O autor é um Reino Unido de Parkinson Research Fellow (concessão F1002). Este trabalho foi financiado em parte pelo convite Wellcome Trust / MRC conjunta no prêmio Neurodegeneração (WT089698) para Consórcio de Parkinson do Reino Unido de Doenças (UKPDC), cujos membros são do Instituto UCL de Neurologia, da Universidade de Sheffield e da MRC Unidade de fosforilação de proteínas em da Universidade de Dundee.

Segurança O protocolo descrito a seguir utiliza ATP marcado com P 32 radioativo na posição de fosfato γ seguir a atividade da quinase de LRRK2. É baseado em protocolos padrão utilizado em nosso laboratório, e assim em relação a muitas das etapas do processo, como corrida, os géis, western blotting et cetera os materiais e condições precisas deve ser tomado como um guia de como o equipamento e os protocolos utilizada para estes processos varia de laboratório para laboratório. Compostos contendo isótopos que emitem radiação ionizante são potencialmente prejudiciais para a saúde humana e licenciamento e regulamentos estritos em um controle de nível institucional e nacional o seu uso. Os experimentos deste protocolo foram realizados após o treinamento em uso de fonte aberta de radiação no University College London e seguir as orientações de boas práticas de laboratório fornecidos pelos serviços de segurança na faculdade (diretrizes available em <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). Uso de radiação de código aberto não deve ser tentada antes da formação adequada e aprovação dos órgãos reguladores. A entidade reguladora responsável pela radiação de fonte aberta em pesquisas de laboratório varia de país para país. Exemplos destes são: no Reino Unido, o Health and Safety Executive ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> ), nos Estados Unidos, a Comissão Reguladora Nuclear ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / materiais / miau / regs-guias-comm.html</a> ), no Canadá, o Canadian Nuclear Safety Commission ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ), e na Alemanha Das Bundesamt für Strahlenschutz ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">http : / / www.bfs.de / de / bfs</a> ). Usuários de outros países devem confirmar regras, regulamentos e autoridades de licenciamento com seu oficial de segurança de radiação. Precauções de segurança relevantes para este protocolo foram anotados no texto, destacados com o símbolo do trevo radioativo ( <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> ). 1. Preparando as reações quinase <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Todas as misturas de reação preparado em tubos de amostra de 1,5 ml com tampa de rosca contendo um anel de vedação para impedir a propagação da radioatividade. <ol><li> Proteína descongelar em gelo - LRRK2 tipo selvagem, D1994A, G2019S. </li><li> compõem reação no gelo - 10nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul de tampão 10x quinase, composta de 50μl com água. </li></ol> 2. Execução do ensaio <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Todos os passos utilizando 32 P ATP deve tomar prendas em áreas de radiação designado. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Equipamentos de protecção individual adequado deve ser usado - sob procedimento operacional padrão em nosso laboratório incluem jaleco, luvas e óculos de proteção dupla. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Amostras contendo 32 P ATP devem ser protegidos por telas de usuários 6 milímetros Perspex para minimizar a exposição. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Se for o caso, os dispositivos de monitoração pessoal devem ser utilizados - dentro UCL, qualquer usuário radiação open source certificadas devem ter um crachá filme para monitorar a exposição à radiação durante as experiências. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Todas as superfícies experimentais devem ser avaliados para a contaminação radioativa antes e após o uso utilizando um Geiger balcão. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Todos os consumíveis potencialmente contaminados devem ser eliminados de estrita observância às diretrizes institucionais para a eliminação de resíduos radioativos. <ol><li> Antes de iniciar ensaio, definir blocos de aquecimento a 30 ° C e 100 ° C, respectivamente </li><li> Remover 32 P ATP de -20 freezer (note que as condições de armazenamento fro 32 P ATP pode variar dependendo do fornecedor ou tipo de radionucleotides utilizado). <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> scan fora do recipiente antes de usar, descongele por trás da tela de acrílico. </li><li> Com as reações sobre o gelo, adicione 1μl de 32 P ATP para cada juntamente com 10μM de frio ATP. </li><li> Misture bem com uma pipeta. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Centrífuga de pulso para levar líquidos para baixo do tubo, minimizando o risco de contaminação. </li><li> Remover alíquota de 15μl zero vírgula um tempod terminar reação na alíquota através da adição de 5μl de tampão de amostra SDS 4x e desnaturação a 100 ° C por 10 minutos. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Centrífuga de pulso para levar líquidos para baixo do tubo, minimizando o risco de contaminação. </li><li> Amostra restante colocado em bloco de aquecimento e incubados a 30 ° C por 60 minutos. </li><li> 15μl removido em 60 minutos e ponto de tempo de reação interrompida pela adição de 5μl de tampão de amostra SDS 4x e desnaturação a 100 ° C por 10 minutos. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Centrífuga de pulso para levar líquidos para baixo do tubo, minimizando o risco de contaminação. </li></ol> 3. Immunoblotting das amostras e análise de resultados <ol><li> Amostras executado em SDS-PAGE <ol><li> 10 também em gel de poliacrilamida 4-12% Bis-tris preparado para eletroforese usando tampão de corrida MOPS. </li><li> 20μl de cada amostra carregado em gel junto com farelos de 7μlTain escada proteína padrão. </li><li> Gel funcionar em 160V por 90 minutos, ou até frente de corante atingiu o final do gel. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Todo o líquido em contato com radioisótopos devem ser tratados como resíduos radioactivos e eliminados de acordo com as diretrizes institucionais. UCL regulamentações estatais que os resíduos radioativos líquidos devem ser descartados derramando abaixo designados sumidouros disposição radioativo com água abundante. </li></ol></li><li> Proteínas de membrana PVDF transferido para via western blot. <ol><li> Buffer de transferência preparado, 1x Tris Glycine além de metanol 20%. PVDF membrana e papel filtro de corte para corrigir tamanho para gel e ativada com metanol glacial no caso da membrana ou pré-molhada com buffer de transferência no caso do papel de filtro. A membrana deve ser pré-marcados com tinta esferográfica para permitir a identificação da orientação. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo 1" /> Gel removido plastic revestimento e excesso de acrilamida removidos e eliminados como resíduos radioactivos. </li><li> O gel deve ser formado em um sanduíche com a membrana e papel de filtro, garantindo que não existem bolhas entre a membrana eo gel, e depois organizados no aparelho de western blot com a membrana entre o gel eo ânodo. </li><li> Transferência realizada em 25V por 16 horas. </li></ol></li><li> Após a transferência de proteína para PVDF, a membrana devem ser secas à temperatura ambiente. Finalmente, a membrana seca devem ser isolados entre as folhas de acetato de celulose e expostos a qualquer uma tela de fósforo ou x-ray filme para permitir a detecção de proteínas marcado radioactivamente. Tempo de exposição pode ser executado a partir de várias horas para mais de uma semana, dependendo da atividade específica do radioisótopo usado ea cinética enzimática da reação. </li><li> Phosphoscreen digitalizadas / filme processado. Se estiver usando uma tela de fósforo, a imagem deve ser salva como um TIFF de alta resolução ou arquivos bitmap, se estiver usando filme, então a transição resultantesparency devem ser verificados usando um scanner de mesa e salvo como um TIFF de alta resolução ou arquivos bitmap. A imagem pode então ser analisada em ImageJ, um programa freeware disponível no site da National Institutes of Health ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. Resultados representante A Figura 1 mostra resultados representativos para um ensaio realizado com o tipo selvagem, e G2019S D1994A LRRK2 com proteína básica da mielina como substrato aceitador de fosfato de genéricos. Autofosforilação de LRRK2 é visível em ≈ 200kDa, com várias bandas que representam MBP fosforilada visível a partir de 20 40kDa. Observe a ausência de autofosforilação na pista D1994A (quinase mortos), e aumento da fosforilação devido à mutação G2019S. Nota fosforilação também residual de MBP na pista quinase mortos. Isto pode ser devido à ablação incompleta da atividade da quinase de LRRK2 pelo mutante D1994A ou refletir a presença of trace contaminando quinases na reação. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1.

