Fosfato inositol e fosfoinositos são metabólitos que têm várias funções regulatórias em eucariotes, incluindo o controle da expressão genética, tráfico de proteínas, transdução de sinais e desenvolvimento celular. Eles executam essas funções regulatórias ligando-se às proteínas, alterando assim a conformação proteica, atividade catalítica ou interações proteicas. A identificação de proteínas que se ligam ao fosfato inositol ou fosfoinositos é essencial para entender como esses metabólitos desempenham sua função regulatória.
Este protocolo tem um fluxo de trabalho simples que é sensível, não radioativo, livre de lyposome e usa reagentes que estão disponíveis comercialmente. Neste método, uma cromatografia finalizada com fosfato inositol biotinilado ou fosfoinositos, é usada para isolar proteínas interativas, elas são então identificadas por mancha ocidental, ou espectrometria de massa. Para formas de corrente sanguínea, cresça células T.brucei até a fase de registro médio em mídia HMI-9, complementada com 10% FBS, a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono.
Mantenha a densidade celular entre 800.000 e 1,6 milhões de células por mililitro. Quando estiver pronto, centrifufique as células a 1600 vezes G, e à temperatura ambiente por 10 minutos. Descarte o supernasciente e resuspenja suavemente a pelota em 10 mililitros de PBS-G pré-aquecido a 37 graus Celsius para lavar as células.
Centrifugar as células a 1600 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos para completar a lavagem. Repita este procedimento de lavagem mais duas vezes. Em seguida, resuspend a pelota em um mililitro de PBS-G.
Transfira esta suspensão para um tubo de um ponto cinco mililitros, depois centrífuga a 1600 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernasciente, e resuspenque a pelota em zero ponto cinco mililitros de tampão de lise, complementados com um coquetel inibidor de protease de cinco pontos X, e um coquetel inibidor de fosfatase X que foi pré-refrigerado no gelo para lise as células. Centrifugar o lysate a 1400 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos.
Depois disso, colete o supernascido, que contém as proteínas parasitas extraídas, em um novo tubo de um ponto cinco mililitro para os ensaios de ligação. Reserve 5% do total de lise para análise de manchas ocidentais. Colete 50 microlitadores de fosfatos inositol ou fosfoinositos conjugados a contas de agarose, e adicione-os 500 mililitros de tampão de ligação.
Centrifugar a 1000 vezes G por um minuto. Descarte o supernasciente e resuspenque em 50 microliters de tampão de ligação para equilibrar as contas. Use contas não conjugadas como controle e use contas com diferentes configurações de fosfato, incluindo formas não fosfoiladas, para controlar interações inespecíficas.
Em seguida, adicione 50 microliters de contas IP ou PI ao liseto celular ou às proteínas purificadas. Mantenha o volume de contas dentro de 10% do total de lysate. Se necessário, use o tampão de ligação para ajustar o volume da reação de ligação.
Incubar a reação por uma hora ou durante a noite a quatro graus Celsius, enquanto gira a 50rpm. Depois disso, centrifugar a mistura a 1000 vezes G, e a quatro graus Celsius por um minuto. Remova o supernasciente e mantenha a pelota, certificando-se de manter 5% do supernaente para análise de manchas ocidentais.
Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem e toque ou gire o tubo para resuspensar a resina. Centrifugar a reação a 1000 vezes G, e a quatro graus Celsius por um minuto, e descartar o supernatante. Repita este processo para um total de cinco lavagens.
Depois disso, adicione 50 microliters de tampão 2X Laemmli suplementados com 710 milimonas de 2 mercaptoetanol às contas. Toque ou vórtice para misturar e dilua as proteínas. Em seguida, aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos, e centrífuga a 10.000 vezes G por um minuto.
Colete o supernante, e congele o elunato a menos 80 graus Celsius, ou prossiga para a análise da mancha ocidental. O método aqui apresentado é usado para analisar a vinculação de PIs pela proteína repressora-ativadora 1 de T.brucei lysate, ou pela proteína repressora recombinante T.brucei 1 protein 1. Como o RAP1 carece de domínios canônicos de ligação pi, os ensaios de vinculação são realizados com PIs que não são fosforiladas, ou que são fosforiladas em diferentes posições do anel inositol, e com contas agarose não conjugadas.
A análise ocidental mostra que o RAP1 se liga preferencialmente às contas PI(3, 4, 5)P3, mas que também se liga em menor grau às contas PI(4, 5)P2. No entanto, não se vinculou a nenhum outro PIs ou contas de ágarose. Para testar se o RAP1 se liga diretamente aos IEs, uma proteína RAP1 recombinante 6XHis marcada terminalmente é expressa e purificada à homogeneidade da E.Coli.
A mancha ocidental mostra que o aumento da concentração de PI(3, 4, 5)P3, mas não PI(4, 5)P2, inibe a interação do RAP1 recombinante com pi(3, 4, 5)P3 contas. A adição de T.brucei purificada enzima PIP5Pase à reação restaurou pi(3, 4, 5)P3 vinculação por RAP1 recombinante. Isso se deve à desfosforilação PIP5Pase de PI livre(3, 4, 5)P3, e assim indica que o padrão de fosforilação deste metabólito é essencial para a nossa ligação RAP1.
As proteínas T.brucei que se ligam ao Ins(1, 4, 5)P3 são então identificadas pela cromatografia de afinidade seguida de espectrometria de massa. A análise SDS-PAGE mostra enriquecimento em proteínas elucidadas a partir de contas ins(1, 4, 5)P3, em comparação com proteínas elucidadas a partir das contas de controle agarose. A análise da espectrometria em massa das proteínas elucidas identificou mais de 250 proteínas das quais 84 foram enriquecidas com contas ins(1, 4, 5)P3, em comparação com contas de controle.
O enriquecimento de proteínas vinculadas ao Ins(1, 4, 5)P3, em comparação com as contas de controle, correlaciona-se com o sinal de proteína detectado pelo SDS-PAGE. Um passo crítico neste protocolo é o uso de controles apropriados, para discriminar especificamente a partir de interações não específicas. Recomendamos o uso de contas de agarose não conjugadas, e contas conjugadas com fosfato inositol ou fosfoinositos, utilizando várias configurações de fosfato, incluindo formas não fosfoiladas.
Este método pode ser aplicado a outros parasitas protozoários unicelulares, como Trypanosoma cruzi, leishmania ou plasmodium. Também pode ser facilmente adaptado a outros organismos, incluindo leveduras ou células de mamíferos. Este método pode ser acoplado à espectrometria de massa quantitativa, como o SILAC, para identificar interações dinâmicas de proteínas com fosfato inositol ou fosforinostides.
Também pode ser combinado com fracionamento subcelular, para identificar proteínas organelas específicas que se ligam a esses metabólitos. Essa abordagem ajudou a identificar proteínas que se ligam ao fosfato inositol e fosfoinositos em T.brucei, células mamíferas e leveduras. Ajudou a identificar novos domínios proteicos que se ligam a fosforinositídeos.
Ele abriu o caminho para entender a função regulatória desses metabólitos, seu papel na expressão genética, desenvolvimento celular e transdução de sinais em eucariotes. Alguns dos reagentes neste protocolo são tóxicos, ou inflamáveis. Use equipamentos de proteção individual e, quando necessário, trabalhe em um capô de fumaça.
