Também somos gratos à Fundação Michael J. Fox apoiar este estudo. Agradecemos à Fundação de Pesquisa - Flandres FWO (projeto FWO G.0666.09, companheirismo pesquisador sênior para JMT), o projeto Neuro-TARGET navegação fluvial SBO/80020, a KU Leuven (OT/08/052A e IOF-KP/07 / 001) por seu apoio. Esta pesquisa também foi apoiado em parte pelo Fundo Druwé-Eerdekens geridos pela Fundação Rei Balduíno para JMT.

<ol>
	<li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor.">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158 (2011).</li><li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization.">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li><li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+in+Parkinson's+disease.">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).</li><li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dominant+parkinsonism;+the+toxic+triangle+of+LRRK2,+alpha-synuclein+and+tau.">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li><li>Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Roco+protein+family:+a+functional+perspective.">The Roco protein family: a functional perspective.</a> FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).</li><li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease+gene+LRRK2:+evolutionary+and+structural+insights.">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li><li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2.">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li><li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+LRRK2:+from+kinase+to+substrate.">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li><li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2.">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson's+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization.">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li><li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2/dardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1.">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li><li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding.">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li><li>Dani&#235;ls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li><li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers.">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472 (2012).</li><li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain.">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro.">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags.">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).</li><li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Monoclonal+Antibodies.">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity.">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li><li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations.">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson's+disease.">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153 (2011).</li><li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser(910)/Ser(935),+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization.">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li></ol>

Autores têm nada a revelar.

Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade proteínas marcadas LRRK são expressos em células HEK293T, que são expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assi...

Leucina rico repetição quinases 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) são parálogos vários domínios que partilham uma organização de domínio semelhante. Ambas as proteínas de codificar uma sequência de GTPase semelhante à família Ras de GTPases (Ras de proteínas complexas, ou ROC), bem como um C-terminal do domínio ROC (CR), de forma eficaz classificando ambas as proteínas para a família de proteínas ROCO 5,6. N-terminal do domínio em tandem ROC-COR, ambas as proteínas codificar um domínio de repetição rica em leucina, bem como um domínio de anquirina semelhante, ao passo que apenas LRRK2 codifica um tatu adicional Domein 6-8. C-terminal de ROC-COR, ambas as proteínas partilham um domínio de cinase de serina-treonina, enquanto apenas LRRK2 codifica um domínio WD40 na região C-terminal 8. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto que a evidência genética aponta para um papel para LRRK2 na patogénese da doença de Parkinson 3,4. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; A fosforilação de proteínas é um mecanismo de regulação comum em células. Por exemplo, a fosforilação pode ser essencial para a activação de enzimas ou para o recrutamento de proteínas de um complexo de sinalização. A fosforilação celular de LRRK2 foi extensivamente caracterizado e mapeamento phosphosite mostrou uma maioria dos locais de fosforilação celular ocorra em um agrupamento entre a repetição de anquirina e leucina ricos domínios de repetição 9-11. Embora LRRK1 locais de fosforilação celular ainda tem de ser mapeada, evidências a partir de estudos utilizando coloração fosfoproteína de manchas de proteína LRRK1 imunoprecipitada a partir de células COS7 sugere que a proteína LRRK1 é fosforilado nas células 12. Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade marcado LRRK proteins são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. O marcador de afinidade (3xflag) é então usado para isolar as proteínas LRRK de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water</td>
 <td>Perkin Elmer</td>
 <td>NEX011001MC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11971-025</td>
 <td>This medium contains no phosphates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti Flag M2 affiinty gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td>For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra thick blotting filter</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>1703965</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ponceau S solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7170</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of leucine rich repeat kinases 1 and 2 with radioactive phosphate

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são parálogos que partilham uma organização do domínio semelhante, incluindo um domínio de serina-treonina cinase, um complexo de Ras de proteínas de domínio (ROC), um C-terminal do domínio ROC (CR), e repetições de anquirina-como no N-terminal rica em leucina e. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto LRRK2 está implicada na patogénese da doença de Parkinson 3,4. Neste relatório, apresentamos um protocolo para identificar as proteínas LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir os níveis globais de fosforilação destas duas proteínas nas células. Em resumo, proteínas marcadas com afinidade LRRK são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilado pelas células depois de apenas algunshoras de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. Através da etiqueta de afinidade (3xflag) as proteínas LRRK são isolados a partir de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para monitorar a fosforilação de qualquer outra proteína que pode ser expresso em células e isolado por imunoprecipitação.

<html> A fim de comparar os níveis globais de fosforilação de LRRK1 e LRRK2 nas células, 3xflag marcado LRRK1 e LRRK2 foram expressos em células HEK293T 15. As células foram cultivadas em placas de 6 poços e marcado com 32 P e analisados ​​como descrito acima no texto do protocolo. Figura 1 mostra os resultados representativos para a marcação metabólica das LRRK1 e LRRK2 em células HEK293T. Incorporação de fosfato radioactivo é observada tanto para LRRK1 e LRRK2. A...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate at JoVE.com

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Radioactivity and Nuclear Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

9.9K visualizações.  KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND).  Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular. 