<ol>
	<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).</li><li>Paisan-Ruiz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44, 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44, 601-607 (2004).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity.">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease+causing+LRRK2+mutation+I2020T+is+associated+with+increased+kinase+activity.">The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R1441C+mutation+of+LRRK2+disrupts+GTP+hydrolysis.">The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+is+required+for+the+toxic+effects+of+mutant+LRRK2/dardarin.">Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin.</a> Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).</li><li>Smith, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+of+mutant+LRRK2+mediates+neuronal+toxicity.">Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity.</a> Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+selective+inhibitor+of+the+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2.">Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).</li><li>Lee, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+leucine-rich+repeat+kinase-2+protect+against+models+of+Parkinson's+disease.">Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease.</a> Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).</li><li>Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+inhibitors+of+LRRK2,+a+protein+kinase+mutated+in+Parkinson's+disease.">Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease.</a> The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).</li><li>Anand, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+leucine-rich+repeat+kinase+2:+enzymological+properties+and+novel+assays.">Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays.</a> FEBS. J. 276, 466-478 (2009).</li><li>Daniels, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).</li><li>Jaleel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+phosphorylates+moesin+at+Thr558;+characterisation+of+how+Parkinson's+disease+mutants+affect+kinase+activity.">LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity.</a> Biochem. J. , (2007).</li><li>Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrrk2+phosphorylates+alpha+synuclein+at+serine+129:+Parkinson+disease+implications.">Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).</li><li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+4E-BP+by+LRRK2+affects+the+maintenance+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease-associated+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+is+a+dimer+that+undergoes+intramolecular+autophosphorylation.">The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este artigo descreve um protocolo básico para ensaio de atividade da quinase de LRRK2 usando um sistema in vitro. No interesse da brevidade, esta tem sido limitada a um modelo de ponto final de uma hora utilizando um substrato genérico, mas o protocolo geral é aplicável a uma gama de substratos potenciais e passíveis de análises mais sofisticadas examinar a cinética da atividade de quinase de LRRK2 . Isso destaca uma das principais vantagens da utilização de um sistema in vitro para analisar o comportamento de uma proteína quinase como esta: porque não há controle total sobre as concentrações da enzima e do substrato, é possível gerar dados cinéticos K m e calcular e V max para a reação. Para informações mais detalhadas avaliações cinética ou avaliar o impacto dos inibidores putativos, um sistema de maior rendimento (como o que é garantida pela utilização do substrato LRRKtide, disponível a partir Invitrogen) é uma alternati superioresve para a abordagem descrita aqui. É importante, no entanto, reconhecer que o sistema fornecido pelo modelo reducionista em ensaios in vitro quinase é apenas uma ferramenta para examinar a biologia de uma quinase e suas relações com substratos em potencial. Dados de ensaios como este deve ser usado em conjunto com outras abordagens para obter um quadro abrangente de como se comporta uma quinase in vitro e em um contexto celular. Por exemplo, um substrato putativo fosforilado in vitro podem ser analisados ​​por espectrometria de massa para identificar phosphosites possíveis que podem ser manipulados por mutagênese alvo (por exemplo, serina. Converter ou resíduos de fosfato de treonina aceitador a ninguém-fosforilável resíduos, tais como alanina) para examinar o funcional conseqüências do ex vivo fosforilação. Uma consideração importante na interpretação dos dados a partir de um sistema de análise in vitro, como este é a probabilidade de either tipo I ou II (falso negativo ou falso positivo) erros. A natureza reducionista deste sistema, infelizmente, dispõe que para ambos - no caso do primeiro, tendo um substrato purificado e purificado putativo quinase em proximidade estreita artificialmente e em alta concentração (em comparação com o meio celular) pode resultar em eventos de fosforilação artefactual. Por outro lado, muitas quinases funcionam como parte de um complexo dentro do contexto da célula, e exigem co-fatores para a fosforilação de um determinado substrato para ocorrer. Como observado acima, um resultado positivo de fosforilação de um substrato utilizando um suposto sistema in vitro deve ser testado em um sistema celular para validar o resultado, e um resultado negativo devem ser interpretados com cautela. Em vista disso, é fundamental sempre que possível ter os controles positivos e negativos para permitir um estudo comparativo da atividade quinase do seu interesse. A seleção cuidadosa de um contro positival que tem uma atividade conhecida para a sua proteína de interesse, juntamente com um controle negativo que é improvável que fosforilar o substrato putativo, é extremamente valioso. Um controle candidato para LRRK2 é Receptor interagindo quinase 3, que tem uma seqüência estreitamente relacionado primário para o domínio quinase de LRRK2, mas tem uma estrutura de domínio geral muito diferente de 18 anos. Este está disponível como proteína recombinante de Invitrogen e é usado como um controle padrão em nosso laboratório. Também deve ser notado que a forma comercialmente disponível de LRRK2 falta o N-terminal da proteína e é marcado com glutationa-s-transferase e isso deve ser levado em consideração como um fator potencial de confusão na realização de ensaios com essa proteína quinase, como não se sabe qual o papel que o N-terminal de LRRK2 pode jogar na função normal da proteína. Se, por exemplo, a porção N-terminal de LRRK2 que está ausente na proteína utilizada neste protocoloé fundamental para o recrutamento de um substrato específico para o domínio da quinase LRRK2 então isso terá um impacto importante sobre a fosforilação observado de substrato disse no sistema in vitro descrito acima. Mesmo com essas ressalvas, no entanto, a importância atribuída à biologia do LRRK2 na pesquisa de Parkinson destaca a utilidade deste protocolo como uma ferramenta valiosa para investigar o comportamento dessa proteína em uma configuração em vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> LRRK2 tipo selvagem </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> G2019S LRRK2 </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer de quinase </td><td> Sinalização celular </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> Sigma </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32P g ATP </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mMole </td></tr><tr><td> Tampão de amostra 4x LDS </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Padrões de proteína </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de corrida MOPS </td><td> InvitrOgen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-tris gel de acrilamida </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 4-12% 1 milímetro 10well </td></tr><tr><td> PVDF membrana </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer de transferência </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes Destilada e água desionizada foi utilizada para todas as etapas de diluição <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de equipamento </td><td> Companhia </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Contador Geiger </td><td> Mini Instruments </td><td></td></tr><tr><td> SDS PAGE tanque </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Tanque de transferência </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Blocos de calor (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Fósforo da tela </td><td> GE </td><td> X-ray filme pode ser substituído </td></tr><tr><td> Phosphor imager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Cassete exposição </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Perspex blindagem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 1,5 ml </td><td> VWR </td><td> Tampa de rosca com anel </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Equipamento

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

Leucina Quinase Repita Rico 2 (LRRK2) é um aminoácido 2527 membro da família ROCO de proteínas, possuindo um complexo, a estrutura de vários domínios, incluindo um domínio GTPase (denominado ROC, por Ras Complexo de proteínas) e um domínio quinase 1. A descoberta em 2004 de mutações em LRRK2 que causam a doença de Parkinson (DP) resultou em LRRK2 sendo o foco de um grande volume de pesquisas sobre a sua função normal e como a proteína vai mal no estado de doença 2,3. As investigações iniciais sobre a função do LRRK2 focada em suas atividades enzimáticas 4-6. Embora uma imagem clara ainda a emergir de uma alteração consistente nestes devido a mutações, dados de um número de grupos destacou a importância da atividade da quinase de LRRK2 na morte da célula ligada a mutações 7,8. Publicações recentes relataram inibidores visando a atividade da quinase de LRRK2, fornecendo uma ferramenta fundamental experimental 9-11. À luz destes dados,É provável que as propriedades enzimáticas de LRRK2 nos proporcionar uma importante janela para a biologia desta proteína, embora se eles são alvos potenciais para drogas de Parkinson é aberto a debate. Um número de diferentes abordagens têm sido usadas para ensaio da atividade da quinase de LRRK2. Inicialmente, os ensaios foram realizados com proteínas tag epítopo overexpressed em linhagens de células de mamíferos e immunoprecipitated, com os ensaios realizados utilizando essa proteína imobilizada em esferas de agarose 4,5,7. Posteriormente, purificada fragmentos recombinantes de LRRK2 em solução também têm sido utilizados, por exemplo, um fragmento de GST tag purificada a partir de células de inseto contendo resíduos 970-2527 LRRK2 de 12. Recentemente, Daniels et al. Relatado o isolamento de LRRK2 comprimento total em solução de células embrionárias do rim, porém esta proteína não é amplamente disponível 13. Em contraste, a fusão GST truncado forma de LRRK2 é comercialmente available (a partir de Invitrogen, ver Tabela 1 para detalhes), e fornece uma ferramenta conveniente para demonstrar um ensaio para LRRK2 atividade da quinase. Várias saídas diferentes para LRRK2 atividade da quinase têm sido relatados. Autofosforilação de LRRK2 em si, a fosforilação da proteína básica da mielina (MBP) como substrato genérico quinase e fosforilação de um substrato artificial - LRRKtide apelidado, com base na fosforilação da treonina 558 em Moesin - foram todos utilizados, assim como uma série de supostas substratos fisiológicos incluindo α-sinucleína, Moesin e 4-EBP 14-17. O status destas proteínas como substratos para LRRK2 ainda não está claro, e como tal o protocolo descrito a seguir incidirá sobre o uso do MBP como substrato genérico, destacando a utilidade deste sistema para ensaio de atividade quinase LRRK2 dirigido contra uma ampla gama de substratos em potencial.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro at JoVE.com

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste artigo,<em&gt; In vitro</em&gt; Assaying da atividade da quinase de LRRK2 e uma seleção de seus mutantes é descrito, fornecendo um sistema experimental para analisar a fosforilação de substratos putativa e disfunção potencial de LRRK2 na doença.

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

assaying-the-kinase-activity-of-lrrk2-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.5K visualizações.  UCL Institute of Neurology. Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste artigo, In vitro Assaying da atividade da quinase de LRRK2 e uma seleção de seus mutantes é descrito, fornecendo um sistema experimental para analisar ...

Vídeo: Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Biologia

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.