Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association Predoctoral Fellowship 788808-41910, o NIH-NINDS NS-NS-066001 e 055832, e O Centro de Investigação Fonoaudiológica NIH Training Grant 1T32DC010775-01.

1. Introdução: Instrumentos cirúrgicos requeridos Veja a Figura 4 <ol><li> Broca de dentista (Kavo Equipamentos Odontológicos, Modelo: UMXL-TM), 2-broca e furadeira de 3 bits </li><li> Agulhas hipodérmicas dois ~ calibre 30 </li><li> Serrilhada pinça, curvo ponta opcional (pode ser útil, mas não essencial) </li><li> Dois pinça de ponta fina </li><li> cortadores de fio </li><li> Fio de sutura </li><li> Micro tesoura </li></ol> 2. Criando a janela Surgical <ol><li> Anestesia: procedimentos estão em conformidade com as diretrizes do NIH e foram aprovados pela UC Irvine Animal Care e do Comitê Use. São sujeitos experimentais 295-400 g machos Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA) e o seguinte procedimento de anestesia deve ser utilizado: <ol><li> Injectar rato intraperitonealmente com um bolus de pentobarbital sódico (55 mg / kg de peso corporal) seguida por uma injecção intramuscular de atropina (0,05 mg / kg de peso corporal), no hind perna, e administrados 3,0 cc de 5% de dextrose em água, por via subcutânea. </li><li> Suplemento de pentobarbital de sódio (27,5 mg / kg de peso corporal) como injecções necessárias. Administrar uma pomada antibiótica oftálmica para os olhos para proteger as córneas durante os procedimentos seguintes. Administrar dextrose a 5% (3 mL) e atropina (0,05 mg / kg de peso corporal) a cada seis horas diminuir as secreções respiratórias durante a anestesia. Medir a temperatura do corpo por meio de uma sonda rectal, e manter a temperatura corporal a 37 ° C por uma manta térmica de auto-regulação. </li></ol></li><li> Localize a MCA por meio de: <ol class="lalpha"><li> Desbaste a 2 x 2 mm de imagens / janela de visualização sobre o córtex somatossensorial usando um tamanho de HP 3 broca até que o crânio é quase transparente e, em seguida, diluindo a total transparência usando um tamanho de HP 2 broca. A localização do MCA pode ser visto através desta janela e a sua trajectória proximal usada para aproximar a localização do segmento inicial. MCA geralmente executado em diagonal estajanela em uma rostral para caudal / ventral à direção dorsal (por exemplo, esquerda para a direita / para cima ao ver hemisfério esquerdo do ponto de vista do cirurgião). A janela cirúrgica pode então ser criada acima, onde o observador estima o segmento M1 (proximal cortical ramificação) a ser localizado com base nas ramificações distais visíveis através da primeira janela. A fim de minimizar a quantidade de crânio que é removido a fim de obter acesso a MCA / janela de visualização da imagem deve ser posicionado próximo a, mas separada da janela cirúrgica. Ou </li><li> Uma pequena janela cirúrgica deve ser posicionado aproximadamente 3 mm anterior e de 1 mm lateral ao forame oval ou o nervo mandibular, perto da tribuna arco 30,33,34. Para aceder efectivamente a haste do MCA (também conhecida como o segmento M1), o músculo temporal é reflectida temporariamente afastado da superfície do crânio. (Nota: No caso de cirurgias de sobrevivência a longo prazo, a experiência de nosso laboratório foi that, permitindo que o músculo temporal permanecer ligado na sua âncora, o músculo irá re-de recozimento para a superfície do crânio, permitindo comportamento alimentar saudável e eficaz manutenção do peso corporal. </li></ol></li><li> Siga MCA ao