma ...

O rato tem sido amplamente utilizada em neurobiologia, porque é fácil de manipular geneticamente. Técnicas gene knockout permitir que os investigadores para investigar como cada fator genético molda comportamentos do mouse. Além disso, o sistema cre-loxP fornece uma ferramenta valiosa para Tecido e célula de tipo nocaute de genes específicos em camundongos, o que permite aos pesquisadores para estudar a função de genes em diferentes tecidos. 1 Contudo, na prática, os padrões de promotores cre de expressão são difíceis de controlar , e até agora muitos condutores cre estabelecidas não ter alcançado uma expressão específica da região 2,3. Em alternativa, a injecção estereotáxica é um método que tem como alvo regiões específicas do cérebro de rato adulto o. Por injecção de vírus geneticamente modificadas que expressam ADNc ou shRNA, a modulação da expressão génica específica da região pode ser alcançado. Embora o tamanho do cérebro de cada ratinho varia, a localização de regiões específicas do cérebro pode ser determinada utilizando coor estereotáxicanates definir a partir de pontos de referência no crânio do cérebro do rato. Os marcos mais comumente usados ​​são bregma, lambda, ea linha interaural. Utilizando as coordenadas obtidas a partir de um atlas cerebrais, 4 a localização exacta de cada área do cérebro pode ser identificado pela ântero-posterior (A / P), medial-lateral (H / L), e dorso-ventral (D / V) de eixos bregma / intersecção linha interaural. Tipicamente os vírus injectado no cérebro de ratos são marcados com qualquer proteína fluorescente vermelha ou verde (GFP ou RFP), de modo que as injecções pode ser confirmada por microscopia de fluorescência. Avaliações comportamentais dos ratos são especialmente necessários para a investigação básica de transtornos psiquiátricos. Os sintomas de transtornos psiquiátricos em pacientes tipicamente envolvem comportamentos anormais. Alguns destes comportamentos humanos são evolutivamente conservada e pode ser directamente imitou e observadas no rato. Por exemplo, a depressão pode ser modelada no rato medindo desespero comportamental. Pessoas com depressão often sentir como se nada fazem sempre vai ajudar, um sintoma que pode eventualmente levar ao suicídio. Em roedores, este pode ser modelado utilizando o Teste de Natação Forçada (FST), que mede a quantidade de tempo que um rato nadando contra flutuando em uma piscina de água (vistos como desistir). Este paradigma é validada por resgatar o fenótipo com anti-depressivos. 7,8,9 ratos que receberam anti-depressivos vai gastar muito menos tempo imóvel comparação com os controlos não tratados. Outro teste comportamental, o teste de campo aberto (OFT) é concebido para avaliar a locomoção em ratinhos, e, adicionalmente, pode ser utilizada para analisar o fenótipo ansiedade em ratos. 5,6 Este teste baseia-se na premissa de que os ratos se sentir mais segura quando estão perto para a parede em um romance campo aberto. Camundongos selvagens acabará por explorar o novo ambiente, pois são animais curiosos. No entanto, passar menos tempo no centro do campo indica ansiedade no rato, como o rato não irá ser capaz de superar a INITIAl medo causado por um ambiente de romance. A ansiedade do rato, como quantificado pela quantidade de tempo despendido no centro de um campo aberto, pode ser comparada a ansiedade clínica em seres humanos, o qual está presente em muitos distúrbios psiquiátricos. A combinação de injecções estereotáxicas com os paradigmas comportamentais é uma nova maneira de alterar a expressão de um gene específico em uma área alvo do cérebro. O efeito da expressão do gene modulado em comportamentos de ratos pode então ser determinada. Em contraste com nocaute do cérebro inteiro, este método é particularmente útil uma vez que tem como alvo apenas áreas específicas do cérebro. Além disso, as injecções estereotáxicas são tipicamente realizadas no tipo selvagem do rato adulto, por conseguinte, a expressão do gene endógeno foi mantida ao longo das etapas de desenvolvimento. Este método vai evitar o efeito confundem, se o gene é necessária para a sobrevivência durante o estágio embrionário ou pós-natal do desenvolvimento. Uma grande limitação é que os camundongos experimentais precisa ir through uma cirurgia invasiva, em que os crânios dos murganhos têm de ser abertos. Além disso, o grau de modulação do gene é determinada por titulação e a eficiência do vírus. O vírus tem de ser injectado na região correcta através de coordenadas estereotáxicas, que requer instrumentos especiais. Verificação do local de injecção correcta só pode ser concluído post mortem. Este método tem sido utilizado para testar o envolvimento de um gene específico em várias doenças neurológicas. Por exemplo, viral mediada por ARNi do gene alvo Th (que permite a dopamina a ser sintetizado) foi injectada na substância negra compacta, e a análise do comportamento locomotor foi conduzido. 10 Outro estudo utilizou injecção estereotáxica de um Disc1 silenciamento lentivírus para avaliar o comportamento do rato em relação a esquizofrenia. Knockdown de Disc1 levaram a um aumento da locomoção em resposta a novidade (paralelos sintomas positivos em esquizofrenia), e maior na imobilidadeFST. 11 De forma semelhante, um estudo adicional descobriu que 5-HT 1B superexpressão levou a um comportamento exploratório aumentado no OFT, consistente com um fenótipo anti-ansiedade usando este método. 12 injecções estereotáxicas pode entregar vírus para induzir a recombinação cre em ratinhos cre-loxP . Este método foi utilizado para eliminar selectivamente o receptor Y2 na amígdala e o núcleo da estria terminal. Após a análise comportamental, estes ratos foram encontrados para um fenótipo anti-depressivo quando o gene foi eliminado na amígdala central, mas não fenótipo quando o gene foi eliminado na amígdala basolateral ou do núcleo do leito do stria terminalis. 13 Assim, esta técnica fornece uma ferramenta única para estudar o efeito genético sobre os comportamentos dos animais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereotactic Apparatus item 51725</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting co.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Quintessential stereotaxic pump&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting co.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">53311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection Styringe, 65 RN</td>
			<td style="width:107px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7633-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PEI&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Polysciences Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:107px;">Fine Surgical Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Blunt end forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fine Surgical Tools</td>
			<td style="width:119px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Needle holder&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fine Surgical Tools</td>
			<td style="width:119px;">12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Drill</td>
			<td style="width:107px;">Ram Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td>
			<td>with pedal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Inotech&#160;</td>
			<td style="width:119px;">IS-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absorbable sutures&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Unify</td>
			<td style="width:119px;">M-K518r19</td>
			<td>Absorbable, reverse cutting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cotton swabs</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89031-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">T-pump TP-500 PN11184-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Artificial tears</td>
			<td style="width:107px;">Rugby</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0536-6550-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable syringe</td>
			<td style="width:107px;">BD Syringe</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloth</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gloves&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Ansell</td>
			<td style="width:119px;">Senseitouch #7823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Avertin or other anesthetic</td>
			<td style="width:107px;">see recipe citation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ketoprofen or other analgesic</td>
			<td style="width:107px;">see veternarian&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tracking software</td>
			<td style="width:107px;">Noldus</td>
			<td style="width:119px;">Ethovision XT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tracking Camera</td>
			<td style="width:107px;">Noldus</td>
			<td style="width:119px;">Media Recorder</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors

Injecção estereotáxica é uma técnica útil para entregar lentivírus de título elevado para as áreas do cérebro em ratos segmentados. Os lentivírus podem ou sobre-expressar ou a expressão do gene knockdown numa região centrada relativamente sem danos significativos para o tecido do cérebro. Após a recuperação, o rato injetado pode ser testado em várias tarefas comportamentais, tais como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST). O OFT é concebido para avaliar o fenótipo locomoção e ansioso em ratos, medindo a quantidade de tempo que um rato passa no centro de um novo campo aberto. Um rato mais ansiosos vai gastar muito menos tempo no centro do romance campo em comparação aos controles. O FST avalia o fenótipo anti-depressivo por quantificação da quantidade de tempo que os ratos passam imóvel quando colocada num balde de água. Um rato com um fenótipo anti-depressivo vai gastar muito menos tempo imóvel comparado ao grupo controle. O objetivo deste protocolo é usar o stereotactic injeção de um lentivírus em conjunto com testes comportamentais para avaliar como fatores genéticos modular comportamentos animais.

<html> Injeção estereotáxica precisas depende fortemente de definir as coordenadas corretas. A ponta da agulha utilizada para injectar o vírus deve ser definido directamente na intersecção da bregma e a linha interaural (Figura 1). É útil a utilização de um microscópio estereoscópico para determinar se ou não a agulha está correctamente colocado. Ao olhar através do microscópio, a agulha deve ser posicionado de modo que, se o vírus foram injectados, seria aterrar directamente na intersec...

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Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST).

Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Research

JoVE Journal

Behavior

14.1K visualizações.  The Pennsylvania State University.  Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST). 

