Com este protocolo, introduzimos o primeiro método capaz de traçar simultaneamente múltiplas modificações de RNA em neurônios únicos, abrindo novas áreas de investigação envolvendo regulação pós-transcrição em células individuais. Ao aproveitar condições otimizadas de preparação da amostra e espectrometria de massa de cromatografia líquida, mais de uma dúzia de nucleosídeos modificados podem ser detectados e quantificados em um único neurônio por experimento. Células individuais são diferentes em termos de suas funções, morfologia e seus perfis químicos.
É importante que possamos medir o mosaico químico completo dessas células, incluindo seus perfis de RNA, para que células suficientes entendam suas diferenças, tanto na saúde quanto na doença. A extensão da preparação de gânglios antes do isolamento de um único neurônio depende das preferências do indivíduo que realiza o isolamento. Tente tratamentos de protease mais longos e mais curtos para identificar condições adequadas.
Para começar, coloque o lado ventral da Aplysia californica anestesiado em uma bandeja de dissecação. Comece a dissecá-lo usando uma tesoura cirúrgica com uma ponta cega posicionada em direção ao animal e cuidadosamente fazendo um corte longitudinal através do pé. Depois de fixar os lados rostral, caudal e lateral do corpo animal para expor os órgãos internos e o sistema nervoso central gânglios na cavidade corporal, isolar o gânglio do sistema nervoso central do animal cortando cirurgicamente nervos e alguns conectivos originários dos gânglios.
Mergulhe o gânglio em 10 miligramas por solução xiv tipo prosniliter de Streptomyces griseus e incubar por 30 minutos a uma hora a 34 graus Celsius. Em seguida, enxágue o gânglio seis vezes com solução artificial de antibiótico de água do mar. Em seguida, usando uma pipeta de transferência de polipropileno que foi cortada para uma abertura de cinco milímetros, transfira todos os gânglios em um prato revestido de polímero de silicone cheio com a solução artificial de antibiótico de água do mar.
Mantenha o gânglio sempre submerso em água do mar artificial. Em seguida, para remover as bainhas gânglios, fixar os gânglios e usar microscisores e fórceps finos. Com tratamento enzimático suficientemente forte, use agulhas de vidro ou metal para desempacotada.
Identificar visualmente os neurônios de interesse. Usando uma capilar de vidro agrupada ou agulhas de tungstênio afiadas, isole cuidadosamente a célula identificada do gânglio a granel. Depois de desenhar cerca de um microliter de água do mar artificial em uma micropipette plástica, transfira a célula isolada para um tubo de amostra PCR contendo quatro microliters de acetato de amônio molar de 0,365.
Para medições em branco, colete cinco alíquotas de microliter da solução artificial de antibiótico de água do mar do prato contendo o gânglio e misture com o tampão de digestão. Lise os neurônios isolados por aspiração repetida e dispensando uma micropipette em acetato de amônio molar de 0,365. Algumas células podem não se romper imediatamente.
Para lise-los, aplique pressão através do diâmetro da célula com um capilar de vidro agrupado. Em seguida, aqueça a amostra em um ciclo térmico antes de adicionar 3.375 microliters de tampão de digestão de RNA à amostra. Misture esta solução usando uma micropipette retirando e distribuindo a solução várias vezes.
Gire todas as gotículas líquidas agarradas às paredes do tubo PCR usando uma centrífuga de bancada em miniatura. Em seguida, incubar as amostras no ciclo térmico a 37 graus Celsius por três horas, seguida por um porão a 10 graus Celsius com a tampa aquecida definida para On.Uma vez que as amostras tenham esfriado, transfira imediatamente sete microlitradores da solução em um frasco de feixe automático equipado com uma inserção de 250 microliteres sem qualquer formação de bolha no tubo de autosampler. Para preparar o sistema de cromatografia líquida para separação dos nucleosídeos canônicos e modificados, equilibre uma coluna C18 usando 99% de fase móvel A e 1%fase móvel B a uma taxa de fluxo de 0,2 mililitros por minuto durante 12 minutos a 36 graus Celsius.
Opere o instrumento de espectrometria de massa no modo positivo com a válvula de desvio definida para resíduos durante os dois primeiros minutos de análise e para a fonte para o restante da corrida. Em seguida, colete espectros de massa sobre uma faixa m/z de 110 a 600. Selecione íons para dissociação induzido por colisão a 35 a 40 elétrons volts ao longo de um tempo de ciclo de três segundos usando uma lista de massa preferencial construída a partir do banco de dados e uma janela de isolamento de 0,5.
Use exclusão ativa para excluir íons da fragmentação após três espectros. Defina aquisição dinâmica de espectros MS/MS para íons com intensidades acima e abaixo de 50.000 contagens em quatro Hertz e um Hertz, respectivamente. E um limite mínimo para seleção de íons em 1.990 contagens.
Para análise quantitativa de modificação de RNA de neurônio único por espectrometria de massa, construa curvas de calibração usando áreas de pico de cromatógrama de íons extraídos obtidas para padrões nucleosídeos modificados em um mínimo de cinco concentrações para permitir a interpolação de concentrações endógenas endógenas desconhecidas. A análise de modificação do RNA do neurônio único por espectrometria de massa envolve o isolamento manual dos neurônios identificados em pequenos volumes amostrais para digestão de lise e análise de LC-MS/MS. Análise de modificação de RNA de neurônio único por espectrometria de massa rotineiramente detectada mais de uma dúzia de modificações de RNA em neurônios únicos do sistema nervoso central da Aplysia californica representando a cobertura de quase metade do epitransomo conhecido deste animal em uma única célula.
Os resultados revelaram pela primeira vez que os perfis de modificação do RNA de células únicas poderiam divergir das células a granel no mesmo tecido. Mais apoio para padrões nucleosídeos modificados únicos foi obtido a partir de uma coorte separada de animais nos quais comparações pareadas foram realizadas para 13 modificações de RNA, comumente detectadas tanto nos neurônios únicos quanto no tecido a granel. Modificações de RNA em células funcionalmente diferentes formaram clusters únicos no gráfico de pontuação enquanto neurônios R2/LPl1 homólogos co-agrupados.
O enredo de carregamento mostra que as diferenças foram impulsionadas principalmente pela abundância de isômeros posicionais de metiladenosina, incluindo 2'O-metiladenosine e N1-metiladenosine. Curvas de calibração externa foram geradas para N1-metiladenosine, pseudouridina, 2'O-metilguanosina, 2'O-metiladenosine e N6-dimetiladenosina. E a quantidade de cada nucleosídeo modificado nas células metacerebrais e pares de células R2/LPl1 foi determinada pela interpolação.
Certifique-se de que um volume mínimo de água do mar artificial seja transferido para o tubo PCR juntamente com o único neurônio isolado. Isso minimiza a diluição amostral, o que acaba afetando a detecção de analitos. Este protocolo pode ser usado para investigar distribuições de modificações de RNA em estruturas subcelulares, como axônios e dendritos, para melhorar a compreensão dos mecanismos de tradução local dependente da atividade.
