Name: microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers
Uploaded: 2017-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
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Este trabalho é patrocinado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (21674018), a pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFA0201702 /2016YFA0201700) e o "programa de Shuguang" suportado pelo desenvolvimento da educação de Shanghai Fundação e Shanghai Comissão Municipal de educação (15SG30), DHU distinto jovem Professor programa (A201302), os fundos de investigação Fundamental para as universidades Central e o projeto 111 (No.111-2-04).

atenção: favor consultar todas as fichas de dados de segurança relevantes antes do uso. Vários dos produtos químicos utilizados na preparação do molde são extremamente tóxicos. Por favor, use equipamento de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados).
 1. Microfluidic fiação de RSF solução aquosa <ol><li>Preparação de RSF aquoso girando droga 4 , 15 , 16 <ol><li>Decruagem do bicho da seda casulo <ol><li>Degum o Bombyx mori casulos duas vezes em soluções de aquosa (0,5% em peso em água) 3 CO 2 de at a 100 ° C por 30 min cada e em seguida, lave a seda com água desionizada para remover o sericin.</li>
		</ol></li> <li>Dissolving do casulo do bicho da seda degomado <ol><li>secar as sedas do casulo degomado em ar; em seguida, dissolver as sedas do casulo degomado em solução aquosa de 9,0 M LiBr com uma proporção de 01:10 (p/v) a 40 ° C durante 2 h. Por exemplo, adicionar 10 mL de LiBr por 1 grama seda ( Figura 1a).</li>
		</ol></li> <li>Centrifuging e filtragem <ol><li>diluir a solução RSF 1,5 vezes por água desionizada. Centrífuga e filtro para remover as impurezas. Centrifugar a solução RSF em frascos de 250 mL a 4 ° C por 10 min a 1,234.8 g. x filtrar a solução RSF usando um filtro de 20 µm e uma bomba de vácuo. Cama de papel de filtro duplo é preferível considerar o efeito de experimentação.</li>
		</ol></li> <li>Dialyzing <ol><li>Dialize a solução RSF em água deionizada a 5 ° C por 3 dias usando uma membrana semipermeável de celulose (MWCO: 14.000 ± 2.000). O volume total da solução RSF é cerca de 1 L, carregado em 4 sacos de diálise. Coloque estes sacos de diálise no balde, que é preenchido com osmose reversa 10L (RO) deionizada. 
			Nota: O valor de pH de água desionizada deve ser superior a 6, para evitar a gelificação durante o processo de concentração. O pH da água desionizada não requer ajuste para esse protocolo.</li>
		</ol></li> <li>Concentrating <ol><li>condensar a solução aquosa de RSF para 20% em peso, pelo fluxo de ar forçado em solução aquosa de 5 ° C. adicionar 3 M CaCl 2 para a solução RSF para 1,0 mmol/g concentração Ca 2 + final; em seguida, concentrar-se por ar forçado fluxo para 38-47% wt.</li>
			<li>Pesar uma gota de solução RSF sobre uma lâmina de vidro e em seguida, seque-o por 2 h em estufa a 105 ° C. 
			Nota: O peso por cento dos restantes sólidos em relação ao peso da gota antes de secagem é a concentração total de proteína e de CaCl 2. A concentração de RSF é derivada após dedução da massa de CaCl 2. Pelo menos quatro repetidas medições foram realizadas. Nossos estudos anteriores mostraram que a concentração de Ca 2 + grandemente afetado as propriedades reológicas e spinnability das soluções aquosas RSF. Entretanto, a adição de Ca 2 + solicitado a formação limitada de β-folha e a agregação dos RSF 17. Em uma droga de fiação nativo, CaCl 2 é considerado para desempenhar um papel importante durante o armazenamento da droga para evitar gelificação antes de girar a girar. 18</li></ol></li></ol></li> <li>preparação do chip microfluidic 8 , 19 <ol><li>preparando Fotomáscara <ol><li>Design do micro-channel em um Programa de CAD. Imprimir o arquivo CAD para produzir uma transparência de alta resolução 19.</li>