canto do rostral ventral da janela de imagem (se estiver a utilizar como referência), a fim de estimar a sua ramificação cortical onde inicial reside. </li><li> Criar uma nova região thin-crânio (nos referimos a isso como a janela cirúrgica) levemente rostral e ventral para a janela de imagem (se estiver usando isso como uma referência), onde o segmento M1 (pré-cortical ramificação) do MCA deve ser. IMPORTANTE: Deixe aproximadamente um intervalo de 2 mm entre a janela de imagem (se estiver usando isso como uma referência) ea janela cirúrgica. </li><li> Localizar a haste do MCA (também conhecida como o segmento M1) pouco antes cortical ramificação da artéria, como mostrado nas Figuras 1A e 1B. </li><li> Usando um tamanho HP-3 broca, fino o crânio acima da localização estimada segmento M1. Quando ocrânio torna-se um pouco transparente, mude para o tamanho mais delicada pouco HP-2 broca e fina do crânio até que seja completamente transparente. Confirmar visualmente como uma área cirúrgica janela torna-se fina o suficiente para exibir a vasculatura, e avaliar a localização do M1 neste ponto e completar a janela de tal modo que não é de 2-3 mm de cada lado do comprimento do segmento de M1 (isto permite espaço para a inserção e de saída da agulha de sutura de cada lado da MCA). </li></ol> NOTA IMPORTANTE: Pare desbaste quando a espessura do crânio é semelhante à da película de plástico. O navio se romperá se a broca rompe através do crânio e dura. Se o crânio não é suficientemente fina, por outro lado, removendo-o para a oclusão será difícil e pode resultar em danos para o córtex ou artéria. <ol start="7"><li> Tomar uma agulha hipodérmica de calibre 30 (30 L) e dobrar a ponta da agulha, utilizando pinças serrilhada. </li><li> Use a agulha de 30 G para perfurar o crânio cuidadototalmente em uma área não diretamente acima de uma artéria. Utilize este buraco punção para permitir uma pinça para agarrar crânio e retire cuidadosamente a área de desbaste da janela cirúrgica. </li><li> Dê um novo 30 G necessidade, dobre sua ponta como no Passo 6, e remova cuidadosamente a dura. </li></ol> NOTA: Cortando a dura fará com que ele descascar e MCA vai se tornar mais proeminente, como resultado da pressão reduzida. 3. Oclusão da MCA <ol><li> Use o alicate para cortar um reverse meia curva corte agulha de sutura (round 3/8, agulha de sutura 16 mm) até cerca de 3-5 mm. </li><li> Passe a agulha de sutura recortada, como mostrado na figura na Figura 4E. NOTA IMPORTANTE: É importante que a agulha é enroscada para ambas as extremidades do fio de sutura são de tamanho equivalente. Isto permite que o puxar do fio termina tanto sob M1, ao mesmo tempo, a agulha pode ser então cortado deixando livre a dois comprimentos de fio para amarrar os dois nós em torno de MCA. </li><li> Use o serrilhado a pinça escorregar a agulha de sutura sob M1. Inserir com cerca de 0,5-1 mm de distância da MCA, ficando tão superficial quanto possível de modo a minimizar os danos ao córtex, mas evitando demasiada pressão sobre o MCA bem. </li><li> Quando a agulha de sutura sai do outro lado de tal forma que ela está sob a MCA, utilizar uma pinça de ponta fina (como mostrado abaixo) para puxar a ponta da agulha de sutura a partir do lado oposto ao continuar a alimentar ou que empurra a outra extremidade do fio de sutura agulha com a ponta serrilhada pinças. </li><li> Uma vez que a agulha de sutura é passado completamente sob a MCA e foi puxado para fora, de continuar a puxar o fio de sutura e agulha até que o comprimento do fio é igual em ambos os lados da MCA. Ao pressionar para baixo sobre a linha medida que é alimentado através de minimizar a tensão sobre o MCA pode ser útil para impedir a ruptura como o fio passa por baixo da artéria. </li><li> Cortar o fio perto da agulha de sutura. </li><li> Use as duas pinças de ponta fina para desembaraçar os dois fios de sutura resultantes de modo que existem dois segmentos independentes enfiadas sob a MCA que não se tocam. Idealmente, os tópicos serão de cerca de 1 mm de distância, onde eles passam sob MCA. </li><li> Use as duas pinças de ponta fina para amarrar dois nós separados (duas ligaduras), com os fios em torno MCA tentando manter esse ~ 1 mm de espaço entre os nós para permitir espaço para transecção. </li></ol> NOTA: Se um controlo interno sham for desejado, preparar a oclusão deixando os nós de oclusão solto de modo a que eles não se contraem MCA em tudo e recolher os dados antes de apertar os nós e corte do recipiente. Corte a linha para evitar que pegar em qualquer coisa antes da oclusão, mas deixar fio suficiente para permitir o aperto dos nós mais tarde. Desta forma, qualquer imagem de linha de base ou de recolha de dados pode ser executada com todos da mesma invasão cirúrgica como a oclusão e os nós apertados no ponto de tempo apropriado, com pouco atraso. <ol start="9"><li> Uma vez que os nós já estaren bem apertada, use o micro tesoura para cortar através de M1, entre os dois nós. </li><li> No caso de estudos de sobrevivência a longo prazo: <ol class="lalpha"><li> Sutura de incisão aba couro cabeludo de volta no lugar com fio cirúrgico estéril ou proteger o tecido usando clipes ferida estéreis. </li><li> Administrar antibióticos localmente à área da ferida (tal como bacitracina pomada) e sistemicamente por injecção profilático de ampicilina (150 mg / kg, IM). </li><li> Enquanto o sujeito é ainda anestesiados administra uma pomada antibiótica oftálmica para os olhos. </li><li> Administrar suplementar de atropina (0,05 mg / kg IM) para diminuir as secreções respiratórias durante a anestesia. </li><li> Injectar flunixin meglumine (1,1 mg / kg) por via subcutânea, na conclusão da cirurgia e novamente na manhã seguinte (~ 12 horas depois) para controle da dor. </li><li> Colocar o animal em uma superfície seca, quente, inclinada de tal forma que o nariz animais está acima de sua cauda na inclinação (isso facilita a respiração até que o animal está acordado). &lt;/ Li&gt; <li> Monitorar o animal até que ele está acordado e mover com segurança por conta própria. </li><li> Uma vez que o animal está de volta no viveiro, a atividade do animal, aparência, vocalização e comportamento alimentar e beber deve ser monitorada diariamente. </li></ol></li></ol> 4. Eutanásia <ol><li> No final de cada experiência, os ratos devem ser sacrificados com pentobarbital de sódio (2-3 ml, por via intraperitoneal). </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.+Which+method+works+best?.">Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best?.</a> Stroke. 24, 294-297 (1993).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li><li>Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+reevaluation+of+the+intraluminal+thread+model+of+focal+cerebral+ischemia:+evidence+of+inadvertent+premature+reperfusion+and+subarachnoid+hemorrhage+in+rats+by+laser-Doppler+flowmetry.">A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry.</a> Stroke. 29, 2162-2170 (1998).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar neste momento.

Este protocolo foi desenvolvido a fim de induzir isquemia dentro do córtex roedor, e a fazê-lo com o mínimo de impacto periférica sujeitos experimentais. A dupla oclusão e método transecção permite a confirmação visual de que o recipiente foi permanentemente obstruída, e pode ser realizado sem invasão excessiva ou danos no tecido, e com uma elevada taxa de sobrevivência. Este protocolo de oclusão pode ser aplicada a qualquer recipiente cortical que podem ser acedidas através craniotomia para induzir isque...

A fim de induzir eficazmente condições isquémicas que imitam AVC isquémico humano, existem vários modelos animais tempos são amplamente empregados, com diversos volumes de enfarte resultantes. No modelo photothrombotic, o cérebro é irradiada através do crânio intactos utilizando iluminação do laser após a injecção intravenosa de uma substância fotossensível (como cor-de-bengala), resultando em coagulação fotoquímica, obstrução dos vasos irradiados, e isquemia no tecido circundante 6, 7. Indocianina pode resultar em regiões muito pequenas, isolados de enfarte e é tipicamente utilizado como um meio de modelação &quot;mini-derrames&quot;, ou &quot;micro-enfartes&quot;. A técnica mais frequentemente adoptada para a indução de acidente vascular cerebral isquémico, particularmente na artéria cerebral média (MCA), é o modelo de monofilamentos intraluminal 8, na qual um filamento é introduzido cirurgicamente para dentro da artéria carótida externa e avançou até a ponta oclui a base da MCA. A primary desafio de oclusão filamento intraluminal é a alta taxa de mortalidade (70% quando a MCA está obstruído por 3 horas, um ponto de tempo relevantes para a investigação AVC) 9. Outros problemas com o método incluído possível hemorragia subaracnóide, oclusão incompleta, e volume de infarto variável 10,11. Este modelo resulta num grande grau de enfarte, tanto no córtex e subcorticalmente 12 e os modelos de um acidente vascular cerebral humano. Maciça Embora ambos micro e acidente vascular cerebral maciço modelos são importantes, traços humanos são normalmente algures no meio. Em grandes estudos clínicos, acidente vascular cerebral infarto varia em tamanho 28-80 cm 3, o que se traduz em 4,5-14% do hemisfério ipsi-ishemic 9. Em comparação, os ratos pMCAO enfarte tamanho varia de cerca de 9-35 mm 3, a qual é constituída por 3 a 12% do hemisfério ipsi ishemic. Nosso modelo pMCAO, portanto, se assemelha volumes infarto AVC isquêmico humanos pela porcentagem de cérebrovolume. Além de modelar o dano estrutural do curso, resultados pMCAO nos défices funcionais e comportamentais semelhantes à condição humana. No mínimo, um modelo eficaz de resultados do curso em déficits de movimento contralateral à lesão AVC 13-15, perda ou interrupção da função motora e sensorial 16,17, perda ou interrupção de atividade neuronal evocada 16,18, a redução no fluxo sanguíneo cerebral 19, 20, e do infarto 21,22. Dessa forma, os modelos pMCAO uma oclusão grave de MCA, resultando em incapacidade física, perda da função dentro do córtex sensorial (e córtices vizinhos), a interrupção da atividade neuronal, uma severa redução no fluxo sanguíneo MCA e atributos infarto característicos da AVC isquêmico 23 -25, portanto, servir como um modelo eficaz de acidente vascular cerebral humano. Processualmente, pMCAO envolve uma pequena craniotomia em que remova cuidadosamente o crânio e dura deum mm x &quot;janela cirúrgica&quot; 2 2 sobre o segmento inicial (M1) de MCA, imediatamente antes da bifurcação primária de MCA em ramos corticais anterior e posterior (Figuras 1A e 1B). Passamos um reverso agulha de sutura de corte semi-curva e linha (6-0 seda) através da camada pial das meninges, MCA abaixo e acima da superfície cortical (ver Tabela de reagentes e equipamentos específicos para os suprimentos cirúrgicos necessários para realizar pMCAO ). Em seguida, dê um duplo ligadura, aperte os dois nós em torno de MCA, e transecto o navio entre os dois nós. A ligadura dupla e transecção através M1 ocorre apenas distal à ramificação lentículo, de tal modo que apenas os ramos corticais de MCA-são afectados, assim, apenas enfarte cortical (nenhum dano subcortical) ocorre 26,27 (Figura 2). Apesar de AVC humano muitas vezes envolve enfarte subcortical, modelando isso em roedores requer aumento da capacidade de invasão (oclusão de vasos cerebrais antes cortical Branching requer acesso artérias através da artéria carótida no pescoço e necessita de oclusões adicionais) na técnica e aumento da variabilidade no tamanho do infarto. O modelo descrito aqui não pode ser realizada mais proximal como o acesso aos ramos anteriores do MCA não é possível através de uma craniotomia simples. Embora possa ser possível para induzir cirurgicamente um enfarte sub-cortical através pMCAO, oclusão implicaria um procedimento extremamente invasivo e, por conseguinte, não é o ideal. Eficácia de oclusão pode ser confirmada através de Doppler a laser, ou laser salpico imagiologia 12,24,25 (Figura 3), ou histologicamente post mortem (Figura 2). Deve notar-se que a pesquisa anterior tem mostrado que a estimulação sensorial pode desempenhar um papel importante na evolução e resultado de enfarte; conferir protecção contra danos quando administrados dentro de 2 horas de pMCAO e causando um aumento no dano do curso, quando administrado a 3 horas após pMCAO 24,25,28. Confirmámos que a 5 horas após a pMCAO, a estimulação já não tem um efeito sobre os resultados (dados não publicados). Assim, a estimulação sensorial de sujeitos deverá ser minimizada durante 5 horas seguindo pMCAO obter volumes de enfarte com uma variabilidade mínima. Assim, o nosso grupo vai &quot;controles não tratados&quot; deste tipo, mantendo os ratos anestesiados por 5 horas pós-pMCAO, no escuro, com a estimulação sensorial mínima, e expressamente nenhum estímulo triz. Deve-se ainda notar que a variação ocasional na estrutura MCA, incluindo a excessiva ramificação, vários segmentos primários, ou a ausência de artérias comunicantes pode ocorrer em uma freqüência de 10 a 30% no sexo masculino adulto Sprague Dawley 29,30. Se anormalidades na MCA são observados, é aconselhável não usar esse assunto em particular como a adição de animais com tais anomalias vasculares vão aumentar a variabilidade do infarto. Além disso, há vários aspectos práticos de oprocedimento ur que tornam este método de oclusão vantajoso para a investigação derrame. Em primeiro lugar, as suturas podem ser colocados ao redor da artéria, mas não apertou a fim de recolher a avaliação inicial, seguido de avaliação pós-isquêmica após ligadura e transecção. Nesta forma, a preparação cirúrgica necessária para a oclusão é efectivamente controlada por, entre os indivíduos. Como os indivíduos podem permanecer estacionária ou dentro de um quadro estereotáxico durante a oclusão, é possível realizar uma avaliação experimental de cada sujeito, antes, durante, e após a oclusão, sem mover o objecto ou perturbar qualquer equipamento em uso experimental 25,28. Além disso, este procedimento resulta em uma taxa de mortalidade muito baixa, mesmo dentro de assuntos roedores idade 21-24 meses de idade (o equivalente a um humano idoso) 31, e pode, portanto, ser usados ​​para avaliar tratamentos acidente vascular cerebral em ratos que mais de perto o modelo mais comum faixa etária dos portadores de acidente vascular cerebral 25,28. Vessel transection também serve a vários propósitos práticos. A falta de sangramento depois da transecção confirma que o recipiente foi completamente ocluído em ambos os locais de ligadura. Além disso, transection garante uma interrupção permanente do fluxo de sangue. Finalmente, a transecção assegura que qualquer fluxo de sangue detectado nas porções distais do vaso ocluído deve vir de uma fonte alternativa. Finalmente, embora especificamente descrever a técnica de oclusão para MCA neste manuscrito e vídeo, a mesma técnica transection ligadura dupla pode ser aplicado a qualquer vaso cerebral que pode ser acessado via craniotomia. O nosso laboratório, por exemplo, utilizado em conjunto com pMCAO várias oclusões adicionais permanentes MCA distais dos ramos, a fim de bloquear tanto primário, e do fluxo de sangue colateral 24 de uma maneira semelhante à das técnicas destinadas a induzir selectivamente isquemia no córtex somatossensorial primário 32. Em conclusão, to seu método de oclusão permanente, tal como aplicado a MCA modela estreitamente três facetas primárias de acidente vascular cerebral humano: a localização mais comum (MCA), tipo (isquemia), e grau de dano (enfarte), associada com a literatura clínica humana de acidente vascular cerebral. Além disso, este método de oclusão pode ser aplicada aos locais de oclusão simples ou múltiplo ao longo do cérebro, e pode ser realizado em doentes idosos com uma elevada taxa de sobrevivência. Dada a natureza dinâmica, permanente e relativamente não-invasivo desta oclusão, esta técnica representa uma ferramenta adicional para os pesquisadores pré-clínicos avaliando novas abordagens para a protecção e tratamento de acidente vascular cerebral.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)</td>
 <td>Fine Science Tools </td>
 <td>11151-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)</td>
 <td>Fine Science Tools </td>
 <td>11252-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)</td>
 <td>Fine Science Tools </td>
 <td>14084-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round 3/8 (16 mm) Suture Needles</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12050-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-0 Braided Silk Suture</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>NC9071061 
 Harvard Apparatus 
 No.:510461</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30 gauge needle, &frac12;" length</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>NC9867376 
 
 No.:ZT-5-030-5-L/COL</td>
 <td></td>
 </tr>
</table>

permanent cerebral vessel occlusion via double ligature and transection

O AVC é a principal causa de morte, invalidez e perda socioeconômicas em todo o mundo. A maioria de todos os acidentes vasculares cerebrais resultam de uma interrupção do fluxo sanguíneo (isquemia) 1. Artéria cerebral média (MCA) fornece uma grande maioria de sangue para a superfície lateral do córtex 2, é o local mais comum de acidente vascular cerebral humano 3, e isquemia no seu território pode resultar em disfunção extensa ou morte 1,4,5. Sobreviventes de acidente vascular cerebral isquêmico, muitas vezes sofrem perda ou rompimento das capacidades motoras, deficiências sensoriais e infarto. Em um esforço para capturar estas características fundamentais de acidente vascular cerebral e, assim, desenvolver um tratamento eficaz, uma grande ênfase é colocada em modelos animais de isquemia em MCA. Aqui apresentamos um método de oclusão permanentemente uma cortical dos vasos sanguíneos da superfície. Vamos apresentar este método usando um exemplo de uma oclusão do vaso relevante que modela o tipo mais comum, localização e outcome de acidente vascular cerebral humano, oclusão da artéria cerebral média permanente (pMCAO). Neste modelo, expomos cirurgicamente MCA no rato adulto e, subsequentemente, através de ocluir ligadura dupla e transecção da embarcação. Isto bloqueia o ramo pMCAO cortical proximal do MCA, causando isquemia em todos MCA território cortical, uma grande porção do córtex. Este método de oclusão pode também ser utilizado para ocluir porções mais distais dos vasos corticais, a fim de alcançar mais de isquemia focal como alvo uma região menor do córtex. As principais desvantagens da pMCAO são que o procedimento cirúrgico é pouco invasivo como uma pequena craniotomia é necessário para aceder MCM, no entanto, isso resulta em dano mínimo do tecido. As principais vantagens deste modelo, no entanto, são os seguintes: o local de oclusão está bem definida, o grau de redução do fluxo sanguíneo é consistente, funcional e disfunção neurológica ocorre rapidamente, o tamanho do enfarte é consistente, e a elevada taxa de sobrevivência a longo permite avaliação crônica prazo.

Oclusão de sucesso de um navio pode ser confirmado usando laser de salpico de imagem (LSI), entre outras técnicas de imagem do fluxo sanguíneo. O fluxo de sangue nos principais ramos corticais da MCA deve cair para ~ 25% da linha de base ou menos após oclusão, dependendo do nível de ruído no sistema de gravação e a sensibilidade da técnica. Ver Figura 3 para uma imagem representativa de um LSI segmento de um ramo cortical da MCA, antes e após a oclusão MCA. Quando a técnica...

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Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Nós descrevemos um método altamente reprodutível para a oclusão permanente de um roedor grande vaso sanguíneo cerebral. Esta técnica pode ser realizado com muito pouco dano periférica, a perda de sangue mínima, uma elevada taxa de sobrevivência a longo prazo, e o volume de enfarte consistente comensurável com a população de clínica humana.

Permanente oclusão vascular cerebral<em&gt; Via</em&gt; Dupla ligadura e transecção

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

14.8K visualizações.  University of California, Irvine. Nós descrevemos um método altamente reprodutível para a oclusão permanente de um roedor grande vaso sanguíneo cerebral. Esta técnica pode ser realizado com muito pouco dano periférica, a perda de sangue mínima, uma elevada taxa de sobrevivência a longo prazo, e o volume de enfarte consistente comensurável com a população de clínica humana.

Vídeo: Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Medicina

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando uma janela craniana para Visualizar a artéria cerebral média Durante endotelina 1 Induzida por oclusão da artéria cerebral média

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-oclusão do vaso / hipotensão: um modelo de rato de isquemia cerebral

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Realizando Permanente Distal Oriente cerebral com carótida comum Oclusão da Artéria em ratos idosos para estudar Cortical Isquemia com Deficiência Sustentada

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

Modelo de Mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão Cerebral

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...