PLP é um Investigador Associado do Centro de Investigação em Saúde da Sanford Children. Este trabalho foi suportado pelos seguintes subvenções a PLP: R01AR056712, R01AR052779 e P30 AR061303 do Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Artrite e musculosqueléticas Saúde e Doenças da pele (NIAMS), MDA e Sanford Children prêmio Health Research. Este trabalho tem, em parte, beneficiaram de financiamento da investigação de Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia no projeto FP7-Saúde - 2009 ENDOSTEM 241440 (Ativação da vasculatura células-tronco associadas e células-tronco musculares para a reparação e manutenção do tecido muscular) SA foi apoiado por. comunhão CIRM.

1. Infecção de hESCs Este protocolo requer alta lentivírus titulação codificação BAF60C e MyoD 13. Estas construções estão disponíveis mediante solicitação. <ol><li> Recomendações antes de iniciar <ol><li> A fim de assegurar uma elevada eficiência de infecção, hESCs placa para infecção em condições livres de alimentação (Figura 2A) para eliminar concorrentes celulares durante a absorção do vírus. De fato, MEFs são notoriamente mais fácil para infectar, em comparação com hESCs e são competentes para a conversão mediada por MyoD. Assim, eliminando MEFs a partir de culturas de hES aumenta a taxa de infecção. </li><li> Recomenda-se a ter os lentivírus título elevado para garantir uma elevada eficiência de infecção. Opções para melhorar a eficiência de infecção são discutidos na seção &quot;verificando a infecção&quot;. </li><li> Prepare a placas revestidas com matrigel por adição de 1 ml de 1 mg / ml de Matrigel em cada poço e deixar pelo menos 1 hora à temperatura ambiente (ou S / N selado a 4 ° Cse preparado no dia anterior). </li></ol></li><li> Procedimento Infecção <ol><li> Dia antes da infecção <ol><li> Adicionar hES celular clonagem e recuperação suplemento no meio de diluição de 1.000 X (2 mM de concentração final). </li></ol></li><li> Dia 0 - Infecção por BAF60C Nota: Execute a infecção de hESCs com BAF60C primeiro, seguido por infecção com MyoD. <ol><li> Dissociar um poço de uma placa de 6 poços de hESCs cultivadas como colónias em 14 uma suspensão de células individuais por incubação com 1 ml de TrypLE para 5 min a 37 ° C. </li><li> Transferência de suspensão para um tubo de 15 ml, adicionar 9 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas e centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm. </li><li> Durante a centrifugação, preparar a mistura de infecção em um tubo limpo pela adição de 1 ml de mTeSR1, polibreno (6 mg / ml) e hES celular clonagem e recuperação de suplemento (2 mM). </li><li> Re-suspender o sedimento de células (cerca de 5 x 10 5 x 10 -1 6 células de um confluent bem de hESCs) com 1 ml de mistura de infecção e da placa para uma placa de fixação de 6 poços de baixo, o que impede que as células de aderir ao plástico. </li><li> Adicionar BAF60C-IRES-GFP vírus em 10 8 MOI e incubar 3 horas na incubadora </li><li> Recolha a suspensão de células contendo vírus e dividir igualmente em duas cavidades revestidas com matrigel. Em seguida, adicionar 2 ml de mTeSR1 + hES celular clonagem e recuperação suplemento a cada poço e deixou S / N na incubadora. </li></ol></li><li> Dia 1 <ol><li> Retire cuidadosamente o meio contendo o vírus e substituir com 2 ml de mTeSR1and hES celular Clonagem e Recuperação Suplemento. As células começarão a aglutinação, como mostrado na Figura 2B. </li></ol></li><li> Day2 - Infecção por MyoD <ol><li> Antes de continuar verifique o status de fluorescência das células sob um microscópio de fluorescência para certificar-se de ter uma alta eficiência de infecção. Se não, veja a seção &quot;verificando infectarion &quot;. </li><li> Se as células atingiram pelo menos 80% de confluência, proceda da seguinte forma; caso contrário, esperar por mais um dia antes de prosseguir. </li><li> Retire a médio e adicione 1 ml de reagente TrypLE dissociar as células. Incubar 5 min a 37 ° C. </li><li> Repita conforme descrito from1.2.2.2 - 1.2.2.6 acrescentando vírus MyoD em 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Dia 3 <ol><li> Retire cuidadosamente o meio contendo o vírus e substituir com 2 ml de mTeSR1and hES celular Clonagem e Recuperação Suplemento. </li><li> MEFs placa em placas revestidas com matrigel a 2,5 x 10 5 / cm 2 para o dia seguinte, para permitir a propagação das células infectadas. </li></ol></li><li> Dia 4 <ol><li> Retire a médio e adicione 1 ml de reagente TrypLE dissociar as células. Incubar 5 min a 37 ° C. </li><li> Transferir as células num tubo de Falcon de 15 ml, adicionar 9 