Agradecemos M. Boysen para comentários sobre o manuscrito. Este projecto foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 e MA 1278/4-1 a MPM, e Cluster de Excelência: CellNetworks EXC 81/1). MPM é investigador do Cluster de Excelência: CellNetworks.

1. Preparação de Amortecedores e Proteína Amostras <ol><li> Prepare H2O tampão. Utilização Hsp90 tampão padrão (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, glicerol a 10%) na forma de H 2 O tampão. Nota: Se a amostra foi dialisada antes da análise, usar o tampão de diálise como H2O tampão. É essencial que o O tampão D 2 difere do ó tampão H 2 apenas no isótopo de hidrogénio. Buffers voláteis como NH 4 componentes 4-acetato ou tampão CO 3 ou NH não são adequados! </li><li> Prepare D 2 O tampão por liofilização de solução tampão padrão de Hsp90 usando um concentrador de vácuo. Após completa evaporação da H2O adicionar puro D 2 O para o tubo para atingir o volume total inicial (por exemplo, 1 ml de tampão com 15% de glicerol requerem a adição de 850 ul de D 2 O). Repita a evaporação completa do buffer e dissolver o com buffer / salnentes em D 2 O 2x. </li><li> Preparar tampão de têmpera (0,4 M de KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 de pH 2,2). Nota: Para melhorar a eficiência da digestão péptica de proteínas muito estáveis ​​4 M de cloridrato de guanidina e 0,5 M de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP-HCl) podem ser adicionados. </li><li> Prepare a 100% da amostra de controlo (6 M de cloridrato de guanidina, D 2 O). Adicionar cloridrato de guanidina a uma alíquota de Hsp90 para atingir uma concentração final de 6 M. evaporar completamente H2O a partir da amostra e adicionar D 2 O para o tubo, para atingir o volume total inicial (por exemplo, amostra de 100 ul com 10% de glicerol requerem a adição de 90 ul de D 2 O). Repetir a evaporação completa do tampão e redissolver os componentes de tampão / sal em D 2 O. Nota: 20-100 pmol de amostra são necessários para cada injeção. Prepare amostra suficiente para ter um controle de 100% para todos os dias de experimentos HX-MS. </li><li> Preparar 50 pmol Hsp90 em 5 ul de tampão de Hsp90 padrão. Nota: Uma quantidade de 20-100 pmol de amostra é necessário para cada ponto de dados brutos. O volume da amostra na reacção é de 1-5 ul idealmente. Ajustar a concentração para atender a esses requisitos. Qualquer tampão pode ser utilizado, desde que ele não contém detergentes ou componentes voláteis. </li></ol> 2. Preparação de Imobilizado pepsina em Aldeído Beads ativado <ol><li> Dissolve-se 80 mg de pepsina fresco em citrato de sódio 50 mM de 2 ml (pH 5). </li><li> Dissolver 20 mg de cianoborohidreto de sódio, manusear com cuidado (muito tóxico!) Em 1 ml de 2 M Na 2 SO 4 e adicionar a solução de pepsina. </li><li> Incubar mistura durante 10 minutos à temperatura ambiente enquanto se agita suavemente (por exemplo, agitador de cima). </li><li> Adicionar 600 mg de grânulos com grupos aldeído imobilizadas à mistura e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2,2 ml de 2 M Na 2 SO4 (pH 5) em 100 mL alíquotas a cada 3 min mais de uma hora de sal lentamente a pepsina. Misture suavemente a amostra entre as adições em um agitador vertical à temperatura ambiente. </li><li> Incubar os grânulos de pepsina a 4 ° C durante 14-16 horas / dia para o outro num agitador vertical. </li><li> Extingue-se a reacção por adição de 1 ml de etanolamina 1 M e incubação à temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Girar as pérolas num tubo falcon de 50 ml a 500 rpm, desprezar o sobrenadante e ressuspender as contas em ácido fórmico a 0,1%. Repita este passo 2x. Após o último passo de centrifugação, descartar o sobrenadante e estimativa do volume de esferas. Adicionar um volume equivalente de ácido fórmico 0,1% e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparação de Colunas para Amida de hidrogênio-troca <ol><li> Use colunas de guarda com um diâmetro interno de 1 mm para prendendo colunas e com 2 mm para colunas pepsina. </li><li> Desapertar um lado da coluna de guarda e remover o filtro. Fortemente parafuso funn embalagemel para a extremidade aberta da coluna. Usar um adaptador de 1/16 de polegada e tubo para conectar uma seringa vazia (5 ml) para a saída de fundo da coluna. Certifique-se de corrigi-lo à prova de gás para a