		</ol></li> <li>Preparando o molde <ol><li>limpeza da lâmina de vidro <ol><li>em uma capa de química, ferver a lâmina de vidro em solução de ácido sulfúrico concentrado misturada e 30 vol % peróxido de hidrogênio solução (10:1) por 20 min em uma chapa quente. 
				Cuidado: vapores de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio são extremamente tóxicos.</li>
			</ol></li> <li>Lavar a lâmina de vidro <ol><li>lave a lâmina de vidro com água desionizada e assoprar seque com nitrogênio de alta pureza.</li>
			</ol></li> <li>Filme de revestimento <ol><li>revestir o fotorresiste SU-8 sobre a lâmina de vidro por um dispositivo de revestimento Custom-Built com um intervalo de 100 µm entre a superfície inferior da barra de revestimento e a superfície superior do vidro.</li>
			</ol></li> <li>Spin revestimento <ol><li>espalhar o fotorresiste sobre a lâmina de vidro para formar um filme uniforme usando um aplicador girar a 40,3 x g por 30 s. A espessura do filme uniforme é cerca de 85 µm.</li>
			</ol></li> <li>Solidificação <ol><li>solidificar o fotorresiste em um forno com uma programa de controlo da temperatura. Elevar a temperatura de temperatura de 65 ° C, em 2 ° C/min e segurar a 65 ° C por 2 min. Continue ao calor de 65 ° C e 95° C e mantenha a 95 ° C durante 15 min. volta fora do forno e cool naturalmente para o quarto temperatura no forno.</li>
			</ol></li> <li>Ultravioleta luz exposição <ol><li>expor do lado do vidro deslize com o fotorresiste à luz ultravioleta para 12 s usando a transparência como uma Fotomáscara por fotolitografia 19. 
				Nota: O número de onda da luz ultravioleta é 365 nm e a energia de exposição é 273.6 mJ/cm 2. 
				Atenção: Tomar medidas apropriadas de segurança enquanto estiver trabalhando com luz UV e o forno.</li>
			</ol></li> <li>Solidificar o fotorresiste conforme descrito na etapa 1.2.2.5.</li>
			<li>Em desenvolvimento <ol><li>limpar o fotorresiste ultrassonicamente em solução de desenvolvedor para 30 s. Lave a lâmina de vidro por isopropanol e desenvolvedor, alternando entre os dois, até que não haja nenhuma precipitação sobre a lâmina de vidro.</li>
			</ol></li> <li>Solidificar o fotorresiste em um forno com uma programa de controlo da temperatura. Elevar a temperatura de temperatura para 170 ° C a 2 ° C/min e segure a 170 ° C por 30 min. volta fora do forno e cool naturalmente à temperatura no forno.</li>
		</ol></li> <li>Litografia macia <ol><li>despeje 8.8 pre-polímero líquido polydimethylsiloxane (PDMS) de g sobre o molde e cura por 30 min a 65 ° C, e 15 min a 80 discos pré-polímero de ° C. líquido PDMS consiste de PDMS e agente de cura (tipicamente de 10:1 (w/w)).</li>
		</ol></li> <li>Pancadas <ol><li>um buraco através da réplica PDMS no início do canal pela broca. O diâmetro da broca é de 1,2 mm.</li>
		</ol></li> <li>Selagem <ol><li>selar a réplica PDMS com o canal para uma camada lisa de PDMS sem padrão por um tratamento de plasma de oxigênio nas superfícies das duas camadas PDMS. 
			Nota: O processo de preparação geral do chip leva cerca de 72 h.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Fibra fabricação de RSF <ol><li>injeção de droga de giro <ol><li>injetar o RSF girando a droga para o microchannel 2 µ l/min por uma bomba de seringa.</li>