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas e centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm. </li><li> Remover o sobrenadante e re-suspensão em 6 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. </li><li> Remover o meio do MEFs contendo placa de 6 poços e hESCs placa na razão de 1:2 de divisão, dispensando 3 ml para cada MEFs contendo bem. Dica! Quando as colônias atingir confluência, alguns dos poços de células MyoD/BAF60C-infected pode ser congelado em nitrogênio líquido como um estoque de reserva. Meio de congelamento inclui 90% dos KOSR e 10% DMSO mais 2 hES mM celular Clonagem e Recuperação Suplemento. Os restantes poços pode ser, em seguida, exposta ao protocolo de diferenciação - ver abaixo a descrição. Se mais células são necessárias para produzir mais myospheres, hESCs infectadas podem ser propagadas ainda como se segue: </li><li> Remover o meio e incubar com 1 mL de 1 mg / ml de colagenase IV, durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Remover colagenase IV e adicionar 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. </li><li> Sob um microscópio de dissecação raspar as colônias com uma gorjeta de 10 ml. </li><li> Recolher os pedaços de colonizaçãoes em um tubo de 15 ml e permitem-se sedimentar durante 3 min. Em seguida, retire o sobrenadante, ressuspender em hESC médio e placa em MEFs placas usando uma proporção 01:04. </li></ol></li></ol></li><li> Verificando infecção <ol><li> Enquanto propagação das células, recomenda-se ao prato as células infectadas em menor escala para a colheita para análise RNA e realizar a análise de expressão de proteínas por imunofluorescência, a fim de verificar a existência de biomarcadores que reflitam o estado biológico adequada em cada estádio (ver resultados representativos). Para lentivírus título elevado a percentagem de células infectadas esperados deve ser, pelo menos, 80%. </li><li> Para garantir uma elevada eficiência, os vectores lentivirais podem ser modificados, a introdução de um marcador de selecção de fluorescência e / ou uma resistência a antibióticos. Nossa plasmídeo lentiviral expressando BAF60C também transporta fluorescência da GFP. </li><li> Triagem hESCs para um marcador fluorescente. No caso de baixa eficiência de infecção é recomendado o uso de fluorescência de umacélulas ctivated (FACS-ordenação) para enriquecer as células que expressam vírus BAF60C e depois infectar as células com altos títulos de vírus MyoD. <ol><li> Adicionar hES celular Clonagem e Recuperação Suplemento no meio do dia antes da ordenação. </li><li> O dia da triagem, dissociar as células por TrypLE (como descrito no dia 0) e voltar a suspender as células em soro KO substituição mais hES celular clonagem e recuperação suplemento em FACS-tubos. </li><li> No final da triagem, recolher as células em soro KO substituição e placa em MEFs placas adicionando hES celular clonagem e recuperação de suplemento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-como indução e Diferenciação <ol><li> Procedimento de indução e diferenciação <ol><li> Dia 0 - indução EB <ol><li> Certifique-se, antes de iniciar a diferenciação de BAF60C/Myod-infected hESCs, ter elevado número de colônias no poço (Figura 2C). </li><li> Para cada poço remover o meio, lava-se com PBS e adicionar 1 ml de 1 mg / ml de colagenase IV. Incubar durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Remover colagenase e adicionar 1 ml de meio de EB. </li><li> Sob um microscópio de dissecação rapidamente dissociar mecanicamente as colônias em 400-800 agregados celulares raspando com uma gorjeta de 10 ml. </li><li> Recolher os pedaços de colónias em um tubo de 15 ml e deixa-se sedimentar durante 3 min. Retirar o sobrenadante, re-suspensão em 3 ml de meio EB e transferir a suspensão de células para um poço de uma placa de 6 poços de baixo anexo. </li></ol></li><li> Dia 1 <ol><li> Verifique o tamanho das colônias e da morte celular antes de prosseguir. Se pedaços grandes estão presentes, quebrá-los cuidado pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml, 3-4 vezes. Se a morte celular é muito alta (muitas células flutuantes e detritos) substituir o meio, recolhendo os agregados num tubo de 15 ml, por gravidade e placa-los com 3 ml de meio EB fresco, caso contrário, proceder da seguinte maneira. </li><li> Adicionar 1,5ml de meio fresco EB nos poços </li></ol></li><li> Dia 2 <ol><li> Mude o meio, recolhendo os agregados dos poços em um tubo de 15 ml. Deixe que eles se contentam com 2 min. </li><li> Retirar o sobrenadante, substitua com 3 ml de meio fresco e EB redistribuir sobre os mesmos