Agradecemos a Sra. Caroline Robertson para o voice-over e Elena Sra. Pirovano por sua ajuda na produção de vídeo. Este estudo foi financiado pela Universidade de Milano Bicocca &quot;, Fondo di Ateneo 2011&quot;.

1. Como fazer o suporte da sonda (Single Site ou multi-site) <ol><li> Os materiais necessários são de borracha natural, pequenos tubos de plástico e um estilete de metal. O suporte da sonda pode ser personalizado para o tamanho do animal, o número eo tamanho das sondas de laser Doppler, e o território vascular cerebral, que precisa de ser monitorizado. </li><li> Cortar a borracha natural do tamanho necessário (aproximadamente 10 mm x 10 mm para um rato de 300 g). </li><li> Marque a posição da sonda (s) e o bregma na borracha natural, de acordo com as coordenadas estereotáxicas desejados, por oclusão da artéria cerebral média, as coordenadas típico para o núcleo isquémico são esperados no bregma -1 mm, 5 mm lateral à linha média, por um território borderzone periférica isquémica, as coordenadas podem ser esperados no bregma mm +2, 2 mm lateral à linha média. </li><li> Marcar claramente a posição do bregma com um X, isto é o ponto de referência para fixar o suporte da sonda para o crânio. &lt;/ Li&gt; <li> Inserir o estilete para um tubo de plástico (o seu tamanho tem de corresponder ao tamanho da sonda). </li><li> Inserir o estilete na borracha natural, no ponto em que a sonda tem de ser posicionada, empurre o estilete na borracha até que o tubo de plástico ter sido inserida a borracha também. </li><li> Retirar o estilete. </li><li> Se várias sondas são necessárias, repita os passos de 1,5-1,7 para cargos de outra sonda. </li><li> Opcional para várias sondas: enrolar uma fita em torno dos tubos de plástico para assegurar uma melhor estabilização das sondas. </li><li> Opcional: realizar a esterilização química de vários titulares de sonda para futuras utilizações. </li></ol> 2. Preparação pré-cirúrgica <ol><li> MCAO modelo de derrame é geralmente realizada como uma cirurgia de sobrevivência. Neste caso, como mostrado na nossa vídeo (tempo de sobrevivência 24 horas pós-cirurgia), o cirurgião utiliza uma técnica asséptica, com instrumentos esterilizados e suprimentos. </li><li> Anestesiar o rato com isoflurano (inductio 3%n de fase, manutenção 1,5%). </li><li> Coloque o rato em decúbito ventral na mesa de operação. </li><li> Delicadamente raspar a cabeça do rato. </li><li> Aplique uma solução anti-séptica de uma compressa de gaze e desinfectar a pele. </li><li> Administrar de lidocaína a 2%, 5 mg / kg por via subcutânea na região craniana. </li></ol> 3. Posicionamento da sonda e Proteção Durante o crânio intacto <ol><li> Faça uma incisão na pele paramediana direita (para OACM direita) e dissecar o tecido subcutâneo para atingir a fáscia do crânio (gálea aponeurótica). </li><li> Fazer uma incisão paramediana direita na fáscia craniano e executar dissecção romba para atingir o osso do crânio, preparar uma área de osso do crânio que é suficientemente grande para a aplicação do suporte da sonda. </li><li> Atenção: não há necessidade