Este protocolo pode responder como vários circuitos no cérebro regulam neurogênese adulta e especificamente como estimular ou inibir circuitos neurais afetam a proliferação de células-tronco neurais adultas. A vantagem dessa técnica é que ela é capaz de atingir especificamente circuitos neurais desejados, bem como reduzir a quantidade de estresse introduzido aos animais. Este método pode fornecer uma visão de como diferentes circuitos cerebrais regulam a neurogênese adulta, em particular, como tipos de células específicas que liberam certos neurotransmissores regulam a proliferação de células-tronco neurais adultas.
Para iniciar este procedimento, coloque as seções teciduais em PBS e monte cinco a oito seções em um slide carregado positivamente em ordem serial de anterior para posterior. Deixe as seções de tecido secarem à temperatura ambiente por dois a cinco minutos e adere completamente aos slides. Em seguida, prepare o tampão de citrato em um recipiente.
Aqueça o tampão de citrato em um forno micro-ondas por cinco minutos até que a solução esteja fervendo. Enquanto isso, coloque as seções montadas em um porta-slides de vidro. Após cinco minutos, coloque cuidadosamente o suporte de slides com as seções em uma caixa de pipeta.
Coloque a potência do forno micro-ondas em 50% e o tempo de cozimento para sete minutos. Inicie um temporizador por sete minutos e monitore a solução. Pare o forno micro-ondas quando a solução começar a ferver, e continue o micro-ondas depois que a ebulição parar.
Pare depois que o temporizador acabar, mesmo que o tempo de cozimento no micro-ondas não tenha terminado. O objetivo desta etapa é manter a água logo abaixo da temperatura de ebulição sem deixar a água ferver excessivamente. Muita ebulição removerá seções de tecido da lâmina.
Em seguida, transfira a caixa quente com tampão citrato e lâminas de tecido para um balde de gelo para resfriamento. Cubra a caixa e espere cerca de 30 minutos ou até que a solução esfrie ao toque, antes de proceder à coloração analógica de timina. Para colorir as seções teciduais com analógico de timmidina, remova as seções teciduais do tampão citrato.
Deixe as seções de tecido secarem e aderirem completamente aos slides, antes de desenhar uma borda com uma caneta hidrofóbica. Em seguida, permeabilize as seções com tampão de permeabilização por 20 a 30 minutos. Lave as seções duas vezes usando TBS-triton por cinco minutos cada vez.
Então, prepare uma solução de reação edu. Incubar as seções na solução de reação edu por 30 minutos a uma hora. Posteriormente, lave-os três vezes em TBS-triton por cinco minutos cada vez.
Cubra os slides em papel alumínio ou coloque-os em uma câmara protegida pela luz para proteger da luz após esta etapa. Nesta fase, verifique se a reação de Edu funciona usando um microscópio fluorescente. As células rotuladas por Edu devem ser observadas se a reação funcionar.
Agora, bloqueie as seções de tecido montado usando tampão de bloqueio levantado no mesmo animal que o anticorpo secundário por 30 minutos a uma hora. Em seguida, lave-os duas vezes em TBS-triton por cinco minutos cada vez. Durante a etapa de bloqueio, prepare a solução primária de anticorpos misturando o anticorpo primário no buffer de bloqueio.
Posteriormente, adicione 250 microliters de solução de anticorpos primários por lâmina para garantir que as seções teciduais estejam completamente submersas, e incuba-as durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, lave as seções teciduais três vezes em TBS-triton por cinco minutos cada para remover o excesso de anticorpo primário. Em seguida, incubar as seções teciduais em anticorpo secundário conjugado por fluorofora preparado em solução tampão de bloqueio por duas horas à temperatura ambiente.
Lave as seções teciduais três vezes em TBS-triton por cinco minutos cada para remover o excesso de anticorpo secundário. Em seguida, aplique a solução DAPI de 300 micromolar em um a 100 em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois, lave as seções teciduais três vezes em PBS por cinco minutos cada para remover o excesso de DAPI e remova o círculo de caneta PAP ao redor do tecido usando um cotonete.
Deixe as seções secarem, antes de aplicar a mídia de montagem e cobri-las com tampas. Usando o software de imagem, abra a imagem de cada seção de giro dento como uma imagem composta com os canais mesclados em cores distintas para visualizar facilmente a colocalização. Em seguida, meça a área de giro dento em cada seção usando a ferramenta de seleção de polígonos e grave todas as seções de cada mouse.
Esta será a área de giro dento usado para calcular a densidade. Usando o contador de células plugins de software encontrado sob Plugins, Analyze, Cell Counter, Cell Counter, regise o número de células no giro dentado que têm colocalizando anticorpo primário e Edu analógico de timina a partir da imagem composta. Além disso, registo o número total de células Edu-positivas e nestin-positivas com um processo radial.
No caso do nestin, é muito importante prestar atenção à morfologia das células. Se quantificar as células-tronco neurais, certifique-se de que apenas células com um processo radial sejam quantificadas. Digite a contagem de células em um software de planilha para compilar todos os dados para análise posteriormente.
Por exemplo, para obter a densidade das células-tronco, divida a soma de células nestin-positivas e edu-positivas pela soma do volume de giro dentado em cada animal. Calcule o volume de cada seção multiplicando a área com incrementos totais de passoS Z, assumindo que cada etapa é um micrômetro. Neste protocolo, as etapas totais devem ser próximas de 40, uma vez que o tecido é seccionado a 40 micrômetros.
Posteriormente, calcule o número total de células proliferadoras, por cento das células-tronco neurais que proliferam e células-tronco totais de proliferação após estimular células de musgo contralateral. Usando um Edu analógico de timmidina e recuperação de antígeno para a coloração de nestin, as células-tronco neurais que proliferam foram rotuladas com sucesso. Além disso, omitindo a etapa de recuperação de antígenos, foram rotulados progenitores neurais e neuroblastos neuroblastos e neurônios imaturos Tbr2 positivos.
Aqui está um exemplo da área quantificada e usada para calcular a densidade celular, e aqui está um exemplo do tecido montado em um slide. Tanto experimentos bem-sucedidos quanto sub-par são mostrados para comparação. Por fim, existem várias quantificações diferentes que podem ser obtidas a partir de um experimento bem sucedido.
As quantificações incluem a densidade de células-tronco neurais proliferando, a porcentagem de células-tronco neurais proliferando, células-tronco totais e o pool total de células-tronco. Após a estimulação contralateral das células musgo, observou-se diminuição da proliferação de células-tronco neurais. O passo mais importante neste procedimento é controlar a ebulição tecidual no forno micro-ondas.
As seções teciduais serão danificadas se estiverem fervendo por muito tempo. Após o acompanhamento deste procedimento, pode-se injetar diferentes vetores virais para atingir o mesmo circuito. Por exemplo, se alguém estivesse estimulando um circuito neural, poderia inibi-lo usando um vírus dreadd inibidor.
As técnicas apresentadas neste protocolo não são novas. No entanto, a força deste protocolo é que ele abrange de forma abrangente todas as etapas necessárias para responder a perguntas sobre como o circuito impacta a neurogênese adulta.