		</ol></li> <li>Regulamento do ambiente <ol><li>ajustar a umidade relativa de 40 ± 5% RH ou 50 ± 5% de ur usando um umidificador. Em 40 RH ± 5%, como-girado fibra solidificou-se mais rapidamente do que 50 ± 5% RH.</li>
		</ol></li> <li>Fibra de produção da RSF <ol><li>toque a gota RSF por um ponto na saída do canal microfluídicos, desenhar fibra RSF no ar e então puxe para um cilindro através de uma abertura de 10 cm de ar a uma velocidade de 3 cm/s ( Figura 1b ).</li>
		</ol></li> <li>Armazenar as fibras RSF em um dessecador selado por 24 h.</li>
		<li>Pós-tratamento de fibra <ol><li>desenha as fibras como-fiado 4 vezes em 0,9 mm s -1 em 80 vol % ethanol solução por uma máquina Custom-Built e depois manter a fibra desenhada fixo e mergulhe as fibras na solução por 1h. Devido a este tratamento, o comprimento da fibra foi mudado de originalmente de 15 mm a 60 mm.</li>
		</ol></li> <li>Preparação da amostra para a caracterização <ol><li>corrigir as fibras pós-tratado em um frame de papel com um calibre de 10mm de comprimento. Pelo menos 20 fibras são necessidade de medição, incluindo o ensaio de tracção, SEM, FTIR e WAXS. Os diâmetros das fibras pós-desenhada variam 5 a 10 µm. a Figura 1 mostra o diagrama esquemático da produção de fibra e caracterização de WAXD. As propriedades mecânicas das fibras RSF foram examinadas por um sistema de testes de material (25 ± 2) ° C e (45 ± 5) % de umidade relativa. A extensão de avaliar e medir o comprimento foram 2 mm/min e 1 cm, respectivamente.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Radiação síncrotron caracterização do cristalino estrutura de RSF fibra <ol><li>caracterização de radiação síncrotron 4 , 13 , 17 <ol><li>ajuste da trajetória <ol><li>ajustar o comprimento de onda dos raios-x e tamanho de ponto de 0,07746 nm e 3 x 2 µm 2, respectivamente. 
			Nota: O protocolo é executado usando a trajetória de BL15U1 na instalação de radiação síncrotron de Shanghai.</li>
		</ol></li> <li>Localização do ponto x-ray <ol><li>encontrar a localização do ponto x. 
			Nota: A localização do ponto x é ajustada pelo laboratorista na instalação de radiação síncrotron.</li>
		</ol></li> <li>Teste de amostra-padrão: dióxido de cério (CeO 2) <ol><li>testar um pó de 2 do CeO de amostra-padrão. O pó de 2 CeO foi caracterizado para calcular o centro do círculo e a distância entre a amostra para o detector.</li>
		</ol></li> <li>Preparação da amostra <ol><li>corrigir os filamentos RSF em paralelo com o outro no quadro de papel com um calibre de 10 mm de comprimento. Cole a moldura de papel na fase de testes. 
			Nota: Manter a fibra horizontal.</li>
		</ol></li> <li>SR-WAXD testes <ol><li>abrir o obturador <ol><li>fechar a porta da estação beamline depois de se assegurar que não há nenhuma pessoa na sala. Abrir o obturador da fonte do feixe de raios-x.</li>
			</ol></li> <li>Focusing <ol><li>mover a fibra ligeiramente até em foco. Ajustar a localização da fibra ao longo de x, y, z direção remotamente através de um software ( Figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Exposição da amostra <ol><li>mover a fibra remotamente através de um software, até que seja in loco o raio-x. Pressione o botão iniciar no software para expor a fibra para a trajetória de raios-x por 20 s ( Figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Fundo difração <ol><li>a difração de fundo o ar com o tempo de exposição de 20 s. mover a fibra longe a ponto de raio-x remotamente através de um software de teste. Imprensa o &#34; iniciar &#34; botão no software para expor a trajetória de raio-x para &#34; médio de ar &#34; por 20 s.