de perfuração ou desgaste ósseo. </li><li> Aplicar merbromin solução para desinfectar e secar a superfície do crânio. </li><li> Usar um secador de cabelo (definido para o ar frio), para acelerar a secagem da superfície do crânio. </li&gt; <li> Neste ponto, as suturas cranianas e da bregma são claramente visíveis. </li><li> Personalize o suporte da sonda, cortando as bordas com tesoura estéril. </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de cola cirúrgica (cianoacrilato, veterinário-aprovado) para a superfície por baixo do suporte da sonda, cuidadosamente, evitando a abertura inferior dos tubos de plástico (note: se uma quantidade significativa de cola permanece entre a superfície óptica da sonda e o crânio, isto pode produzir um sinal de baixa e pode danificar a sonda depois de múltiplas utilizações). </li><li> Aplique o suporte da sonda à superfície do crânio, cuidadosamente correspondente ao bregma, com o marco X. Aplique uma leve pressão no suporte da sonda. </li><li> Usar um secador de cabelo (definido para o ar frio), para acelerar a secagem da cola cirúrgica. </li><li> Fixe o suporte da sonda amarrando um fio cirúrgico em torno do suporte da sonda e da cabeça do animal; ter cuidado para posicionar o fio cirúrgico sobre a mandíbula, evitando a região submandibular e thpescoço e. </li><li> Opcional: encher o tubo de plástico (s) de suporte da sonda com um gel óptico (por exemplo um ultra-som comum ou gel eletrocardiograma), o que irá aumentar a qualidade do sinal de LD. </li><li> Coloque a sonda (s) no suporte da sonda e verificar a leitura do medidor de fluxo real de LD. Utilizar o medidor de fluxo de LD de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Fixe a sonda (s) de amarrá-los em torno da cabeça do animal; ter cuidado para posicionar o fio cirúrgico sobre a mandíbula, evitando a região submandibular e no pescoço. </li></ol> 4. Monitoramento perfusão cerebral durante OACM <ol><li> Coloque o rato em decúbito dorsal, evitando cuidadosamente as forças tracionais na sonda (s) ou suporte da sonda. </li><li> Iniciar o monitoramento de perfusão cerebral durante OACM. </li></ol> 5. Suporte de remoção da sonda (s) e da sonda <ol><li> Corte as suturas em torno do (s) sonda, a sonda de suporte e a cabeça do animal. </li><li> Gentilmente neutralizar dissecar cranianos tecidos moles e pele ao redor da base de borracha natural do suporte da sonda. </li><li> Retire o suporte da sonda. </li><li> Aplicar uma solução anti-séptica para a superfície do crânio. </li><li> Suturar a pele do crânio. </li></ol> 6. Cuidados pós-operatório <ol><li> Administrar 2,5 ml de solução salina por via subcutânea para evitar a desidratação e manter a quente animal usando uma almofada de aquecimento depois de parar a anestesia gasosa. </li><li> Para a cirurgia sobrevivência: proporcionar analgesia preventiva com cetoprofeno 4 mg / kg por via subcutânea, e repetir a mesma dose em 12 horas do pós-operatório </li><li> Sob as nossas condições experimentais, a eutanásia foi realizada às 24 horas pós-cirurgia por inalação de CO2. </li></ol>