coluna de guarda. </li><li> Aplique algumas gotas de material de cordão de lama no topo do funil. Puxar o êmbolo da seringa para sugar a lama através de um funil para a coluna de guarda. Aplicar mais material talão lama para o funil e continuar o processo até que a pré-coluna é completamente preenchida com material de cordão. Remover o funil e colocar filtro e filtro de anel na extremidade aberta. Aperte o parafuso da tampa de coluna na coluna de guarda e remover a seringa do outro lado. Feche ambas as extremidades das colunas de guarda com fichas para evitar a secagem do material da coluna. </li></ol> 4. Configuração do Sistema de Hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa (HX-MS) <ol><li> Ligue a coluna armadilha com o sistema de HPLC (Figura 1). Equilibrar a coluna ajustando o caudal deUma bomba de 0,4 ml / min com 0,1% de ácido fórmico como solvente. Não ligue a coluna pepsina nem a coluna de análise ainda. </li><li> Calibra-se o espectrómetro de massa e ligar a saída da HPLC para a fonte do espectrómetro de massa. </li></ol> 5. Determinação da Faixa Dinâmica de câmbio <ol><li> Prepare ultrapura solvente A (0,1% de ácido fórmico em água) e ultrapura solvente B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo); solventes misturados prontos estão disponíveis comercialmente. Purificai as bombas de HPLC. Configure a cromatografia e métodos de espectrometria de massa no software de controle, escolhendo um programa com um gradiente passo depois de uma etapa de dessalinização curto. Para full-length Hsp90 utilizar um passo de dessalinização de 1-2 min seguido por comutação da válvula de 6 portas de dessalinizar / LOAD para eluir e um gradiente em degrau de 90% de solvente A/10% de solvente B a 5% de solvente A/95% de solvente B. Antes da injecção definir a válvula de injeção de carga e válvula de 6 portas para dessalinizar / posição de carregamento. Nota: Não use a pepsina ou coluna analítica durante esta experiência. </li><li> Prepare 100-200 pmol de Hsp90 em 1-10 ul H2O tampão e incubar durante 10 min a 30 ° C. Adicionar temperatura ajustada D 2 O tampão para perfazer o volume da amostra até aos 100 ml e incubar exactamente, por um período definido de tempo (por exemplo 10 segundos, 100 segundos, 1000 seg). Adicionar 100 mL de tampão de têmpera e misture por pipetagem cima e para baixo. Injectar a amostra de 200 ul para o orifício de injecção da válvula de injecção com uma seringa Hamilton. Inicie o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir. Repita isso por pelo menos três pontos de tempo. </li><li> Repetir o passo 5.2, mas adicionar excesso de 2 a 3 vezes de STI1 para a Hsp90 amostra antes da incubação durante 10 min a 30 ° C. </li><li> Determinar as massas de proteínas de comprimento completo por desconvolução de espectros no software de espectrometria de massa. Calcule o número de incorporandoed dêuterons comparando o peso molecular de Hsp90 de comprimento completo com a massa observada após cada ensaio (por exemplo, 10 segundos, 100 segundos, 1000 seg). </li><li> Traçar os deuterões incorporadas para Hsp90 na ausência e presença de STI1 (eixo y) versus tempo (eixo x). Determinar o ponto de tempo no intervalo dinâmico, onde a diferença entre as duas curvas é máxima. Utilize este valor para o tempo de incubação em D 2 O na identificação de interface e dinâmica sobre os níveis de peptídeo Hsp90-STI1. </li></ol> 6. Determinação da péptica Peptídeos Usando MS / MS Spectra <ol><li> Ligue a coluna de pepsina e uma coluna analítica para o sistema. </li><li> Configure os parâmetros para a cromatografia e espectrometria de massa no software de controle, escolhendo tipo de gradiente e método de espectrometria de massa. Escolha uma rampa longa (por exemplo, mais de 90 min) para garantir uma boa resolução cromatográfica. Ativar espectros MS / MS no espectrômetro de massa. Nota: Boa resolução no HPLC e precisão de massa de alta tem maior prioridade nesta etapa. </li><li> Prepare 100-200 pmol de Hsp90 em 100 ul H2O tampão. Adicionar 100 mL de tampão de têmpera e misture por pipetagem cima e para baixo. Injectar a amostra de 200 ul para o orifício de injecção da válvula de injecção com uma seringa Hamilton. Inicie o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. Nota: Se existir mais do que uma proteína deve ser analisada em HX-MS (isto