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>De processamento de dados de SR-WAXD 13 <ol><li>calibração Software <ol><li>processar os dados WAXD usando FIT2D (V12.077). Calibrar o centro do círculo e a distância de amostra-para-detector usando os dados de difração do CeO em pó 2.</li>
		</ol></li> <li>Padrão de difração 2-D <ol><li>subtrair o fundo do ar no padrão de difração de fibra usando FIT2D (V12.077).</li>
		</ol></li> <li>Tamanho de cristalinidade e do cristalite <ol><li>integrar a intensidade de difração em função do espalhamento ângulo 2 θ. Execute deconvolução da integração intensidade pico automatizado separação software (versão 4.12) 12. O grau de cristalinidade, x, c, foi estimado a partir da relação: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56271/56271eq1.jpg" /> , onde eu c é a soma das intensidades integradas de picos de cristalina e eu um é a intensidade integrada do amorfo halo 4 , 11. A integração dos padrões de WAXD mostrou a largura do pico do [200], [020], [002] reflexões. A FWHM desses picos foram usados para determinar o tamanho do cristalite junto a um, b e c eixos usando Scherrer &#39; s fórmula 4.</li>
		</ol></li> <li>Determinação das orientações do cristalite <ol><li>calcular as orientações do cristalite e amorfo de acordo com integrações azimutal de (020) e (210) picos 11. A orientação cristalina pode ser calculada quantitativamente de acordo com Herman &#39; orientação s. Aqui, os dois (020) e picos (210) foram equipados com duas funções Gaussian. O mais estreito é para orientação cristalina e o outro mais amplo é para o material amorfo orientado 13. Aqui, as orientações do cristalite das fibras RSF foram comparadas usando a largura total no máximo meia (FWHM) dos picos de integrações azimutal (002).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Asakura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+structure+and+function+of+the+spinning+apparatus+in+the+silkworm+Bombyx+mori.">Some observations on the structure and function of the spinning apparatus in the silkworm Bombyx mori.</a> Biomacromolecules. 8 (1), 175-181 (2007).</li><li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+crystalline+spinning+of+spider+silk.">Liquid crystalline spinning of spider silk.</a> Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).</li><li>Zhou, G. Q., Shao, Z. Z., Knight, D. P., Yan, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures,+mechanical+properties+and+applications+of+silk+fibroin+materials.">Structures, mechanical properties and applications of silk fibroin materials.</a> Prog Polym Sci. 46, 86-110 (2015).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts Chem Res. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Knight, D. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Durante a diálise da solução RSF, o valor de pH é essencial para o processo de concentração a seguir. Se o valor de pH da água deionizada é menor que 6, a solução RSF será mais fácil do gel durante o processo de concentração. Para evitar a gelificação, CaCl2 é adicionado à solução RSF. A concentração de CaCl2 é 1 mmol / peso da RSF.
Nosso trabalho anterior demonstrou a possibilidade de microfluidic seco-fiação de uma solução aquosa de RSF<sup cl...