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Os fundos para a produção deste vídeo-artigo foi fornecido por Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, Reino Unido), que produz os instrumentos laser Doppler mostrados no nosso estudo experimental. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Atenção Animal da Universidade de Milano Bicocca, de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais de laboratório (DL 116/1992) e da directiva da União Europeia para experiências com animais (2010/63/UE ), sob licença do projeto (n. 219/2011-B) do Ministério da Saúde italiano.

Nós desenvolvemos em casa um sistema simples e de baixo custo para uma fixação segura de uma ou várias sondas twin-fibras (penetração profunda) LD para o crânio intacto de ratos durante o processo de OACM. Embora, aparentemente, um problema trivial, a obtenção de uma fixação de confiança da sonda de LD para o crânio é, na verdade, um problema importante nesta configuração experimental, uma vez que é o pré-requisito para a detecção de sinal suave e um controlo bem sucedido de perfusão cerebral. Procedimentos invasivos, como buracos rebarbas e parafusos de osso, geralmente prolongar o tempo cirúrgico e introduzir mais variáveis ​​experimentais relacionados a craniotomia, e isso pode desencorajar os investigadores e abster-se-os de utilizar monitoramento LD. Por outro lado, a utilização de fibra única (baixa penetração) sondas, que são mais finas e relativamente fácil de ser colada directamente à superfície do crânio, dá baixa qualidade de sinal e não pode ser utilizado de modo fiável com ratos adultos sem perfurar ou desbaste do crânio. Usamos materiais simples e de baixo custo, como a borracha natural, tubos de plástico e um estilete de metal. Um suporte de sonda feito por encomenda pode ser produzido em poucos minutos e adaptada às condições experimentais. Estes suportes de sonda pode acomodar uma ou mais sondas de penetração profunda LD, para o monitoramento local clássico único no núcleo isquêmico ou para vários sites de monitoramento em diferentes territórios arteriais no mesmo hemisfério ou entre os dois hemisférios. Muitos proprietários de sonda pode ser produzida quimicamente esterilizada e armazenado para uso futuro. Veterinário-aprovado cola cirúrgica (cianoacrilato), acelerada por ar frio, é utilizado para fixar o suporte da sonda para a superfície intacta do crânio de ratos, de acordo com as coordenadas desejadas cranianos. Finalmente, a sonda de montagem está ainda fixado no seu lugar por meio de suturas comuns. O tempo total desta sonda LD set-up, depois de dominar esta técnica, é de cerca de 10 min. Como mostrado in Neste vídeo, rotineiramente monitorar a perfusão cerebral na ACM centro território (LD sonda 1: núcleo isquêmico) e no periférico MCA território (LD sonda 2: principalmente uma área de penumbra). No nosso estudo recente mostrou-se que a variabilidade de alterações do fluxo sanguíneo em LD sonda 2 (média de 52% ± 16%, SD, em comparação com a linha de base) é superior em comparação com a sonda 1 LD (média de 31% ± 6% SD, em comparação com o linha de base), e podem ser usados ​​para predizer 4 resultado derrame. Podemos fornecer alguns conselhos de resolução de problemas para os pesquisadores que gostariam de usar nosso sistema desenvolvido internamente. No início da experiência, ter o cuidado de secar muito bem a superfície do crânio (com merbromin e ar frio), antes de fixar o suporte da sonda para evitar o descolamento prematuro. Além disso, certifique-se de aplicar a cola sobre a borracha natural, evitando o contacto com a extremidade aberta do tubo de plástico e a superfície óptica da sonda de LD, para evitar que o sinal fraco, o potencial para a sonda. Quando atar o fio de sutura em volta da cabeça do animal, ter cuidado a fim de evitar a obstrução das vias aéreas (isto é impedido pelo posicionamento do fio de sutura ao longo do osso da mandíbula). Depois de posicionar e fixar as sondas, tome cuidado para não cabos das sondas de tração ao girar o animal em decúbito dorsal para a cirurgia cervical; esta etapa geralmente requer duas pessoas, uma pessoa segurando o animal e uma segunda pessoa segurando os cabos das sondas e gentilmente posicionando-os para a posição desejada. Finalmente, contaminação sanguínea eventual do twin-LD sonda de fibra é de fácil manuseio, seguindo as instruções de limpeza fornecidas pelo fabricante. Nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral, como mostra este vídeo, pode oferecer uma alternativa mais fácil, mais rápido e mais confiável para a sonda de set-up de sistemas que são vendidos atualmente por empresas comerciais nesta área. Além disso, acreditamos que a utilização deste sistema por outros investigadores pode aumentar o pernoy de hemodinâmica cerebral no campo experimental acidente vascular cerebral, que conduzem ao desenvolvimento de uma nova geração de agentes terapêuticos colaterais cerebrais.