é, as interfaces de interacção proteína-proteína) para cada um dos péptidos de proteínas tem de ser determinadas individualmente. </li><li> Identificar os péptidos pépticas de Hsp90, pesquisando uma base de dados (isto é, Mascot) para os péptidos resultantes. Nota: É possível utilizar uma base de dados personalizada como o objectivo é determinar como muitos péptidos pépticas quanto possível e análise é feito com a proteína purificada. Amostra de pureza vontade have a ser levado em conta. </li><li> Repetir esta etapa sem MS / MS e com o gradiente que vai ser utilizado para a experiência real HX. Para a Hsp90 e STI1 utilizar um gradiente de 10 min desde 90% de solvente A/10% de solvente B a 45% de solvente A/55% de solvente B. Nota: Os gradientes são normalmente entre 5-15 min e altamente dependem da complexidade da amostra e as especificações do sistema HX. </li><li> Tempo de retenção determinar os tempos de retenção dos péptidos identificados pépticas em 6.4, o gradiente utilizado em 6.5 e criar uma lista que compreende 1). Sequência do péptido 2.) Péptido estado de carga e 3.). Isto irá ser utilizado para identificar cada péptido após as experiências HX. Nota: Esteja ciente de que os peptídeos com diferenças pequenas m / z, estado de carga idêntica e tempo de retenção idêntico pode ser uma fonte de ambigüidade. </li></ol> 7. Identificação de Interfaces de interação proteína-proteína <ol><li> Configure o gradiente eo método de espectrometria de massa no softwar controlee. Use um gradiente linear de 10 minutos a partir de 90% de solvente A/10% de solvente B a 45% de solvente A/55% solvente B. Coloque um método de espectrometria de massa que é otimizado para detecção de massas entre 300-1,500 m / z, embora a maior parte os péptidos serão superiores a 1000 m / z. Ajuste a válvula de injeção na posição de carga, a válvula de 6 portas em carga / dessalinização Position. Ajuste a velocidade de fluxo da bomba de carga de 0,4 ml / min. Nota: A duração eo tipo de gradiente são dependentes da amostra e pode ter que ser otimizado. Gradientes mais longos melhorar a resolução da cromatografia, mas diminuir a incorporação de deutério em proteínas, devido ao back-troca. Os métodos escolhidos precisa ser a mesma para todas as experiências deve ser comparado. </li><li> Para a referência unexchanged preparar 20-100 pmol de Hsp90 em 100 ul H2O tampão. Adicionar 100 ul de tampão gelada têmpera, pipeta cima e para baixo duas vezes e injetar amostra na válvula de injeção do HPLC. Iniciar imediatamente o programa de cromatografia e swcoçar a válvula de injeção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. Faça isso por Hsp90 e STI1 individualmente e para a mistura de proteínas. </li><li> Prepare 20-100 pmol de Hsp90 em um volume de 1-5 ul. Adicionar temperatura ajustada D 2 O tampão para trazer o volume de amostra até aos 100 ml e incubar exatamente por um período definido de tempo (por exemplo, 30 segundos, pois dinâmica conformacional ver nota). Adicionar 100 ul de tampão de têmpera gelada, pipeta-se para baixo e duas vezes rapidamente e injectar 200 ul para a válvula de injecção da HPLC. Iniciar imediatamente o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. Fazer isto para cada uma das proteínas individualmente, para determinar a incorporação de deutério em cada péptido na ausência da proteína que interage. Nota: Ao estudar a dinâmica de conformational alterações, repita o experimento com diferentes tempos de incubação de Hsp90 em D 2 O buffer. Tentar cobrir uma ampla escala de tempo, escolhendo os tempos de incubação logaritmicamente (por exemplo, 10 segundos, 30 segundos, 100 segundos, 300 segundos, 1000 seg, etc.) D 2 O tampão tampão e amostra deve ser exatamente idênticos, exceto para o isótopo de hidrogênio. </li><li> Prepara-se uma quantidade igual de 100% da amostra de controlo (20-100 pmol) e adicionar D 2 O tampão para perfazer o volume da amostra a 100 ul. Adicionar 100 ul de tampão de têmpera gelada, pipeta-se para baixo e duas vezes rapidamente e injectar 200 ul para a válvula de injecção da HPLC. Iniciar imediatamente o programa de cromatografia e trocar a válvula de injecção na posição INJECT. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. </li><li> Para determinar a superfície de interacção misturar Hsp90 com um excesso de, pelo menos, 2 vezes superior de STI1 para desviar o equilíbrio para o estado ligado (ver nota) e incubarà temperatura desejada até que a formação do complexo está em equilíbrio. Adicionar temperatura ajustada D 2 O tampão para perfazer o volume da amostra até aos 100 ml e incubar exactamente, por um período definido de tempo (por exemplo 30 segundos). Adicionar 100 ul de tampão de têmpera gelada, pipeta-se para baixo e duas vezes rapidamente e injectar na válvula de injecção da HPLC. Após 2 min trocar a válvula de 6 portas de dessalinizar / CARREGAR para eluir posição. Repita esta experiência com 20-100 pmol de STI1 e excesso de Hsp90. Nota: As concentrações absolutas dependem da constante de equilíbrio de dissociação da interacção. Idealmente, após diluição em D 2 O a concentração da proteína em excesso adicionado deverá ser pelo menos 10 vezes a K D (correspondente a&gt; 85% da proteína ligada inferior concentrado). </li><li> Analisar os dados adquiridos, com um software adequado e usar o tempo de retenção determinadas no passo 6.5 para encontrar cada péptido na análise. Calculate o centróide de distribuição de isótopos para a proteína unexchanged (passo 7.2) e para as experiências de HX (passo 7.3). Nota: Embora os padrões de isótopos de peptídeos trocados parecer diferente dos seus homólogos unexchanged, tanto o conhecimento sobre o estado de carga do peptídeo ea exatidão elevada massa do espectrômetro de massa permite a fácil determinação dos centróides. </li><li> Compare incorporação de dêuterons de proteína alvo sozinho e com excesso de parceiro de ligação. Isso pode ser feito automaticamente com o software comercial ou manualmente com um programa de planilha. Os valores da amostra de controlo de 100% indicam a troca máxima para cada péptido e pode ser utilizado para determinar a quantidade de D 2 O rótulo perdido durante a experiência, devido à troca de volta. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+analysis+of+bimodal+isotope+peak+distributions+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+using+HeXicon.">Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon.</a> Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).</li><li>Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+back+exchange+in+the+hydrogen+exchange-mass+spectrometry+experiment.">Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).</li><li>Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+EX1+kinetics+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+by+peak+width+analysis.">Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).</li><li>Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+EX1+signatures+caused+by+sample+carryover+during+HX+MS+analyses.">False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses.</a> Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).</li><li>Deng, Y., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unfolding+domains+in+large+proteins+by+their+unfolding+rates.">Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates.</a> Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+unfolding+of+diverse+SH3+domains+on+a+wide+timescale.">Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale.</a> J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).</li><li>Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+membrane+transport+protein+probed+by+h/d+exchange+and+covalent+labeling:+the+glycerol+facilitator.">Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator.</a> J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).</li><li>Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li><li>Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformations+can+be+probed+in+top-down+HDX+MS+experiments+utilizing+electron+transfer+dissociation+of+protein+ions+without+hydrogen+scrambling.">Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A ligação de um parceiro de interacção com uma proteína, inevitavelmente, provoca alterações na acessibilidade do solvente sobre o local de ligação. Além disso, muitas proteínas sofrem alterações conformacionais dinâmicas sobre a ligação, que afetam outras regiões do que a interface de união real. HX-MS é um método robusto para monitorar essas mudanças e ainda é capaz de revelar mudanças conformacionais em proteínas em escalas de tempo que outros métodos não pode cobrir. <p class="jove_cont...