Aranha e bicho da seda podem produzir fibra de seda pendente de solução aquosa de proteína à temperatura e pressão. Fluxo de cisalhamento e extensional pode induzir a formação de cristais líquidos textura na glândula de seda1. Nos últimos anos, tem havido um grande interesse em imitar o processo de fiação da aranha para produzir fibras artificiais de alta resistência. No entanto, grandes quantidades de proteína de seda de aranha não podem ser produzidas com eficiência e economicamente pela agricultura aranhas devido ao canibalismo. Quantidades substanciais de seda do bicho da seda podem ser obtidas facilmente pela agricultura. Caso contrário, o bicho da seda e a aranha tem uma composição semelhante de processo e aminoácido de fiação. Portanto, seda fibroin bicho da seda é selecionado como um substituto para fiam seda artificial de animais por muitos pesquisadores.
Aranha e bicho-da-extrude solução da proteína através de seu duto de fiação em fibra no ar. As forças de alto estresse geradas ao longo do duto de fiação mais provável Estiquem as moléculas da fibroína de seda para um mais alargado de conformação2. Seda artificial fibras têm sido giradas usando fiação convencional de molhado e seco-fiação processos3,4, que não levam em conta as forças fluidas geradas no duto de fiação.
Primeiro, microfluidic abordagens foram usadas para investigar o conjunto de proteínas de seda5,6. Então, estudou-se através do corte e extensional forças7,8de modelagem microfluidic fabricação da RSF. Módulo de Young e diâmetro das fibras RSF podem ser sintonizados por microfluidic girando molhado, mas a resistência à tração da fibra desenhada foi inferior a 100 MPa7. Finalmente, fibras de alta resistência RSF foram preparadas com sucesso usando o método de fiação seca microfluídicos, mas o diâmetro da fibra é apenas de 2 µm8. Recentemente, girando molhado microfluidic foi utilizado com sucesso na produção de fibra de seda de aranha recombinante alta resistência. O desenho pós-girando no ar melhorou os defeitos superficiais e internos de fibra artificial9.
Neste estudo, é introduzido o melhorado microfluidic girando o processo para a fibra da RSF. Destina-se a imitar o processo de fiação de seda do bicho da seda, incluindo a droga de fiação, corte as forças e processo de fiação seca. Este método de fiação não só pode produzir a fibra de seda artificial de alta resistência, mas também pode ajustar o diâmetro da fibra. Em primeiro lugar, a RSF girando a droga foi cortado e alongado em um canal de biomimic com um decaimento exponencial de ordem segundo. Em segundo lugar, as influências de umidade relativa (RH) sobre a morfologia das fibras e propriedades foram estudadas no processo seco-fiação microfluidic10. Em comparação com a fieira de fiação convencional, nosso sistema microfluídicos é altamente biomimetic e pode ser usado para produzir fibra de alta resistência de soluções à temperatura ambiente pelo seco ou molhado, girando o método.
Devido a alta resolução, alto brilho e alta energia do radiação síncrotron microfoco raio-x, ele pode ser usado para caracterizar a microestrutura de uma única fibra com um diâmetro de vários micrômetros4,11 , 12 , 13 , 14. aqui, SR-WAXD técnica foi usada para calcular a cristalinidade, tamanho do cristalite e orientação cristalina das fibras da RSF.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. mori&lt;/em&gt; Cocoons</td><td>Farmer in Tongxiang, Zhejiang Province, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate, anhydrous, 99.8%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Lithium bromide, 99.1%</td><td>Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous, 96.0%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, 99.7%</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co.,Ltd., China</td><td>10009218</td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Developing solution</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Concentrated sulfuric acid</td><td>Pinghu Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>30 vol% hydrogen peroxide</td><td>Shanghai Jinlu Chemical reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Zhengxing Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Oxygen plasma treatment</td><td>DT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>&amp;nbsp;KD Scientific, USA</td><td></td><td>KDS 200P</td></tr><tr><td>Humidifier</td><td>SEN electric</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Driller</td><td>Hangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., China</td><td></td><td>bench drilling machine Z406c</td></tr><tr><td>Material testing system</td><td>Instron, USA</td><td></td><td>Model: 5565</td></tr><tr><td>PeakFit</td><td>Systat Software, Inc., USA</td><td></td><td>Version 4.12</td></tr></tbody></table>

microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers

O protocolo demonstra um método para imitar o processo de fiação do bicho da seda. No processo de fiação nativo, o duto de fiação contratantes permite que as proteínas de seda ser compacto e ordenada pelas forças de cisalhamento e alongamento. Aqui, um canal de microfluidic biomimetic foi projetado para imitar a geometria específica do duto de fiação do bicho da seda. Fiação da fibroína seda regenerada (RSF) dopada com alta concentração, foi expulso através da microchannel para fibras de spin e seco à temperatura e pressão. No processo de pós-Tratado, as fibras como-fiado foram desenhadas e armazenadas em solução aquosa de etanol. Radiação síncrotron difração de raios x de grande angular (SR-WAXD) tecnologia foi usada para investigar a microestrutura do única fibras RSF, que foram fixados a um suporte de amostra com o eixo de fibra RSF normal para o microbeam de raio-x. A cristalinidade, tamanho do cristalite e orientação cristalina da fibra foram calculadas a partir dos dados WAXD. Os arcos de difração perto do Equador do padrão bidimensional WAXD indicam que a fibra RSF pós-Tratado tem um grau elevado de orientação.

Fibras de alta resistência RSF foram produzidas com êxito usando o microfluidic girando o método. As curvas tensão-deformação e imagens SEM das fibras esticadas RSF C44R40 são mostradas na Figura 2. Pelo menos 10 fibras foram medidas no teste de tração. Curvas tensão-deformação foram escolhidas de acordo com o valor médio da quebra de tensão e deformação das fibras. Os dados WAXD das fibras são mostrados na Figura 3</stro...

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Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

Um protocolo para a fiação microfluidic e caracterização da microestrutura do monofilamento da fibroína seda regenerada é apresentado.

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

microfluidic-dry-spinning-characterization-regenerated-silk-fibroin

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.7K visualizações.  Donghua University. Um protocolo para a fiação microfluidic e caracterização da microestrutura do monofilamento da fibroína seda regenerada é apresentado.

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Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Silk Sistema de Cultura de Cinema para In vitro Análise e Desenho Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Bioengenharia

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly repetitive protein has a molecular weight of 48kDa and is soluble in different solvents (hexafluoroisopropanol (HFIP), formic acid and aqueous buffers). eADF4(C16) provides a high potential for various technical applications when processed into morphologies such as films, capsules, particles, hydrogels, coatings, fibers and nonwoven meshes. Due to their chemical stability and controlled morphology, the latter can be used to improve filter materials. In this protocol, we present a procedure to enhance the efficiency of different air filter devices, by deposition of nonwoven meshes of electrospun recombinant spider silk proteins. Electrospinning of eADF4(C16) dissolved in HFIP results in smooth fibers. Variation of the protein concentration (5-25% w/v) results in different fiber diameters (80-1,100 nm) and thus pore sizes of the nonwoven mesh.
Post-treatment of eADF4(C16) electrospun from HFIP is necessary since the protein displays a predominantly &alpha;-helical secondary structure in freshly spun fibers, and therefore the fibers are water soluble. Subsequent treatment with ethanol vapor induces formation of water resistant, stable &beta;-sheet structures, preserving the morphology of the silk fibers and meshes. Secondary structure analysis was performed using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and subsequent Fourier self-deconvolution (FSD).
The primary goal was to improve the filter efficiency of existing filter substrates by adding silk nonwoven layers on top. To evaluate the influence of electrospinning duration and thus nonwoven layer thickness on the filter efficiency, we performed air permeability tests in combination with particle deposition measurements. The experiments were carried out according to standard protocols.

Spider silk fibers display extraordinary mechanical properties. Engineered Araneus diadematus Fibroin 4 (eADF4) can be processed into nonwoven meshes using electrospinning. Here, the eADF4 nonwoven meshes are used to improve the performance of air filtering devices.