poços. </li></ol></li><li> Dia 3 <ol><li> Adicionar 1,5 ml de meio EB fresco nos poços. </li></ol></li><li> Dia 4 <ol><li> Proceder conforme descrito em &quot;Day 2&quot;. </li></ol></li><li> Dia 5 - diferenciação miogênica de clusters EB-like (Figura 2D). <ol><li> Recolher os agregados, como descrito em 2.1.3.1 e lavar uma vez com 2 ml de PBS; permitir que o agregado para sedimentar. </li><li> Remover PBS e adicionar 3 ml de meio de DM; placa nos mesmos poços. </li></ol></li><li> Dia 6 - Dia 20 <ol><li> De d6 para d20 substituir o meio com meio fresco a cada 3 dias. Myospheres representativos são mostrados no Figura 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Verificando diferenciação myosphere <ol><li> Antes de prosseguir, recomenda-se verificar a eficiência de diferenciação miogênica nos myospheres fazendo seções dos myospheres embutidos em composto OCT, conforme descrito em um protocolo de 12 Jove anterior. Executar uma técnica de imunofluorescência para marcadores miogênicos como myognenin (F5D clone, DSHB) e da cadeia de miosina pesada (MF20 clone, DSHB) (ver resultados representativos). TIP! Para ter sucesso com a coloração para miogenina em secções de EB é crítico para executar a recuperação de antigénio por tratamento com sulfato de dodecil de sódio (SDS) a 0,5% durante 5 min. Além disso, é possível usar este protocolo para a coloração dupla utilizando anticorpos F5D e MF20. </li></ol></li></ol> 3. Receitas Mídia <ol><li> Médio ESC DMEM-F12 1 mM de L-glutamina 20% Knockout Serhum meio de substituição (KOSR) 0,1 mM de aminoácidos não-essenciais (NEAA) 50 U / ml de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) 0,1 mM de beta-mercaptoetanol Factor de crescimento de 8 ng / ml de base de fibroblastos (bFGF) </li><li> Médio EB DMEM F12 1 mM de L-glutamina 15% de FBS 5% Soro de Cavalo </li><li> Médio DM DMEF F12 1X SEU Liquid Media Supplement 1X Suplemento N-2 </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

O protocolo proposto aqui descreve como gerar agrupamentos tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres) diretamente do hESCs. A estratégia proposta tem o potencial sem precedentes e extraordinário para a produção de mini músculos em suspensão que pode ser apropriado como uma &quot;doença em um prato de&quot; modelo para ambos os ensaios de avaliação e estudos de desenvolvimento. Além disso, o método para gerar myospheres de hESCs é simples e não requer qualquer passo de triagem FACS durante a diferenciação, o que tipicamente tem um impacto negativo sobre o rendimento das células recuperadas. Além disso, um procedimento de classificação durante a diferenciação iria interferir com a agregação, uma vez que implica uma dissociação da EB em células individuais. O método proposto é baseado na reprogramação epigenética de hESCs de factores específicos, MyoD e BaAF60C, que não são expressos em células-tronco embrionárias pluripotentes. MyoD e BAF60C fornecer o &quot;core&quot; da proteína ª complexoem marcas loci genômico a partir do qual procede a transcrição para ativar o programa miogênica esquelético. Os dois factores são entregues às células por meio de infecções lentivirais e, por conseguinte, é essencial para obter uma elevada eficiência de infecção de ambos os factores em todas as células. Isto pode ser conseguido através da utilização de vírus com título elevado ou vírus dotados de marcadores de selecção. As condições de cultura, também desempenham um papel importante na optimização da extensão da diferenciação miogénica. Propomos um protocolo de diferenciação à base de soro para a diferenciação de MyoD/BAF60C expressando hESCs em conjuntos de precursores miogénicas, seguido por incubação em meio definido isento de soro (contendo transferrina insulina - STI) para alcançar a conversão de precursores miogénicos em miotubos esqueléticos. No entanto, é possível que outros meios definidos pode atingir uma diferenciação miogénica igual ou melhor. Uma limitação de corrente de que o protocolo é que ele se baseia na utilização de soro fetal de bovino, o qual, além de contering muitas proteínas animais e substâncias, mostra as variações de lote para lote. Isso pode resultar em menor eficiência ou heterogeneidade de conversão miogênica dentro myospheres. De notar que nem todas as estruturas de EB-como derivados de BAF60/MyoD-expressing hESCs são myospheres; ou seja, alguns estão agregados EB-como inteiramente compostas de miofibras. O número de myospheres normalmente derivadas hESCs expressam BAF60C MyoD e pode variar de 30 a 60%, tal como estimada por imunocoloração em secções EB realizadas no final do protocolo (ver Resultados). Uma abordagem potencial para o enriquecimento de um prato de cultura para apenas myospheres seria a utilização de um repórter miogénica. Isso facilitaria descartando os clusters EB-como parcialmente ou não diferenciados e selecionando apenas os myospheres. Por último, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes às exigências temporais dos factores introduzidos seria útil para melhorar o método de administração. Por exemplo, se BAF60C e MyoD são necessárias apenas para shmomento ou a &quot;chutar&quot; as células na direção certa, métodos baseados na entrega mRNA modificado pode ser aplicada. Por outro lado, se os factores são necessários para um tempo mais longo antes de as células de explorar as suas proteínas endógenas, uma abordagem epissomal seria recomendada para eliminar a variabilidade e efeitos não controlados devido a integração no genoma. Finalmente, observa-se que é imperativo para expressar BAF60C antes ou ao mesmo tempo que MyoD (nunca depois), a fim de obter a conversão hESC em músculos esqueléticos. A exigência de expressão antes de BAF60C depende presumivelmente sobre o seu papel na pré-configuração da paisagem epigenética para o bom distribuição MyoD cromatina através do genoma 6,15. Como tal, os futuros protocolos pode ser melhorada através de compostos ou outras manipulações que promovem a expressão BAF60C em hESCs.

Por causa de sua habilidade única de auto-renovação, mantendo pluripotência, as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são considerados um recurso valioso na medicina regenerativa. Geração de células-tronco repovoamento mediada dos músculos doentes e células-hESC ou tronco pluripotentes induzidas (iPSC) derivadas de músculos esqueléticos in vitro para modelagem de doenças são metas fundamentais de estudos que visam identificar tratamentos e elucidar a patogênese de muitas doenças neuromusculares. No entanto, estes estudos têm sido desafiados pela resistência de hESCs para converter em células musculares esqueléticas e pela escassez de informações sobre a regulação molecular de células estaminais embrionárias humanas-compromisso com tecido muscular esquelético. De fato, as tentativas anteriores para gerar progenitores musculares esqueléticas de hESCs revelou que apenas corpo embryoid progênies (EB) derivados ou células mesenquimais são competentes para ativar tecido muscular esquelético seguinte expressão ectópica de ativadores de transcrição (por exemplo,Pax3 ou Myf5) 1-3, ou por exposição a condições específicas de cultura 4-5. Temos anteriormente mostrado que o componente de SWI / SNF, BAF60C (codificado por SMARCD3), é um componente essencial da maquinaria transcricional que permite a activação mediada por MyoD de loci específicos do músculo 6. Descobrimos recentemente que a ausência selectiva de BAF60C confere hESCs para a resistência à activação mediada por MyoD de tecido muscular esquelético 7 que é de outro modo observada no BAF60C expressando células somáticas 8-10, num processo vulgarmente referido como conversão miogénica. Expressão forçada de BAF60C permite MyoD ativar diretamente tecido muscular esquelético em hESCs, mediante condições específicas de cultura, com BAF60C e MyoD impor uma assinatura epigenética que comete hESCs para a linhagem miogênica 7. De nota, a análise proteômica anterior revelou a ausência seletiva de BAF60C, entre os componentes SWI / SNF, na CES 11. Nós usamos este conhecimento para impor um compromisso epigenética de hESCs na linhagem miogênica, levando à geração de uma população homogênea de mioblastos esqueléticos que podem ser agregados para formar contrátil tridimensional estruturas (myospheres) que funcionalmente imitam músculos esqueléticos miniaturizados 7. Na verdade, o nosso método de gerar progenitores musculares esqueléticas de hESCs conta com o compromisso de epigenética hESCs à linhagem miogênica, que é fenotipicamente latente até que as células são expostas a sinais de diferenciação, tais como células agregação e cultura em meio de diferenciação (ver protocolo específico). Esta estratégia permite a expansão de uma população homogénea de hESCs que estão comprometidos com a linhagem epigenètica músculo esquelético e adequado para a formação de myospheres contrácteis tridimensionais que recapitulam histológica e as propriedades funcionais de esqueléticomúsculos. Os myospheres fornecem a primeira evidência de músculos miniaturizados exploráveis ​​por uma &quot;doença em um prato de&quot; modelo de doenças musculares. Quando gerada a partir de pacientes provenientes iPSCs, estes myospheres têm o potencial para elucidar questões de desenvolvimento de longa data e patogênese de doenças raras, além de oferecer o enorme potencial como ferramenta de alto throughput screening de compostos terapêuticos. Observamos também que uma leitura imediata de análise myosphere poderia ser fornecido por imuno-histoquímica em seções, como descrito em um protocolo JOVE por 12 Gomes et al.