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Comportamento

A Within-subjects Experimental Protocol to Assess the Effects of Social Input on Infant EEG

Despite the importance of social interactions for infant brain development, little research has assessed functional neural activation while infants socially interact. Electroencephalography (EEG) power is an advantageous technique to assess infant functional neural activation. However, many studies record infant EEG only during one baseline condition. This protocol describes a paradigm that is designed to comprehensively assess infant EEG activity in both social and nonsocial contexts as well as tease apart how different types of social inputs differentially relate to infant EEG. The within-subjects paradigm includes four controlled conditions. In the nonsocial condition, infants view objects on computer screens. The joint attention condition involves an experimenter directing the infant's attention to pictures. The joint attention condition includes three types of social input: language, face-to-face interaction, and the presence of joint attention. Differences in infant EEG between the nonsocial and joint attention conditions could be due to any of these three types of input. Therefore, two additional conditions (one with language input while the experimenter is hidden behind a screen and one with face-to-face interaction) were included to assess the driving contextual factors in patterns of infant neural activation. Representative results demonstrate that infant EEG power varied by condition, both overall and differentially by brain region, supporting the functional nature of infant EEG power. This technique is advantageous in that it includes conditions that are clearly social or nonsocial and allows for examination of how specific types of social input relate to EEG power. This paradigm can be used to assess how individual differences in age, affect, socioeconomic status, and parent-infant interaction quality relate to the development of the social brain. Based on the demonstrated functional nature of infant EEG power, future studies should consider the role of EEG recording context and design conditions that are clearly social or nonsocial.

This novel protocol is designed to assess the neural bases of social interaction in infants. The paradigm is designed to tease apart how various social inputs such as language, joint attention, and face-to-face interaction relate to infant neural activation. Infant EEG power is recorded during both social and nonsocial conditions.

A intra-sujeitos Experimental Protocolo para avaliar os efeitos da entrada Social sobre EEG infantil

Despite the importance of social interactions for infant brain development, little research has assessed functional neural activation while infants ...

Testing Animal Anxiety in Rats: Effects of Open Arm Ledges and Closed Arm Wall Transparency in Elevated Plus Maze Test

The elevated plus maze test is a behavioral test for assessing animal anxiety in rodents. Although this test is widely applied in the field of behavioral science, conflicting outcomes are often provided from different laboratories. To identify reasons for the different outcomes, we previously focused on arm features, which differ between laboratories, most notably the presence/absence of ledges at the sides of open arms and the transparency/opaqueness of closed arm walls. In a previous report, we used a custom designed container to compare rat behavior on different combinations of open and closed arm designs under otherwise identical experimental conditions, and showed that differences in arm features interfere with experimental outcomes. In brief, open arm ledges significantly increased anxiety-like behavior in rats, while transparent arms may also have decreased this behavior. Furthermore, we verified a higher detection sensitivity of the effect of an anxiolytic drug in a combination of no-ledged open arm + opaque walled closed arm compared with a combination of ledged open arm + transparent walled closed arm. In this report, we introduce our protocol for the elevated plus maze test, together with discussion of the key results from the previous report and our experimental experience. We believe this report will provide useful information for researchers who have employed or who plan to use the elevated plus maze in their studies.

Rats' anxiety-like behavior tested by the elevated plus maze varies highly depending on the testing environment. Here we show how apparatus settings, especially arm structure, affect behavior on the maze, and we explain a reliable protocol to detect effects of anxiolytic drugs. This report will contribute to anxiety research.

Testes Animal ansiedade em ratos: efeitos de bordas de braço aberto e fechado do braço de parede transparência em elevados além de teste de labirinto

The elevated plus maze test is a behavioral test for assessing animal anxiety in rodents. Although this test is widely applied in the field of behavioral ...

Assessment of Social Transmission of Food Preferences Behaviors

Olfactory recognition deficits are suggested to be able to serve as clinical marker to differentiate Alzheimer&#39;s disease (AD) subjects from healthy aging groups. For example, olfactory dysfunction in AD can present as impairment in olfactory recognition, emerging during early stages of the disease and worsening while the disease progresses. The social transmission of food preferences (STFP) task is based on a rudimentary form of communication between rodents concerning distant foods dependent on the transmission of olfactory cues. Healthy wild-type mice would prefer to eat a novel, flavored food that was previously cued by a conspecific, and this food preference would be hampered in transgenic AD mice, such as the APP/PS1 model. Indeed, a strong preference for the cued food in C57Bl6/J mice of 3 months of age was found, and this was reduced in 3 months old transgenic APP/PS1 mice. In summary, STFP task could be a powerful measure to be integrated in present subclinical detection assays of AD.

