Métodos de cultura direta e indireta para o estudo de materiais de implante biodegradáveis in vitro. Ao longo das últimas décadas, materiais biodegradáveis têm sido amplamente explorados para aplicações biomédicas, como implantes maxilofaciais ortopédicos, odontológicos e cranianos. para a triagem dos materiais biodegradáveis para aplicações biomédicas, é necessário avaliar esses materiais em termos de respostas in vitro de células, citocompatibilidade e citotoxicidade.
As normas da Organização Internacional para a Padronização têm sido amplamente utilizadas nas avaliações de biomateriais. No entanto, a maioria das normas ISO foram originalmente estabelecidas para avaliar a toxicidade de estilo de materiais não degradáveis, fornecendo assim valor limitado para a triagem de materiais biodegradáveis. Neste vídeo, introduziremos e discutiremos três diferentes métodos culturais: método de cultura direta, método de cultura de exposição direta e método de cultura de exposição para avaliar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradável.
Especificamente, o método de cultura direta avalia as interações entre células recém-semeadas e os implantes. A cultura de exposição direta imita as interações entre as células estabelecidas no corpo e os implantes. A cultura de exposição caracteriza as interações entre as células estabelecidas e os implantes quando não estão em contato direto entre si, mas no mesmo ambiente onde os materiais se degradam.
Este vídeo fornece exemplos de uso desses três métodos culturais para estudar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradáveis e suas interações com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea. Os métodos in vitro descritos neste vídeo imitam diferentes cenários do ambiente in vivo, ampliando a aplicabilidade e relevância do teste de citocompatibilidade in vitro de diferentes materiais para diversas aplicações biomédicas. Seguimos um protocolo aprovado pela Comunidade Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em Riverside para coleta de células e tecidos.
Preparação da cultura celular. Os três métodos de cultura descritos neste vídeo são geralmente aplicáveis para diferentes tipos de células que são aderentes. Aqui, os BMSCs colhidos a partir de desmame de ratos serão introduzidos como exemplo para a preparação da cultura celular Colheita de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de desmassarlings de ratos.
O diagrama esquemático nesta figura mostra os passos para colher BMSCs de desmasmaamentos de ratos. Remova a pele e os tecidos musculares e conjuntivos para dissecar o fêmur do rato eutanizado. Coloque os ossos femorais em um tubo cônico de 15 mL contendo mídia de cultura celular.
Coloque os tubos cônicos no gelo até o momento da realização da extração celular. Transfira os ossos para uma placa de Petri no armário de segurança biológica. Corte as extremidades do osso usando uma lâmina cirúrgica e lave a medula óssea em um tubo cônico de 50 mL lavando a cavidade da medula óssea com mídia de cultura celular usando uma seringa com a agulha de calibre 25 1/2.
Filtre a suspensão celular usando um filtro de 70 micrômetros seguido de centrifugação a 126 vezes a gravidade por cinco minutos para obter as pelotas de célula Aspirar mídia supernante e reabastecer com 10 mL de mídia fresca. Pipeta suavemente para cima e para baixo para resuspensar as células usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Pipete a suspensão diretamente na parte interna de um frasco T-75 e adicione mídia para trazer o volume até 25 mililitros.
Cultura as células em uma incubadora em um ambiente padrão de cultura celular estéril que é 37 graus Celsius, atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar. Depois de três a sete dias, enxágue as células não aderentes aspirando a mídia antiga e reabastecendo com novas mídias. Continue a culturar e alimentar as células com mídia fresca até que estejam prontas para a passagem celular, congelamento ou uso em um experimento.
Preparação e esterilização da amostra. Esterilizar ou desinfetar todas as amostras antes da cultura celular. Os métodos de esterilização ou desinfecção para diferentes tipos de amostra variam dependendo das diferentes propriedades dos materiais.
Em geral, use radiação ultravioleta para desinfetar metais biodegradáveis para estudos in vitro. Métodos de cultura celular. O diagrama esquemático nesta figura mostra os passos do método de cultura direta.
Neste vídeo, os BMSCs foram cultivados em uma placa derivada de magnésio colocada dentro dos poços de uma placa tratada de 12 poços de cultura tecidual como exemplo para ilustrar o método de cultura. Use um frasco 90% confluente para determinar a concentração celular na suspensão celular usando um hemótmetro. Diluir a suspensão celular usando mídia fresca para uma concentração celular prescrita necessária para o estudo celular in vitro.
Coloque as amostras no centro das placas de cultura tecidual de 12 poços. Enxágüe as placas de cultura com 2 mL de PBS e 2 mL de DMEM sequencialmente para calibrar a pressão osmótica em condições estéreis. Adicione 3 mL da suspensão celular diluída em cada poço sobre as amostras de interesse.
Cultume as células em uma incubadora sob condições padrão de cultura celular por 24 horas. O diagrama esquemático em desfiguração mostra os passos da cultura de exposição direta. Prepare a suspensão celular com as concentrações necessárias de células baseadas no design experimental para diferentes tipos de células e aplicações pretendidas.
Enxágüe as placas de cultura com 2 mL de PBS e 2 mL de DMEM sequencialmente para calibrar a pressão osmótica em condições estéreis. Adicione 3 mL da suspensão da célula diluída em cada poço. Cultura as células na incubadora umidificada em condições padrão de cultura celular por 24 horas ou até que as células atinjam 50% a 80% de confluência.
Após 24 horas de lavagem, as células da placa do poço com PBS usando uma pipeta para remover células mortas flutuantes. Coloque as amostras desinfetadas ou esterilizadas diretamente nas células aderidas. Adicione 3 mL de mídia fresca em cada poço.
Cultume as células sob condições padrão de cultura celular por mais 24 horas. O diagrama esquemático nesta figura mostra os passos do método de cultura de exposição. As etapas iniciais para a preparação celular são as mesmas da cultura de exposição direta.