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Geração de uma população homogênea e abundante de células do músculo esquelético a partir de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) é um requisito para terapias baseadas em células e para uma &quot;doença em um prato de&quot; modelo de doenças neuromusculares humanas. Principais obstáculos, como a baixa abundância e heterogeneidade da população de interesse, bem como a falta de protocolos para a formação de estruturas contráteis tridimensionais, têm limitado as aplicações de células-tronco para doenças neuromusculares. Criamos um protocolo que supera esses limites por introdução ectópica de fatores definidos no hESCs - o fator MyoD determinação muscular e SWI / SNF cromatina remodelação complexo BAF60C componente - que são capazes de reprogramar hESCs em células musculares esqueléticas. Aqui nós descrevemos o protocolo estabelecido para gerar mioblastos derivados de células estaminais embrionárias humanas e promover o seu agrupamento em estruturas miniaturizadas tridimensionais (myospheres) que funcionalmente imitam músculos esqueléticos miniaturizados 7 </sup&gt;.

A Figura 1A apresenta um esquema do protocolo proposto para gerar myospheres de hESCs. Os passos críticos de controlo (indicados pelas setas) é a eficiência da infecção em hESCs e a conversão miogénica dentro dos myospheres. Em nossos experimentos, tirar proveito de um vetor de codificação BAF60C lentiviral que carrega GFP fluorescência. Nós normalmente infectam as células com BAF60C e FACS tipo 72 horas após a infecção para enriquecer a população que expressa BAF60C. Quando as células atingem em torno de 70-80% de confluência, nós infectar com MyoD lentivírus. Após a primeira infecção normalmente leva dois ou três dias para que as células atingissem que confluência. A Figura 1B mostra os níveis de genes exógenos como a dobra de indução em relação aos hESCs não infectadas expressão. Figura 1C mostra a expressão e distribuição ao nível das proteínas dos factores introduzidos. BAF60C<html> expressão é apresentado como a GFP de fluorescência, enquanto que a expressão de MyoD é detectado por imunofluorescência com um anticorpo MyoD. Consideramos dia 0 o dia em que começar a diferenciação de hESCs infectados em agregados EB-like. Após 15 dias em meio MS, uma porção dos myospheres (usualmente um poço inteiro) é incorporado em OCT composto 12 e seccionados para realizar imunofluorescência para marcadores miogénicas para verificar a eficiência da conversão miogénica. Figura 1D mostra a coloração representativo para miogenina e de miosina de cadeia pesada em uma diferenciação miogênica ideal. Myospheres pode ter formas diferentes ou incomuns, talvez como resultado da fusão com myospheres menores. A partir do dia 10, é possível observar a contracção esporádicos nas myospheres (ver filme 1 e 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. UM) esquemática do protocolo utilizado para a geração de myospheres de hESCs. B) os níveis de mRNA de genes exógenos em hESCs infectadas com BAF60C e MyoD (H9-BM) monitorizada por qRT-PCR e expressa como a indução de dobragem, como comparado a zombar hESCs infectados imagens (H9-CTR). C) imunofluorescência que apresentam coloração MyoD (vermelho) e fluorescência BAF60C (verde) devido ao elemento IRES-GFP no vetor. D) Imunofluorescência realizada em myosphere secções marcadas para Miogenina (MYOG ), miosina pesada Cadeia (MyHC) e contrastado para DAPI (ver detalhes de imunofluorescência). Barra de escala é 100 mm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens representativas de aparecimento de células em diferentes fases doprotocolo da infecção (parte I) para a diferenciação (parte II). Escala da barra é 100 um. Considerando EB-estruturas, como a partir de d1 a d5 são em sua maioria de forma circular (D), myospheres cultivados ao longo de 15 dias de acordo com o esquema na Figura 1A apresentar uma forma imprevisível e são heterogêneas em cultura; veja dois exemplos em E e F.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K visualizações.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos. 

Vídeo: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

Biologia

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.