Investigação translacional em fatores hemodinâmicos que afetam fisiopatologia AVC e terapia precisa ser implementada, uma vez que esta importante questão é muitas vezes negligenciada por paradoxalmente pesquisas básicas 1. Monitorização da perfusão cerebral é uma ferramenta essencial, mas pouco utilizado, para a modelagem de acidente vascular cerebral isquêmico preciso 2. Além da confirmação da oclusão do vaso arterial e exclusão de hemorragia subaracnóide 3, monitorização da perfusão contínua cerebral pode fornecer informações úteis sobre o grau de consistência e de déficit de perfusão, o estado funcional dos vasos colaterais intracranianos e o efeito hemodinâmico de novas abordagens terapêuticas. Um estudo recente do nosso grupo indicam que a monitorização hemodinâmica multi-site pode ser utilizado para avaliar a circulação colateral intracraniana e pode prever o tamanho do infarto e déficit funcional 4. Estes resultados experimentais são consistent com estudos clínicos, que mostraram que o desempenho funcional da circulação colateral cerebral é preditivo de resultado clínico em pacientes com derrame isquêmico 5, 6. Por esta razão, colaterais cerebrais foram recomendadas como um alvo terapêutico potencial na fase aguda do acidente vascular cerebral isquêmico 7. Laser-Doppler (LD) instrumentos são a ferramenta mais comum usado para medir a perfusão cerebral no AVC isquémico experimental e seu uso é recomendado pelas diretrizes recentes sobre este tema 8. LD instrumentos perfusão microvascular medida num pequeno volume cortical, a profundidade do sinal gravado ser dependente da largura de separação de fibras, com sondas de fibras individuais LD, permitindo uma penetração mais profunda em comparação com sondas de fibra única LD 9. Os valores de fluxo de sangue estão expressos como unidades arbitrárias de perfusão (PU), que indicam a relação, em vez de o fluxo de sangue cerebral absoluto. Calibração de PU é normalmente realizada usinpadrões de motilidade de g, de acordo com as instruções do fabricante. LD fluxometria permite um acompanhamento contínuo e dinâmico e geração de dados quantitativos dentro da mesma sessão. Entre os problemas técnicos que atualmente limitam o uso do LD, uma questão importante é a obtenção de uma ligação segura e prolongada de uma penetração profunda Laser Doppler sonda ao crânio animal. Isto é essencial para a monitorização prolongada e se várias sondas são utilizadas para diferentes territórios arteriais cerebrais, como estamos realizando em nosso laboratório. Em particular, o tempo cirúrgico prolongado é necessário se as sondas estão ligadas ao crânio utilizando orifícios da rebarba ou parafusos cranianos, enquanto sinal fraco e fixação insegura ocorre se as sondas de fibra única (menor penetração) LD estão ligados ao crânio por meio de cola cirúrgica simples. Duplos fibra sondas (penetração de profundidade) LD fornecer um sinal maior e mais consistente, mas eles são maiores do que as sondas de fibra única e não pode ser menosapenso ao crânio utilizando apenas cola cirúrgica. Neste vídeo, mostramos o nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral durante a oclusão da artéria cerebral média por passageiro filamento intraluminal no rato. Descreve-se um método simples para se obter uma eficiente, feito, de baixo custo para titular único ou múltiplo de dupla fibra (penetração profunda) sondas de LD, a ser utilizado para monitorização prolongada da perfusão cerebral intacta sobre o crânio. O procedimento cirúrgico para a MCAO transiente no rato pode ser visto no vídeo, artigo por Uluc e colaboradores 10 e não é mostrado neste vídeo.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler monitor </td><td> Moor Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VP12 sonda </td><td> Moor Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente / Material </td></tr><tr><td> Doccol tamanho de filamentos de silício revestido de 4-0, com diâmetro de 0,39 milímetros de revestimento </td><td> Doccol Corporação </td><td> 403956PK10 </td><td></td></tr><tr><td> Borracha natural, por exemplo, comum chupetas para recém-nascidos </td><td></td><td></td><td> Múltiplofornecedores </td></tr><tr><td> Estilete metálico, por exemplo, a partir da coluna vertebral agulha 18 x 90 mm ​​GA </td><td></td><td></td><td> Vários fornecedores </td></tr><tr><td> Tubos de plástico, por exemplo, da veia definido para infusão GA x 25 20 milímetros </td><td></td><td></td><td> Vários fornecedores </td></tr><tr><td> Não absorvíveis sutura, seda, revestido trançado </td><td></td><td></td><td> Vários fornecedores </td></tr><tr><td> Cola cirúrgica cianoacrilato </td><td></td><td></td><td> Vários fornecedores </td></tr><tr><td> Isoflurano (100% v / v) para utilização veterinária </td><td></td><td></td><td> Vários fornecedores </td></tr></tbody></table>

optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal middle cerebral artery occlusion

O potencial de translação de pesquisa pré-clínica AVC depende da precisão de modelação experimental. Monitorização da perfusão cerebral em modelos animais de acidente vascular cerebral isquémico agudo permite confirmar a oclusão arterial bem sucedido e não incluem hemorragia subaracnóide. Monitorização da perfusão cerebral também pode ser utilizado para estudar a circulação colateral intracraniana, a qual está a emergir como um poderoso determinante de acidente vascular cerebral e resultado de um possível alvo terapêutico. Apesar de um reconhecido papel de monitorização da perfusão Laser Doppler como parte das diretrizes atuais de isquemia cerebral experimental, uma série de dificuldades técnicas existentes que limitam o seu uso generalizado. Uma das questões principais é a obtenção de uma ligação segura e prolongada de uma penetração profunda Laser Doppler sonda ao crânio animal. Neste vídeo, mostramos o nosso sistema otimizado para monitorização da perfusão cerebral durante a oclusão da artéria cerebral média por passageiro filamento intraluminal no rato. Nós desenvolvemos in-casa de um método simples para obter um suporte feito sob encomenda para dupla fibra (penetração profunda) sondas laser Doppler, que permitem multi-site de monitoramento, se necessário. A monitorização contínua e prolongada de perfusão cerebral pode facilmente ser obtida sobre o crânio intactos.