This paper presents a protocol for the investigation of social transmission of food preference in mice. The advantages and possible applications for this procedure, for instance, in detecting early changes in AD mouse models, are highlighted. To conclude, interpretation of the results in light of critical details are discussed.

Avaliação da transmissão Social dos comportamentos de preferências alimentares

Olfactory recognition deficits are suggested to be able to serve as clinical marker to differentiate Alzheimer&#39;s disease (AD) subjects from healthy ...

Tickling, a Technique for Inducing Positive Affect When Handling Rats

Handling small animals such as rats can lead to several adverse effects. These include the fear of humans, resistance to handling, increased injury risk for both the animals and the hands of their handlers, decreased animal welfare, and less valid research data. To minimize negative effects on experimental results and human-animal relationships, research animals are often habituated to being handled. However, the methods of habituation are highly variable and often of limited effectiveness. More potently, it is possible for humans to mimic aspects of the animals&#39; playful rough-and-tumble behavior during handling. When applied to laboratory rats in a systematic manner, this playful handling, referred to as tickling, consistently gives rise to positive behavioral responses. This article provides a detailed description of a standardized rat tickling technique. This method can contribute to future investigations into positive affective states in animals, make it easier to handle rats for common husbandry activities such as cage changing or medical/research procedures such as injection, and be implemented as a source of social enrichment. It is concluded that this method can be used to efficiently and practicably reduce rats&#39; fearfulness of humans and improve their welfare, as well as reliably model positive affective states.

This article demonstrates the standardized application of playful handling, a tickling technique designed to mimic rat rough-and-tumble play. This technique is effective at reducing fearful reactions to humans and generating positive affect when rats are handled for common husbandry activities and medical and research procedures such as injection.

Cócegas, uma técnica para induzir o efeito positivo ao manusear ratos

Handling small animals such as rats can lead to several adverse effects. These include the fear of humans, resistance to handling, increased injury risk ...

Using a Classroom-Based Deese Roediger McDermott Paradigm to Assess the Effects of Imagery on False Memories

Associated word list procedures can elicit false memories in predictable ways by inducing associative processing, thus making it harder to monitor the accuracy of memories. The purpose of the method presented here was to induce false memories using lists of either semantically or phonologically related words and to assess the effects of imagery instructions on the recall and recognition of those false memories. To do this, we used a modified version of the Deese Roediger McDermott (DRM) paradigm. We adapted word lists from previous DRM studies to suit imagery procedures and created an automated presentation to present the word lists in classroom settings. We then recruited undergraduate classes and instructed some of the classes to create mental images of the list words as they were being presented, while instructing the other classes to simply remember the words. The automated presentation presented word lists to participants, one word at a time, alternating between phonologically and semantically related lists. Participants used paper-pencil recall packets to immediately recall list items, complete a distractor activity, and take a subsequent final recognition test. Often, participants immediately recalled and later recognized words that were related to the list items but were not actually presented; these are known as critical lures and indicate a false memory. The protocol detailed here describes a four-step procedure - list presentation, immediate recall, distractor phase, and final recognition - that can assess the effects of list type and imagery instruction within the DRM paradigm on memory. The automated nature of the list presentation provides the ability to systematically vary variables of interest, and the paper and pencil method of data collection affords an easily accessible method for collecting data in classroom settings. The protocol also offers options to modify the procedure to a more traditional DRM paradigm without imagery and/or list type manipulations. The use of this protocol can provide results relevant to both classroom learning and cognitive science principles.

The method presented here induced false memories using lists of related words and also assessed the effects of imagery instructions on the recall and recognition of those false memories. This protocol details a modified version of the Deese Roediger McDermott (DRM) paradigm.

Usando um paradigma de McDermott Roediger Deese baseados em sala de aula para avaliar os efeitos de imagens sobre falsas memórias

Associated word list procedures can elicit false memories in predictable ways by inducing associative processing, thus making it harder to monitor the ...