O número de estruturas de cristal de proteínas e complexos de proteína aumentou rapidamente nos últimos anos. Apresentam instantâneos inestimáveis ​​da organização estrutural das proteínas e fornecer uma base para a análise da estrutura-função. No entanto, a dinâmica das proteínas e as mudanças conformacionais, que são essenciais para as suas funções, são raramente revelado por cristalografia de raios-X. Cryo-electronmicroscopy, por outro lado, é capaz de capturar os complexos de proteínas e de proteínas em diferentes conformações, mas geralmente não é possível resolver as alterações conformacionais para baixo para o nível de uma estrutura secundária. Dinâmica de conformação de proteínas em solução em detalhes atómicas só pode ser resolvido por RMN, mas este método é ainda limitado a proteínas de tamanhos relativamente pequenos (geralmente ≤ 30 kDa) e necessita de altas concentrações de proteínas (≥ 100 pM), o que dificulta as experiências com oligomerização ou agregação de proteínas propensas 2. Um método queé capaz de ponte entre a alta resolução de cristalografia de raios-X e crio-electronmicroscopy e que não é limitado pelo tamanho ou a concentração de proteína é de hidrogénio amida-1 H / 2 H-troca (HX) em combinação com espectrometria de massa (MS). Nos últimos anos, este método tem desenvolvido para um instrumento analítico valioso para a análise da dinâmica das proteínas, o dobramento de proteínas, a estabilidade da proteína e alterações conformacionais 3-5. A base molecular deste método é a natureza lábil do backbone hidrogénios de amida em proteínas, que irá trocar com átomos de deutério, quando a proteína é colocada em um D 2 O solução. O consequente aumento da massa de proteína ao longo do tempo é medido com alta resolução MS. Em péptidos não estruturados curtas só HX depende da temperatura, da concentração do catalisador (OH -, H 3 O + por exemplo pH, ver Figura 3) e as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos adjacentes, devido à indutivo, gatoefeitos alytic e estéricos. Estes efeitos sobre o ch intrínseca taxa de permuta química k foram elegantemente quantificada por Bai et al. 6 e um programa está disponível (por cortesia Z. Zhang), que calcula k ch para cada aminoácido num polipéptido dependente do pH e da temperatura. Em pH neutro e temperatura ambiente k ch é da ordem de 10 -10 1 3 seg -1. Em proteínas dobradas HX pode ser 2-9 ordens de grandeza mais lento, principalmente devido a pontes de hidrogénio na estrutura secundária e a um grau menor devido ao acesso limitado de hidratadas OH - iões para o interior de uma proteína fortemente dobrado. HX em proteínas nativas, portanto, implica desdobramento, por permuta química parcial ou global e redobrando para o estado nativo de acordo com a equação (1) e as taxas de câmbio observadas k obs dependem da taxa de abertura op k, os cl k taxa de fechamento ea troca química intrínseca rate k ch de acordo com a equação (2). <img alt="Equações 1-2" src="/files/ftp_upload/50839/50839eq1-2.jpg" /> Sob condições de estado nativo k op é muito menor do k ch e pode ser negligenciada no denominador. Existem dois regimes cambiais extremos chamados EX1 e EX2. Se o cl k é muito menor do k ch (EX1) a taxa observada é praticamente igual à taxa de abertura e HX permite a observação imediata do desdobramento de um elemento estrutural. Tal regime cambial, onde todos os prótons amida troca de uma só vez aquando da abertura do elemento estrutural, é facilmente observáveis ​​em MS por uma distribuição bimodal dos picos de isótopos 7. Se k cl é muito maior do que k ch (EX2) a taxa observada é proporcional à k ch em que a constante de proporcionalidade é igual aos equilíbrios-desdobramento dobráveis ​​constante op K u = k </sub&gt; K / cl. Sob estas condições, muitos eventos de abertura e fecho são necessárias antes de todos os protões amida troca de deutério, que conduz a um aumento gradual da massa média, enquanto a distribuição isotópica permanece praticamente a mesma. O regime EX2 permite a determinação da energia livre de desdobramento ÄG u e, por conseguinte, a estabilidade de um elemento estrutural. Sob condição de estado nativo do regime