MCAO transiente (60 min) foi induzido através da inserção de um filamento revestido com silicone na artéria carótida externa. O filamento foi então empurrado através da extremidade terminal da artéria carótida interna até à origem da MCA, sob monitorização LD. Artéria carótida comum e artéria pterygopalatin foram transitoriamente ocluído durante a inserção cirúrgica do filamento. Uma representação esquemática do procedimento cirúrgico é mostrado na Figura 1A. As coordenadas craniana para posicionar as duas sondas LD foram escolhidos de acordo com o território subjacente arterial. Experiências preliminares com perfusão de tinta gelatina (Figura 1B) mostrou que o núcleo isquémico é esperado no centro território MCA (bregma -1 mm, 5 mm a partir da linha média; Sonda 1), enquanto que o fluxo colateral é esperado no território borderzone entre o ramos corticais de médio e anterior artérias cerebrais (bregma 2 milímetros, 2 mm da linha média; Probe 2). Hemodinâmica cerebral foi estudada através de vários locais de sondas de laser Doppler durante todo o período do procedimento cirúrgico, isto é, antes, durante e após a MCAO (Figura 2). O déficit de perfusão cerebral durante MCAO foi menor e mostrou um elevado grau de variabilidade na sonda 2 em relação à sonda 1, sugerindo diferenças inter-individuais no desempenho funcional de colaterais intracranianos sob condições isquémicas. O local de multi-Laser Doppler controlo também permite estudar as alterações hemodinâmicas cerebrais durante a oclusão proximal extra-craniana artérias cerebrais (artéria carótida comum, artéria carótida interna, artéria pterygopalatin). Resultado AVC foi avaliada 24 horas após a reperfusão, em volume do enfarte, calculado em 19 secções consecutivas coradas com violeta de Cresyl (Figura 3), e Garcia neuroscore funcional 11. Imunohistoquímica para marcadores específicos associada a lesão cerebral isquémica foi executada, a fim de obter uma distribuição topográfica de perda neuronal (associada a proteína de microtúbulo 2, MAP2) e penumbra isquémica (heat shock protein-70, Hsp70) em relação ao controlo multi-local hemodinâmica da circulação intracraniana (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig1highres.jpg"/> Figura 1. Monitorização da perfusão cerebral durante OACM intraluminal no rato. A. Representação esquemática do procedimento cirúrgico para a MCAO transiente. Um filamento revestido com silicone foi utilizado para ocluir a origem da MCA, após ter sido introduzido na artéria carótida externa e empurrado através da artéria carótida interna. Proximais artérias cervicais foram ou ligado (artéria carótida externa) ou transitoriamente ocluído (artéria pterygopalatin e da artéria carótida comum) durante o procedimento. B. O cérebro de um representante é mostrado depois de gelatina de tinta de coloração. Perfusão transcardíaca de gelatina-tinta solução foi realizada 60 minutos após o início da isquemia, sem reperfusão. O cérebro normalmente perfundido estava manchada pela tinta de gelatina e apareceu como de cor cinza com preto vasos manchados, enquanto a área isquêmica (não-irrigado) permaneceu imaculada (cor de rosa). Coordenadas cranianos para posicionar as duas sondas de LD são mostrados. Sonda 1 = mm -1 partir bregma, 5 mm a partir da linha média; Probe 2 = +2 mm do bregma, a 2 mm da linha média. <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig2highres.jpg"/> Figura 2. Cerebrais gravações hemodinâmicos usando multi-site sondas laser Doppler. Um padrão hemodinâmico típico que sugere funcionalmente ativos colaterais intracranianas em condições isquêmicas é mostrado. Neste animal, traçados LD mostrou um pequenoer déficit de perfusão em apuração de canal 2, em comparação com a sonda 1 canal, tanto durante CCA oclusão e oclusão MCA. MCA-O = meio oclusão da artéria cerebral. CCA-O = oclusão da artéria carótida comum. Perfusão PU = unidades. <img src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50214/50214fig3highres.jpg"/> Figura 3. Secções de cérebro representativos para o cálculo do volume de enfarte histológicas secções coronais (50 um; n = 19 com 250 intervalo de im; milímetros bregma 2,5 milímetros a -3,0). São fixados em paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de Cresyl 0,1%. Volume de infarto é calculada usando ImageJ software de processamento de imagem, corrigida para assimetrias inter-hemisféricas, devido ao edema cerebral, e expresso em mm 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50214/50214fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50214/50214fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figura 4&quot; fo: conteúdo largura = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50214/50214fig4highres.jpg&quot; /&gt; Figura 4. A imunocoloração de marcadores moleculares de perda neuronal e penumbra representativos secções cerebrais consecutivas são mostrados, os quais foram corados com violeta de Cresyl 0,1% (A) ou imunocoradas com marcadores de perda neuronal associada a proteína do microtúbulo (2, MAP2, B). E penumbra isquémica (calor proteína de choque-70, Hsp70, C).

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Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Monitorização da perfusão cerebral foi demonstrada para melhorar a precisão em modelos de isquemia AVC. Dificuldades técnicas, muitas vezes limitam o uso desta ferramenta essencial para a pesquisa vascular cerebral. Neste vídeo, um sistema optimizado é mostrado para obter um controlo único ou multi-local hemodinâmicas durante a oclusão da artéria cerebral média intraluminal em ratos.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Vídeo: Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Medicina

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Oclusão bilateral artéria carótida comum como um estímulo pré-condicionamento adequados para induzir a tolerância isquêmica início da Isquemia Cerebral Focal

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando uma janela craniana para Visualizar a artéria cerebral média Durante endotelina 1 Induzida por oclusão da artéria cerebral média

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Embolic artéria cerebral média Oclusão (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com homólogos Coágulos de sangue em ratos

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...