Este modelo de rato de oclusão de dois vasos de isquemia-reperfusão cerebral pode investigar a fisiopatologia do derrame. Este modelo induzirá um volume de infarto estável de uma maior parte das células imunes infiltradas no cérebro isquêmico e o déficit comportamental após isquemia cerebral-reperfusão. Nesse modelo, um infarto é causado nas áreas corticais e a taxa de mortalidade é baixa.
Como o modelo de reperfusão de ligadura MCAO requer craniotomia para expor o tamanho da MCA distal, o tamanho pode ser facilmente confirmado, e o exame se o fluxo sanguíneo no MCAO distal é interrompido durante o procedimento é simples. Forneça aos ratos acesso gratuito à água e à comida até a cirurgia. Autoclave as ferramentas cirúrgicas, e use 70% de etanol para higienizar a mesa de cirurgia e equipamentos.
Depois de anestesiar um mouse de oito a 12 semanas de idade, certifique-se de que ele não tenha um reflexo de pedal quando testado usando uma pitada firme do dedo do pé. Use pomada veterinária para evitar o ressecamento dos olhos enquanto o rato estiver sob anestesia. Para monitorar a pressão arterial, primeiro remova o cabelo e, em seguida, use um sistema de pressão arterial não invasivo e um sistema de monitoramento fisiológico para monitorar a temperatura retal e gases sanguíneos arteriais.
Injete o rato subcutâneamente com um antibiótico profilático. Em seguida, coloque o mouse na posição supina na almofada de aquecimento. Para expor a pele, use cortadores elétricos para raspar a pele na região do pescoço ventral e na região entre o olho direito e a orelha direita.
Limpe a pele do corpo do animal com creme de depilação e desinfete o local cirúrgico com 70% de etanol. Em seguida, corte uma incisão de uma polegada de comprimento no pescoço usando uma tesoura de íris. Com fórceps de íris, dissequei cuidadosamente a artéria carótida comum livre dos nervos vagos sem causar lesões físicas, e use suturas de seda 5-0 para isolar a artéria.
Em seguida, use uma tesoura de íris para fazer uma incisão de 0,3 centímetros no couro cabeludo no ponto médio entre o olho direito e a orelha direita. Usando micro tesoura, corte o músculo temporalis para expor o osso zigomático e esquamosal. Coloque o mouse sob um microscópio de dissecação estéreo e use uma micro broca para criar um orifício de dois mililitros diretamente sobre a artéria cerebral média distal do lado direito.
Use uma sutura 10-0 para ligar o tronco do MCA distal do lado direito, e use um clipe de aneurisma não traumático para ocluir a CCA do lado direito. Após a duração desejada da isquemia, remova o clipe de sutura e aneurisma para restaurar o fluxo sanguíneo para o MCA e CCA. Use um clipe de sutura para selar a incisão da pele na cabeça e selar as incisões da pele cervical com cola cirúrgica.
Injete buprenorfina subcutânea para aliviar a dor. Mantenha a temperatura corporal do animal em 36,5 graus mais ou menos 0,5 graus Celsius na almofada de aquecimento, e não deixe desacompanhado ou devolva-o à companhia de outros animais até que ele seja totalmente recuperado da anestesia. Por fim, coloque o mouse na gaiola autoclave para que ele possa acessar livremente água e comida depois de totalmente recuperado.
Use uma tesoura de íris para fazer uma incisão na pele da cabeça do rato anestesiado e decapitado para expor o crânio. Em seguida, use a tesoura de operação para cortar o anterior do osso frontal, e com a tesoura de íris, corte o crânio ao longo da sutura sagital. Com um rongeur ósseo, empurre de lado o osso frontal e parietal, e exponha o cérebro.
Remova o cérebro e coloque-o em uma matriz cerebral de camundongos. Use lâminas de barbear para obter fatias coronais de dois mililitros e coloque-as em tubos de 50 mililitros preenchidos com cinco mililitros de 2%TTC. Ao usar a matriz cerebral do camundongo para obter fatias coronais, o tamanho do corte deve ser o mesmo em cérebros diferentes.
O tamanho do corte afeta o tamanho das fatias cerebrais, que também afetam o cálculo do tamanho do infarto. Manche as fatias cerebrais com 2%TTC e 1X PBS por 10 minutos a 37 graus Celsius, e depois enxágue duas vezes com 10% de formalina. Conserte as fatias cerebrais em 10% de formalina à temperatura ambiente por 24 horas.
Depois de secar as fatias cerebrais no papel de tecido para absorver o excesso de formalina, organize-as em um slide plástico limpo, orientando-as de rostral a caudal, e cubra-as com outra lâmina de plástico limpa. Escaneie o slide usando um scanner. Vire o slide e escaneie o lado inverso.
Use o software ImageJ para calcular a área de infarto de cada seção, primeiro abrindo o arquivo de imagem e configurando a escala para a imagem. Em seguida, use a seleção à mão livre para selecionar a área de infarto e use as regiões de interesse do gerente do ROI para medir a área de interesse. Por fim, somam as áreas infartas para cada seção e multiplicam o resultado pela espessura da seção para estimar o volume total de infarto e, em seguida, completam a análise estatística, conforme descrito no manuscrito.
O aumento da duração da isquemia durante este procedimento de reperfusão de MCAO produziu diferentes graus de volume infarto induzido por isquemia e perda neuronal no córtex cerebral da área mca direita. Além disso, a isquemia diminuiu a atividade locomotor do animal em 48 horas após a reperfusão de MCAO. Após a isquemia cerebral-reperfusão, uma série de células imunes periféricas se infiltraram no hemisfério ipsilateral do cérebro isquêmico.
Além disso, quando este modelo de oclusão de dois vasos foi comparado com o modelo MCAO, seus volumes de infarto não foram significativamente diferentes. A micro broca deve ser cuidadosamente usada ao criar um buraco no crânio. Com ação inadequada, fácil causar sangramento do MCA.
O MCA não deve ser danificado, e o sangramento deve ser evitado antes e depois do procedimento de ligadura. A oclusão do MCA e o estado de reperfusão podem ser verificados pelo Laser Doppler. Este método pode confirmar a condição do fluxo sanguíneo da MCA.