EX2 é mais comum. Aumento do pH e da adição de agentes caotrópicos pode mudar o mecanismo de troca de EX1. Portanto, HX-MS pode ser utilizada para explorar termodinâmico, bem como os parâmetros cinéticos de dobragem de proteína e alterações conformacionais. Como mencionado acima HX é intrinsecamente pH e dependente da temperatura e meia-vida a troca de um protão exposta completamente solvente do grupo amida espinha dorsal é entre 5-400 ms a um pH fisiológico (pH 7,6) e 30 ° C, mas 10 min a&gt; 15 horas, com uma média de&gt; 2 horas a pH 2,9 e 0 °C (excepto para o protão da primeira estrutura de ligação amida de um polipeptídeo, que troca com uma meia-vida de aprox. 1-2 min). Sob tais condições lenta troca é possível para digerir a amostra usando proteases (por exemplo pepsina) que atuam nessas condições, sem perder todas as informações contidas nos dêuterons incorporadas. Desde a introdução de digestão péptica sob condições troca lenta, não apenas da cinética geral HX de proteínas de comprimento completo pode ser analisado, mas HX pode ser localizado em regiões específicas 8,9. A resolução espacial está limitado ao tamanho dos fragmentos gerados pépticas, que é, em geral, entre 10-30 resíduos. No entanto, fragmentos sobrepostos criados devido à natureza não específica da clivagem por pepsina pode levar a um aumento da resolução espacial. Além disso, várias outras proteases foram encontrados para ser activo em condições de têmpera, contudo, muito menos eficiente do que a pepsina 10. Além disso aumense de resolução espacial pode ser alcançado pela fragmentação de peptídeos em fase gasosa por meio de métodos que preservaram o padrão deuteração tais como a captura eletrônica de dissociação (ECD), transferência eletrônica de dissociação (ETD) e dissociação multiphoton infravermelho (IRMPD) 11-13. Estas técnicas de evitar a perda de resolução espacial devido à migração intramolecular de protões (&quot;scrambling&quot;), que é observada por dissociação induzida por colisão (CID) a técnica de fragmentação mais utilizada. No entanto, estes métodos requerem otimização para cada peptídeo individual e é, portanto, ainda bastante desafiador. HX-MS foi utilizada para analisar interacções proteína-ligando e de proteína-proteína, incluindo a montagem da cápside viral 14-17. Proteína desdobramento e redobrando assim como temperatura provocadas mudanças conformacionais foram investigados 7,18,19. Fosforilação e conformacional relacionada com mutação único aminoácido muda 16,20 e nucleotmudanças ide-induzidas foram analisados ​​21,22. Portanto, esse método parece idealmente adequado para analisar a montagem e dinâmica de máquinas moleculares. Um candidato atraente, cujo mecanismo é de grande interesse geral, é o complexo chaperone Hsp90.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maXis QTOF</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoAcquity UPLC</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu 10AD-VP</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-port Valve EPC6W with microelectric actuator</td>
			<td>Valco</td>
			<td>#EPC6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection valve (manual)</td>
			<td>Rheodyne</td>
			<td>#7725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros AL20 media</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-6029-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros R2</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-1118-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6887</td>
			<td>use fresh pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (1 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (2 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-130B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC BEH C8 Column</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td>#186002876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#5355000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (various diameters)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fittings</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#PK-110 with PK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry

Todos os processos celulares dependem da funcionalidade das proteínas. Embora a funcionalidade de uma dada proteína é a consequência directa da sua sequência de aminoácidos única, apenas é realizado pela dobragem da cadeia polipeptídica em um único arranjo tridimensional definido ou mais vulgarmente em um conjunto de conformações interconversão. Investigando a ligação entre a conformação da proteína e sua função é, portanto, essencial para um entendimento completo de como as proteínas são capazes de cumprir a sua grande variedade de tarefas. Uma possibilidade para estudar mudanças de conformação de uma proteína sofre, progredindo através do seu ciclo funcional é hidrogénio-1 H / 2 H-troca em combinação com espectrometria de massa de alta resolução (HX-MS). HX-MS é um método versátil e robusto que acrescenta uma nova dimensão às informações estruturais obtidas por cristalografia por exemplo. Ele é usado para estudar a proteína dobrando e desdobrando, a ligação da pequena molligantes ecule, interações proteína-proteína, mudanças conformacionais ligadas à catálise enzimática e allostery. Além disso, HX-MS é muitas vezes utilizado quando a quantidade de proteína é muito limitada, ou a cristalização da proteína não é viável. Aqui proporciona-se um protocolo geral para o estudo da dinâmica das proteínas com HX-MS e descrevem como um exemplo de como a interface para revelar a interacção de duas proteínas de um complexo.

Hsp90 é uma chaperone molecular em leveduras e membro da família acompanhante Hsp90. Ao passar por um ciclo de ATPase complexo que auxilia etapas de dobramento final de muitos clientes de proteína. Dobrável eficiente requer transferência de clientes de Hsp70 e interação do Sti1/Hop co-acompanhante. STI1 se liga diretamente a Hsp90 e facilita o cliente a ligação através da inibição da atividade ATPase da Hsp90. Interação da Hsp90 com STI1 foi estudada recentemente usando HX-MS 23. Aqui apresentam...

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

analyzing-protein-dynamics-using-hydrogen-exchange-mass-spectrometry

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18.2K visualizações.  University of Heidelberg.  Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos. 

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Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análise de respiração em tempo real usando o Nanoelectrospray secundário ionização acoplada a espectrometria de massa de alta resolução

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Química

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Corrosão por imagem na interface metal-Paint usando espectrometria de massa de íons secundários de tempo de voo

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

Reconstrução de perfil de profundidade 3D de impurezas segregadas usando espectrometria de massa de íons secundários

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Abordagens de espectrometria de massa de eletroforese capilar para caracterização da proteína e corona metabólica adquirida por nanomateriais

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforose capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...