Assessing the Coherence of Parents' Short Narratives Regarding their Child Using the Five-Minute Speech Sample Procedure

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with parents. This paper focuses on such a method, namely Five-Minute Speech Sample-Coherence (FMSS-Coherence). In this method, a parent is asked to speak for five uninterrupted minutes about her/his child and their relationship. The resulted narrative is coded for coherence, namely the extent to which the parent provides&#160;in the narrative&#160;a clear, consistent, multidimensional and well-supported portrayal of the child. FMSS-Coherence is based on attachment research that shows that the coherence of parents&#8217; narratives is indicative of the quality of the parent-child relationship and child adjustment. It overcomes the limitations of attachment narrative measures which are typically labor intensive. FMSS-Coherence is less nuanced than extant attachment narrative measures. Yet, studies of families from different cultural backgrounds, across different child ages and in the context of typically developing children as well as children with special needs suggest that coherence can be reliably evaluated using the FMSS procedure. Furthermore, parents&#8217; FMSS-Coherence is associated with parenting quality and children&#8217;s socio-emotional adjustment. Thus, it holds promise for researchers and practitioners who seek a relatively time- and cost-effective method for assessing the coherence of parents&#8217; narratives regarding their child.

This paper introduces a method for assessing the coherence of parents' short narratives regarding their child and their relationship using the five-minute speech sample procedure.

Avaliando a coerência das narrativas curtas dos pais em relação ao seu filho usando o procedimento de amostra de fala de cinco minutos

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with ...

Applying an eMASS Customization Program as a Research Tool to Evaluate Consumer Benefits

As many scholars and practitioners study personalization and relationship marketing, it is important to provide personalization such as mass customization through marketing technology. The purpose of this study is to examine how to conduct consumer research using an online survey and analysis of data. This study examines consumers&#39;&#160;perceived benefits while customizing a product as well as emotional product attachment, attitudes toward a customization program, and loyalty intentions in the context of online retailing. In addition, this study investigates how consumer responses are different based on individual characteristics such as fashion innovativeness. An online survey company in South Korea recruited 290 female apparel shoppers who purchased apparel online. To enhance external validity, this study used an existing retail website with a well-established mass customization program. After completing the customization program, participants complete the online questionnaire. Structural equation modeling (SEM) and latent mean analyses (LMAs) are then performed for analyses. This study stresses the importance of testing measurement invariance for mean comparisons. Before the SEM and LMA, this study follows the hierarchy of invariance tests (configural invariance test, metric invariance test, and scalar invariance test), which are not considered by traditional approaches such as ANOVA. These statistical analyses provide applicability of the invariance test procedures and LMA to consumer behaviors. The conclusions of mean differences have integrity and validity because they are guided by a sophisticated statistical procedure to ensure measurement invariance.

Presented here is a protocol to examine consumer responses toward mass customization in the context of online retailing. The protocol details the online survey procedure and how to analyze data using structural equation modeling and group differences using latent mean analyses.

Aplicando um programa de personalização eMASS como uma ferramenta de pesquisa para avaliar os benefícios do consumidor

As many scholars and practitioners study personalization and relationship marketing, it is important to provide personalization such as mass customization ...

The Use of Traditional Fear Tests to Evaluate Different Emotional Circuits in Cattle

Animal temperament is complex and has implications for productivity and economic profitability. Quantifying an animal&#39;s response to differing stimuli may facilitate breeding selections and identify animals that are better suited to specific management strategies. Multiple tests have been developed to evaluate cattle temperament (e.g., exit velocity, chute score, pen score, open field test, startle test, bovine zero maze), but each of these tests evaluates the animal&#39;s response to different stimuli (e.g., isolation, novel environment, startle, willingness to enter an enclosed area). Cattle temperament has been observed to be relatively stable over time. However, the evaluation of temperament has the potential to be influenced by current conditions, previous experiences, and observer bias. Many of these temperament tests have been improperly categorized as fear tests and have also been criticized for being subjective. This paper provides a framework for standardizing behavioral tests for cattle and suggests that these different evaluations assess different aspects of the animal&#39;s overall temperament.

Here, we present a protocol to conduct a variety of behavioral tests in cattle that have been designed to evaluate emotions. A battery of behavioral tests (open field test, startle test, bovine zero maze, exit velocity, pen score, and chute score) were conducted to evaluate different components of animal temperament.

O uso de testes tradicionais de medo para avaliar diferentes circuitos emocionais em bovinos

Animal temperament is complex and has implications for productivity and economic profitability. Quantifying an animal&#39;s response to differing stimuli ...

Effects of Surgical Masks on Cardiopulmonary Function in Healthy Subjects

We study the effect of surgical masks on cardiopulmonary function based on a cardiopulmonary exercise test (CPET). This study shows that surgical masks reduce cardiopulmonary exercise capacity and ventilation in healthy young subjects and wearing masks might affect aerobic exercise capacity more in female subjects than in male subjects.