Filtro de ar de dispositivos, incluindo malhas não tecidos de electrospun Proteínas Recombinantes de seda de aranha

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Projetando proteína de seda-seda liga Materiais para aplicações biomédicas

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

Impressão de jato de tinta reativa e análise de propulsão de micro-agitadores autopropulsionados à base de seda

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Química

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

Formação de Material de Seda de Aranha Recombinante por Solvatação Aquosa Usando Calor e Pressão

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups may be utilized to study material-biomarker interactions i.e. act as biosensors with potential as single molecule detectors. We have developed an effective approach for preparing functional polymers where the functionality has the capacity of specifically binding with a model protein. In our model system, the functional group is 2,4-dinitrophenyl (DNP) and the protein is anti-DNP IgE (Immunoglobulin E). The functional polymer, &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenyl caproic][poly(ethylene oxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), is prepared by anionic living polymerization. The difunctional initiator utilized in the polymerization was prepared by electron transfer reaction of &alpha;-methylstyrene and potassium (mirror) metal. The 2-methoxystyrene monomer was added first to the initiator, followed by the addition of the second monomer, ethylene oxide, and finally the living polymer was terminated by methanol. The &alpha;,&omega;-dihydroxyl polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] was reacted with N-2,4-DNP-&isin;-amino caproic acid, by DCC coupling, resulting in the formation of &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenylcaproic][poly(ethyleneoxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). The polymers were characterized by FT-IR, 1H NMR and Gel Permeation Chromatography (GPC). The molecular weight distributions of the polymers were narrow (1.1-1.2) and polymers with molecular weights greater than 50,000 was used in this study. The polymers were yellow powders and soluble in tetrahydrofuran. A water soluble CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (dimethoxyethylene glycol) complex binds and achieves steady state binding with solution IgE within a few seconds. Higher molecular weight (water insoluble i.e. around 50,000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymers, containing 1% single wall carbon nanotubes (SWCNT) were processed into electroactive nanofibers (100 nm to 500 nm in diameter) on silicon substrate. Fluorescence spectroscopy shows that anti-DNP IgE interacts with the nanofibers by binding with the DNP functional groups decorating the fibers. These observations suggest that appropriately functionalized nanofibers hold promise for developing biomarker detection device.

An efficient approach for preparing nanofibers decorated with functional groups capable of specifically interacting with proteins is described. The approach first requires the preparation of a polymer functionalized with the appropriate functional group. The functional polymer is fabricated into nanofibers by electrospinning. The effectiveness of the binding of the nanofibers with a protein is studied by confocal microscopy.

Procedimento para a fabricação de nanofibras biofuncionais

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...

Biologia

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Neurociência

<meta charset="utf8"></head><body>Formação e Fixação de Membranas FN-Silk a Inserções de Cultura Celular

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using tissue culture inserts with a plastic membrane, which generates an apical and a basal side. Besides providing support for the cells, these membranes come far from emulating their native counterpart, the basement membrane, which is a nanofibrillar, protein-based matrix. In this work, we show a simple way to considerably improve the biological relevance of the tissue culture inserts by replacing the plastic membrane with one made from a pure recombinant functionalized spider silk protein. The silk membrane forms through self-assembly and will spontaneously adhere to a membrane-free tissue culture insert, where it can provide support for cells. Custom-designed tissue culture inserts can be printed using a standard 3D printer, following the instructions provided in the protocol, or commercial ones can be purchased and used instead. This protocol shows how the culture system with silk membranes in inserts is set up and, subsequently, how the same cell culturing techniques that are used with traditional, commercially available inserts can be implemented.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Aprimorando modelos de cultura de células in vitro com membranas de seda de aranha funcionalizadas recombinantes

Tissue culture inserts with plastic membranes are the golden standard in cell culture labs as permeable supports to establish cell layers and models of barrier tissues. Herein, we present a simple method to replace the plastic membrane with a more biologically relevant membrane made from a recombinant functionalized spider silk protein.

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...

Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

Resumo

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Silk Sistema de Cultura de Cinema para In vitro Análise e Desenho Biomaterial

Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório

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Projetando proteína de seda-seda liga Materiais para aplicações biomédicas

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Formação de Material de Seda de Aranha Recombinante por Solvatação Aquosa Usando Calor e Pressão

Procedimento para a fabricação de nanofibras biofuncionais

Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida