J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

NOTA: Todas as etapas deste protocolo foram aprovados pela UT MD Anderson Cancer Center. 1. Produção de mTERT-ER Alelo <ol><li> Introduzem knock-in contendo o vector de direccionamento ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) a montante e na grelha com a sequência genómica mTERT (exão 1 através intrão 2) e um Lox - pgk - Neo - Lox fragmento (Figura 1A) em células ES de ratinho com electroporação. </li><li> Cultura as células ES em neomicina para 6-10 dias. Escolha clones resistentes à neomicina e expandir em placas de 48 poços. Extrair o DNA genômico utilizando um kit comercial e confirmar a knock-in alelo por Southern Blot. </li><li> Injectar duas linhas ES com mais de 95% cariótipo normal em C57BL / 6 blastocistos com um kit de micromanipulação sob um microscópio invertido. Implantar os blastocistos para o útero de mães de aluguel 23. Acoplar as quimeras masculinas de alto grau (70-90%) a C57BL / 6 femachos. </li><li> Confirme a genotipagem dos animais heterozigotos mTERT-ERneo por Southern Blot. </li><li> Companheiro os heterozigotos animais mTERT-ERneo e animais EIIa-Cre para excluir a cassete NeoR. Companheiro os animais heterozigotos para C57BL / 6 animais por pelo menos três vezes, e outras inter-raciais heterozigotos animais mTERT-ER para gerar homozygosity. </li></ol> 2. Geração de LSL-mTERT Alelo <ol><li> Introduzir o knock-in segmentação vector contendo um LoxP - Stopper triplo - Neo - fragmento LoxP ea seqüência genômica mTERT (entre exão 1 e intron 2, Figura 1B) em ratos com células ES eletroporação 23. </li><li> Cultura as células ES em neomicina para 6-10 dias. Escolha clones resistentes à neomicina e expandir em placas de 48 poços. Extrair o DNA genômico utilizando um kit comercial e confirmar a knock-in alelo por Southern Blot 23. </li><li> Inject dois ES linhas com mais de 95% cariótipo normal em camundongos C57BL / 6 blastocistos com um kit de micromanipulação sob um microscópio invertido. Implantar os blastocistos para o útero de mães de aluguel 23. Acoplar as quimeras masculinas de alto grau (70-90%) a C57BL / 6 fêmeas. </li><li> Confirme a genotipagem dos animais heterozigotos LSL-mTERT por Southern Blot. </li><li> Companheiro os animais heterozigotos para C57BL / 6 animais por pelo menos três vezes, e ainda mais inter-raciais heterozigotos animais LSL-mTERT para gerar homozygosity. </li></ol> 3. A reativação da telomerase em mTERT-ER e LSL-mTERT Mice In Vivo Para mTERT-ER <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes da injeção. </li><li> Anestesiar os ratos com isoflurano câmara (4% para indução e 2% para manutenção) em 50% (v / v) de oxigénio / 50% (v / v) de mistura de gás de monóxido de diazoto. Ou anestesiar ratos por uma mistura de cetamina-xilazina (100 mg / kg de peso corporal + 10 mg / kg de peso corporal). </li><li> Após a anestesia profunda for atingido, o animal anestesiado e remover a partir da câmara de indução, e manter a sua cabeça dentro do tubo ligado à câmara de isoflurano (2%). </li><li> Aperte os pés dos ratos para assegurar que o animal está profundamente anestesiados. Coloque pomada em ambos os olhos, a fim de evitar que os olhos sequem. Seque a parte traseira dos ratos com uma solução de povidona-iodo. </li><li> Injectar o pellet de libertação lenta 4-OHT trocarte com precisão (10 L), sob a pele das costas e empurrar o sedimento todo o caminho para a linha média entre dois ombros. </li><li> Selar a incisão com ferida aplicador de clipe e monitorar os ratos para recuperação da anestesia. Retire os clips 10 dias mais tarde. Calor suplementar não é necessário porque o procedimento esteja concluído em breve. </li><li> Período de tratamento com 4-OHT sedimento deve ser optimizado de acordo com o objectivo do estudo. </li></ol> Para LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> O tamoxifeno (10 mg / ml, dissolvida em óleo de milho) é injectado intraperitonealmente dois dias consecutivos (200 ul / 25 g / dia). </li></ol> 4. Isolamento de células-tronco neurais e reativação da telomerase In Vitro <ol><li> Os ratinhos são sacrificados com dióxido de carbono e os cérebros são removidos. Siga o protocolo de produtos comercialmente disponíveis kit dissociação tecido neural como por fabricante. </li><li> Ressuspender o pó liofilizado no frasco rotulado Solução 4 com 1 ml de meio de cultura celular para a Solução 4. Não vórtice. Esta solução deve então ser dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C para uso posterior. </li><li> Pré-aqueça a mistura a 37 ° C durante 15 min antes da utilização. </li><li> Adicione Enzyme Mix 1: Solução 1 (50 mL) e solução 2 (1.900 mL). Adicione Enzyme Mix 2: Solução 3 (20 ul) e solução de 4 (10 ul). </li><li> Preparar a mistura de enzima 1.950 ul para 1 até 400 mg de tecido e vortex. Pré-aquecer a mistura a 37 ° C durante15 min antes de usar. </li><li> Retire o mouse cérebros de 1 dia, e manter os prosencï¿½alos retirando os bulbos olfatórios e cerebelo. Mantenha os tecidos do cérebro anterior em 1 ml de meio de cultura frio desde remoção e armazenar em 4 ° C. Certifique-se para processar o tecido neural dentro de 1 hora. </li><li> Determinar o peso do tecido para garantir que o limite de 400 mg por digestão não seja excedida. Inserir o cérebro na tampa de 35 mm de diâmetro numa caixa de Petri, e esmagar o cérebro usando um bisturi. </li><li> Usando uma ponteira 1 ml, adicionar 1 ml de HBSS (w / o Ca / Mg) e peças de pipeta de volta em um tubo de 15 ml. Enxágüe com HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifuga-se a 300 x g durante 2 minutos à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Adicionar 1950 mL de mistura de enzimas pré-aquecida (1 Soluções 1 e 2) por cima de 400 mg de tecido. Incubar no tubo de 15 mL durante 15 min a 37 ° C, misturando por inversão ou agitação do tubo a cada 5 min. </li><li> Prepare mistura de enzimas 30 ul 2 por amostra de tecido, adicionando 20 &amp; #956; l de solução de 3 e 10 ul de solução de 4. Em seguida, adicionar a amostra. Inverta suavemente para misturar. Não vortex. </li><li> Dissociar o tecido usando mecanicamente uma ampla de ponta, fogo-polido Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo 10 vezes lentamente. Evite a formação de bolhas de ar. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 10 min, invertendo o tubo a cada 3 min. </li><li> Repita o passo 4.11 e 4.12 passo se os tecidos são maiores do que 200 mg. </li><li> Aplicar a suspensão de células para um filtro de células de 70 mm, colocada sobre um tubo de 50 ml. Aplicar 10 ml de PBS através de filtro de células. Descartar filtro de células de suspensão de células e centrifugação a 300 g durante 20 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender as células com meio de células estaminais para o volume necessário para outras aplicações. </li><li> Para activar a telomerase em LSL-mTERT NSC, tratar as células com 100 | iM de 4-OHT para dois dias. Para ativar a telomerase em mTERT-er NSC, manter as células em meio de cultura com 100 M 4-OHT. </li></ol> 5. Telomere FISH <ol><li> Prepare os cromossomas metafásicos a partir de células cultivadas. </li><li> Para FFPE (fixados em formalina e embebidos em parafina) secções de tecido, Desparafinar em xileno e re-hidratados em série de etanol durante 5 minutos cada (100%, 90%, 70%, etanol a 50%) e PBS durante 5 min. </li><li> Pós-correcção em metanol: ácido acético (3: 1) durante 1-2 horas. Desidratar em série de etanol frio durante 5 minutos cada (70%, 90%, etanol a 100%) e ar seco. Lavar em 1x PBS a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Desnaturar cromossomas em formaldeído a 4% a 37 ° C durante 2 min. Desidratar em série de etanol frio 5 min cada (70%, 90%, etanol a 100%) e ar seco. </li><li> Aplicar 12 a 25 ul da mistura de hibridação de PNA para cada lâmina. (Mistura de hibridação: 70% de formamida, 0.06x SSC, 0,2% de BSA, 0,5 ng / uL de ARNt, 0,5 ng / mL ou a telómeros sondas de centrómero) </li><li> Selar a lamela com cimento de borracha. Preparações cromossômicas Post-desnaturar e cortes de tecidos a 80 ° C para 4 min. A hibridização à temperatura ambiente ou a 37 ° C por 2-4 horas em câmara úmida. </li><li> Lavar à temperatura ambiente com tampão de lavagem 2 x 15 min. (Tampão de lavagem: 70% de formamida, SSC 0.06x, pH 7,2). Lave à temperatura ambiente 3 x 5 min com PBST. Lâminas Counter-mancha com DAPI ou fluorescência vermelha distante para exame microscópico. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aqui, nós relatamos a geração de dois alelos telomerase murina induzidos e como reativar telomerase in vivo e in vitro. O passo fundamental para a reativação atividade mTERT-ER é manter uma concentração contínua do tamoxifeno, por isso optamos por usar 4-ESB peletes de libertação tempo fabricados pela Innovative Research of America. Os peletes manter libertando 4OHT a um nível de sangue no estado estacionário de 1 ng / ml para 60 dias. Em um estudo anterior, mostramos que a reativar a atividade da telomerase com esta estratégia foi capaz de melhorar os fenótipos degenerativas, como o esgotamento de células-tronco, insuficiência de respostas de lesão tecidual e falência de órgãos em vários órgãos que foram induzidos por disfunção dos telômeros em G4 mTERT ER / ER camundongos 20. Para além de se estudar a função de telomerase em envelhecimento, estes dois alelos de telomerase indutíveis também pode ser utilizado para estudar o cancro. Estudos anteriores levouvantagem desses alelos para explorar o papel de atrito dos telômeros e telomerase reativação na formação dos genomas e impactando a biologia do linfoma de células T do timo 21 e câncer de próstata 22. Estes dois estudos mostraram que a disfunção dos telômeros no final de geração G4 ATM - / - mTERT ER / ER e G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L camundongos fornece um mecanismo alimentando a captação de eventos mutagênicos antecipada para iniciação do tumor, mas impedindo a progressão de tumores completamente malignos. Quando a telomerase foi reactivado no contexto da instabilidade genómica induzidas por disfunção telomérica, checkpoints de dano de ADN e instabilidade cromossómica galopante foram suprimidos, permitindo o avanço completo de tumores malignos com novas propriedades biológicas tais como metástases ósseas do cancro da próstata e 21 infiltração cérebro de thymilinfoma c 21. Fenômenos semelhantes também foram observados em outros tipos de câncer, incluindo câncer de cólon e câncer de pâncreas (comunicações pessoais com Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin e Ronald DePinho). Porque a proteína TERT-ER pode ser facilmente ligada entre estados ligado e desligado, dependendo se os animais são tratados com tamoxifeno ou veículo, os modelos de tumor gerados pelo alelo mTERT-ER podem ser utilizados para testar a terapia anti-telomerase. Em estudo anterior, os tumores gerados no G4 ATM - / - mTERT ER animais / ER foram liberados de 4-OHT; no consumo de telomerase, os tumores eventualmente encolheu devido à reintegração do telômero induzida por disfunção checkpoints 21. No entanto, alguns dos tumores adquiriram resistência em resposta a telomerase extinção por activação de um alongamento de telómeros Alternativa (ALT) do mecanismo. Além disso caracterização destes tumores ALT + resistentes mostrou que they têm transcrição aberrante de genes envolvidos na biologia mitocondrial e defesa oxidativo incluindo um regulador mestre da síntese mitocondrial e oxidativa defesa PGC-1β. Knockdown de PGC-1β ou SOD2 (outro regulador de defesa oxidativo) elimina significativamente as células tumorais ALT + enquanto manter as células tumorais de telomerase + permanecem relativamente intacta 21. Uma limitação dessas dois alelos knock-in é que eles só podem proporcionar reactivação da telomerase ao nível endógeno porque eles são no locus nativo do gene da telomerase. Na maior parte dos cancros humanos, a telomerase é realmente sobre-expresso a um nível muito mais elevado. A fim de aumentar o nível de telomerase, uma modificação que pode considerar é inserir a construção mTERT-ER com um promotor mais forte, tal como PGK (fosfoglicerato quinase), promotor em Rosa26 local. Em conclusão, estes dois novos alelos indutíveis telomerase murino fornecer genet sem precedentesic ferramentas para estudar as funções de telomerase no envelhecimento e na homeostase dos tecidos, bem como a progressão do tumor, em especial sob o fundo do telómero instabilidade genómica induzidas por disfunção pré-adquirido. O alelo mTERT-ER também pode ser utilizado para estudar a terapia anti-telomerase, atravessando em outros modelos de tumor de rato propenso.

A telomerase é uma enzima responsável pela manutenção de telómeros. Estes são seqüências repetitivas nas extremidades dos cromossomos que protegem a sua integridade. Os componentes principais são holoenzima telomerase de uma subunidade catalítica da transcriptase reversa (TERT) e uma sub-unidade de RNA (TERC) que serve como molde para a adição do telomérica repete 1,2. Embora geralmente reprimida nas células somáticas diferenciadas, a telomerase exibe atividade robusta e desempenha papéis importantes em células germinativas, as células cancerígenas e as células-tronco. mTERC e mTERT ratinhos knockout fornecer grande em sistemas de modelos in vivo para estudar as funções de telomerase em ambas as células estaminais e cancro. O mTERC e mTERT camundongos knockout (G1) não apresentaram fenótipos óbvias devido ao longo reserva dos telômeros em camundongos 3. No entanto, em série intercruzamento mTERC e mTERT camundongos knockout para geração tarde (G5-G6) resultou emerosão progressiva dos telômeros e, eventualmente provocado degeneração grave de tecidos altamente proliferativas 4. Geração tardia (G5-G6) mTERC - / - ratos são inférteis devido às altas taxas de apoptose em depleção de células do testículo e germe. G5-G6 mTERC - / - ratos também apresentam fenótipos degenerativas nos tecidos altamente proliferativas incluindo medula óssea, intestino e pele, devido às altas taxas de apoptose e capacidade de auto-renovação com defeito na haste de tecido / progenitoras compartimentos celulares 4. As células estaminais hematopoiéticas da medula óssea de tarde geração mTERC - / - ratos de perda de exposição de potencial proliferativo, comprometida capacidade de auto-renovação, reforçada apoptose e, eventualmente, de exaustão funcional 5,6. Da mesma forma, o aumento progressivo dos corpos apoptóticos em criptas intestinais foram observadas em cada geração sucessiva de G1-G6 mTERC - / - ratos 7,8. Tele efeito deletério dos telómeros disfuncionais não parece estar limitada a tecidos de rotatividade desde que tanto a proliferação de células estaminais neuronais adultas in vitro e in vivo a neurogénese foram gravemente prejudicadas na geração final (G4-G5) mTERC - / - murganhos 9 . O papel da telomerase em células-tronco é ainda apoiada pelos achados em um ser humano desordem genética disceratose congênita rara (DKC), que em alguns aspectos se assemelha envelhecimento prematuro 10,11. DKC é causada por mutações em TERC, TERC, e os genes que codificam disquerina, uma subunidade da telomerase núcleo, e outras proteínas associadas 12 disquerina. Em média, os telômeros em pacientes DKC são mais curtos do que 99% dos controles pareados por idade. A maior morbidade da doença é devido a anemia aplástica, o que é causado pela manutenção deficiente de células-tronco hematopoiéticas. Outros aspectos da doença, tais como leucoplasia oral, distrofia ungueal, retardati mentaison, testículos atrofia e complicações pulmonares, tudo sugere funções das células-tronco de tecidos e células progenitoras 10, achados em concordância com aqueles prejudicada em geração tarde de camundongos knockout telomerase. Pacientes DKC são propensos a síndrome mielodisplásica e têm uma maior prevalência de neoplasias malignas da mucosa. Assim, a deficiência de telomerase em pacientes humanos recapitula os defeitos de funções das células-tronco e predisposição tumor que são observados em camundongos knockout telomerase tarde geração. Telômeros curtos e alta atividade de telomerase são características do câncer. Como as células normais ou pré-malignas dividir, a atividade da telomerase resultados baixos ou ausentes na eventual erosão dos telômeros e ativação de postos de controle celulares semelhantes aos provocados por ADN-breaks de cadeia dupla (DSBs) 13. Como LAP clássicos, disfunção dos telómeros foi mostrado para induzir a p53 associada e respostas celulares, tais como a senescência e / ou apoptosis 14,15. Após a inativação mutacional de p53, ciclo celular e na sobrevivência das células são reforçadas em células com disfunção dos telômeros, o que fornece um mecanismo mutadora pró-cancerígena caracterizada por translocações e amplificações regionais e supressões 16,17. Ao mesmo tempo, continuou disfunção telomérica e instabilidade cromossómica associada galopante (mesmo em células p53 nulos) parecem restringir completo progressão maligna de tais cancros. Por exemplo, no final geração G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - ratos mostraram incidência do linfoma significativamente reduzido em comparação com Ink4a / Arf camundongos nula devido ao atrito dos telômeros. Em outro estudo, as lesões adenomatosos mais avançadas no G4 mTERT - / - mínimo de camundongos APC foram fortemente reprimidos em comparação com APC min camundongos devido à paragem do crescimento significativo e apoptose 18,19. Oobservação de que telómero disfunção induzida por instabilidade genómica inibe a progressão do tumor solicita a especulação de que a activação da telomerase pode permitir a progressão maligna, em parte, por reprimir a instabilidade do genoma para um nível compatível com a viabilidade das células do cancro e / ou de neutralização dependente de p53 ou mecanismos independentes do checkpoint. A fim de estudar se telomerase reativação pode parar ou mesmo reverter o envelhecimento das células-tronco, e se telomerase reativação pode promover a tumorigenesis contra o pano de fundo de instabilidade genômica, geramos dois induzï¿½eis alelos telomerase murino. O primeiro é de 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) (mTERT-ER) fusão terc-Receptor de Estrógeno -inducible knock-in alelo. Na ausência de 4-OHT, os ratinhos homozigóticos para mTERT-ER (ER designado mTERT / ER) são deficientes em actividade de telomerase e sustentar mesmos fenótipos celulares e citogenética convencional ou como mTERT mModelo knockout TERC. Após 4-OHT tratamento, a atividade da proteína TERT-ER pode ser restaurado para níveis comparáveis ​​à proteína TERT nativo 20, 21. O segundo alelo é um romance TERT inducible knock-in alelo contendo uma cassete LoxP-Stopper-LoxP intronic (LSL- mTERT); após excisão de LSL Cre-mediada, mTERT é re-expressos sob mecanismos de controle de expressão endógena 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Perda da integridade do genoma e sua sinalização de danos ao DNA associados e respostas checkpoint Telomere disfunção induzida são drivers bem estabelecidas que causam a degeneração do tecido durante o envelhecimento. Câncer, com taxas de incidência aumenta muito com a idade, é caracterizada por comprimentos dos telômeros curtos e alta atividade de telomerase. Para estudar os papéis de disfunção dos telômeros e telomerase reativação no envelhecimento e câncer, o protocolo mostra como gerar dois murino telomerase inducible knock-in alelos 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) -inducible terc-Receptor de Estrógeno (mTERT-ER) e Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). O protocolo descreve os procedimentos para induzir disfunção dos telômeros e reativar a atividade da telomerase em camundongos mTERT-ER e LSL-mTERT in vivo. Os dados representativos mostram que a reactivação da actividade da telomerase pode melhorar os fenótipos degenerativas do tecido induzidas por disfunção telomérica. Em order para determinar o impacto de reactivação da telomerase na tumorigénese, geramos modelo de tumor de próstata G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L-LSL mTERT L / L e modelo de linfoma de células T do timo G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Os dados representativos mostram que a reativação da telomerase no cenário de instabilidade genômica induzida pela disfunção dos telômeros pode aumentar consideravelmente tumorigenesis. O protocolo também descreve os procedimentos utilizados para isolar células estaminais neurais (NSCs) a partir de ratinhos mTERT-ER e LSV-mTERT e reactivar a actividade de telomerase in vitro em NSC. Os dados representativos mostram que a reactivação da telomerase pode aumentar a capacidade de auto-renovação e neurogenesis in vitro. Finalmente, o protocolo descreve os procedimentos para a realização dos telômeros FISH (Fluorescence Hibridização In Situ) em ambos FFPE rato (fixados em formalina e Paraffin embutidos) tecidos cerebrais e cromossomos metafásicos de células em cultura.

As estratégias para gerar murino mTERT-ER e LSL-mTERT knock-in alelos foram descritos na Figura 1A e 1B. Especificamente, um LoxP - Stopper triplo - Neo - fragmento LoxP foi inserido entre exão 1 e exão 2 de mTERT lócus para gerar alelo LSL-mTERT. Para gerar alelo mTERT-ER, domínio ERT2-LBD em grelha com o gene mTERT foi inserida no terminal N do exão 1. Nós mostramos que quando a telomerase foi transitoriamente reactivada em ratinhos disfunção dos telómeros, tratando-as com peletes de 4-OHT para 4 semanas, o fenótipo degenerativa poderia ser melhorado em vários órgãos, tais como tumores do cérebro (Figura 2A) e testículos (Figura 2B). A fim de determinar o impacto de reactivação da telomerase em células cultivadas in vitro, nós isolados de células estaminais neurais (NSCs) entre o final de geração G4 LSL-mTERT e G4 mTERTCamundongos -er. Mostrámos que, quando da telomerase foi reactivada em telómeros NSC disfuncionais, a capacidade de auto-renovação de NSC foi grandemente aumentada (Figura 3A), e em neurogenesis in vitro foi também significativamente melhorada (Figura 3B). De modo a determinar o impacto da telomerase reactivação em tumorigénese no contexto da disfunção telomérica, geramos PB-Cre4 Pten L / L-mTERT LSL / L (modelo de tumor de próstata) / L L L p53 e ATM - / - mTERT ER / ER (modelo de linfoma de células T do timo) coortes tarde geração. Quando a telomerase foi reactivada por tratamento com tamoxifeno nestes ratos com injecção (Figura 4A) ou peletes de 4-OHT, durante 8 semanas (Figura 4B), a tumorigénese foi grandemente melhorada em ambos modelo de tumor da próstata (Figura 4A) e modelo de linfoma de células T do timo ( <strong&gt; Figura 4B). Por fim, informamos os protocolos de realização dos telômeros FISH em tecidos cerebrais FFPE mouse (Figura 5) e cromossomos metafásicos (Figura 5, embutidas). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mTERT-ER knock-in estratégia. TV, visando vector; WT, alelo tipo selvagem; KI, knock-in alelo; LA, braço esquerdo; RA, braço direito; E1, o exão 1; E2, exão 2; neo, promotor PGK-driven gene resistente à neomicina; ER, domínio de ligação ao receptor de estrogénio modificado (ERT2) ligando; DT, dyphteria gene da toxina. (B) LSL-mTERT estratégia knock-in. TV, visando vector; WT, alelo tipo selvagem; KI, knock-in alelo; LA, braço esquerdo; RA, braço direito; E1, o exão 1; E2, exão 2; neo, promotor PGK-driven gene resistente à neomicina; ROLHA, três sequências de terminação da transcrição repetitivas; DT, dyphteria gene da toxina. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figura 2: Os dados representativos mostram que a telomerase reactivação melhora fenótipos degenerativas de órgãos Imagens representativas de cérebros (esquerda). e testículos (direito) de ratos G0 e G4 mTERT-ER tratados com placebo ou 4-OHT, durante 4 semanas. As barras de escala indicam 50 um. Re-print com a permissão de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figura 3:. Os dados representativos mostram que a telomerase reactivação aumenta a auto-renovação e neurogénese de células estaminais neurais in vitro (A) Imagens representativas de células estaminais neuraiss isolados a partir de G4-LSL mTERT (painel superior) e G4 mTERT-ER (painel inferior) em crescimento em meio para mastócitos tratados com veículo ou 4-OHT. (B) Imagens representativas de neurogenesis in vitro (Tuj1 +) de células estaminais neurais isoladas de G4 mTERT ER-cultivadas em meio de diferenciação (com 1% de FBS) tratado com veículo ou 4-OHT. As barras de escala indicam 100 um. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figura 4:. Os dados representativos para mostrar telomerase reativação aumenta tumorigenesis contra o pano de fundo de instabilidade genômica (A) Imagens representativas de tumores de próstata dissecados de G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 Pten L / L p53 L / L-LSL mTERT- / -, E G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L-LSL mTERT L / L tratados com tamoxifeno. Re-imprimir com a permissão de 22. (B) Imagens representativas de linfomas de células T do timo dissecados a partir G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER tratados com veículo, e G4 Atm - / - mTERT ER / ER tratada com 4- OHT durante 8 semanas. As barras de escala indicam 1 cm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figura 5: Imagens representativas de telomeric e FISH centromeric no tecido cerebral FFPE mouse e metaphase (no detalhe). O vermelho indica DNA, verde indica coloração dos telômeros, e ciano indica cecoloração ntromere. Barras de escala indicam um milímetro.

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Utilizando Murino Inducible telomerase alelos nos Estudos de degeneração / regeneração tecidual e Câncer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K visualizações.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Medicina

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Um modelo ortotópico de câncer de bexiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Dormência Modelo de câncer de mama estrogênio-sensíveis na medula óssea: Uma Ferramenta para Estudos Moleculares Mecanismo e Hipótese Geração

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analisando Efeitos benéficos de suplementos nutricionais sobre as funções intestinais epitelial de barreira Durante Experimental Colite

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...