Em seguida, coloque as amostras no poço de inserções com um tamanho de poros de membrana de 0,4 micrômetros e coloque as pastilhas do poço com as amostras em cada poço com as células. Cultume as células sob condições padrão de cultura celular por mais 24 horas. Caracterização pós-cultura das células.
Para cultura direta e cultura de exposição direta, conserte, manpare, imagem e analise as células aderentes tanto em placas de poço quanto em amostras. Para cultura de exposição, analise as células aderidas às placas do poço. Colete os meios de pós cultura de cada poço em um tubo cônico correspondente de 15 mL para análise suplementar.
Colete todas as amostras após a cultura para análise suplementar. Enxágüe as células aderentes em ambas as amostras e placas de poço três vezes usando PBS. Adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído em cada placa de poço.
Coloque a tampa de volta na placa do poço e deixe o PFA reagir por 20 minutos. Após 20 minutos, aspire o PFA e dispense-o em uma garrafa de lixo. Enxágüe a placa do poço três vezes usando PBS para remover o PFA e transfira o resíduo para a garrafa de resíduo.
Prepare os estoques de trabalho dos agentes de coloração seguindo as instruções do fabricante. Adicione 200 a 400 microliters de alexa fluor 488 phalloidin diluído agente de coloração de phalloidin em cada poço para cobrir as células na placa do poço e na amostra. Enrole a placa do poço em papel alumínio para evitar a exposição à luz e permita que a Alexa Fluor 488 Phalloidin reaja por 20 minutos à temperatura ambiente.
Colete o agente de coloração Alexa Fluor 488 Phalloidin e dispense-o no frasco de resíduo correspondente. Enxágüe as placas de parede três vezes usando PBS para remover o excesso de Alexa Fluor 488 Phalloidin e dispense o PBS usado na garrafa de resíduo correspondente. Adicione 200 a 400 microliters de DAPI diluído em cada poço para cobrir as células no poço e na amostra.
Enrole a placa do poço em papel alumínio e deixe o DAPI reagir por cinco minutos à temperatura ambiente. Enxágüe a placa do poço três vezes usando PBS e dispense o PBS usado na garrafa de resíduo correspondente. Após a coloração, imagem as células usando um microscópio de fluorescência.
Sempre que possível, tire imagens de contraste de fases das células, além de imagens de fluorescência. Imagem das células nas amostras biodegradáveis o mais rápido possível ou imediatamente após a coloração para evitar ou reduzir possíveis alterações causadas pela degradação contínua das amostras. Para cultura direta e cultura de exposição direta, imagem e avaliação de dois tipos de células.
Uma, as células das amostras em contato direto com as amostras, e duas, as células aderidas na placa do poço ao redor das amostras em contato direto com as amostras, conforme mostrado na figura. Para cultura de exposição, como mostrado aqui, use o guia de imagem ao tirar as imagens de fluorescência das células para determinar se a resposta da célula seria diferente em resposta ao gradiente dinâmico de degradação das amostras. Imagem e analisa células localizadas na área dentro do anel interno, 3,5 mm de distância do centro, e o anel externo, que está a 7 mm de distância do centro separadamente.
Para cada amostra, e enquanto nas placas de cultura, pegue aleatoriamente pelo menos cinco imagens de cada área de interesse onde as células são contato indireto ou contato indireto com as amostras a uma distância predefinida. De todas as imagens celulares obtidas a partir da etapa 4.3, quantificar a morfologia celular medindo a área de disseminação celular e a proporção para análise de imagens. Conte o número de células em cada área de imagem.
Calcule a densidade de adesão celular em condições de contato diretas e indiretas como o número de células por área unitária. Análises pós-cultura de mídia e amostras. Antes da auto-fixação, colete os meios de comunicação pós-cultura.
Meça os valores de pH da mídia pós-cultura em cada poço imediatamente após a coleta usando um medidor de pH pré-calibrado. Seguindo a etapa anterior da medição do pH, colete e dilua a mídia utilizando um fator de diluição desejável para medições ideais de concentrações de íons. Meça as concentrações dos íons de interesse na mídia pós-cultura usando um espectrômetro de emissão plasma-óptica indutivamente acoplado abreviado como ICP-OES.
Após o estudo de células in vitro, as amostras biodegradáveis podem mudar de dimensão, massa, morfologia superficial, microestrutura e composição. A análise pós-cultura das amostras ajuda a entender o mecanismo de degradação das amostras. Após a cultura celular, pegue as fotografias das amostras para mostrar possíveis alterações na dimensão da amostra, cor, morfologia e outras características visíveis.
Seque ou desidrate as amostras pós-cultura e meça a massa, a dimensão e o volume da amostra para quantificar quaisquer alterações na massa, dimensão e volume. Use um microscópio eletrônico de varredura para caracterizar a microestrutura e morfologia das amostras. Use espectroscopia de raios-X dispersivos de energia e defracção de raios-X para caracterizar a composição e a fase dos produtos de degradação nas amostras.
Use FTIR ou ATR para detectar a ligação química em superfícies de amostra. Resultados representativos. Aqui, a figura mostra as imagens representativas da fluorescência das células-tronco derivadas da medula óssea sob condições de contato diretas e indiretas utilizando diferentes métodos culturais.
Esta figura mostra os dados de exemplo para densidade de adesão celular quantificada. Como mostrado na figura A, na cultura de exposição direta de 24 horas, os BMSCs em contato direto com o ZC21 têm densidade de adesão celular significativamente maior do que qualquer outro grupo. Como mostrado na figura B, na condição de contato indireto da cultura de exposição direta, a densidade de adesão do BMSC é significativamente maior para o grupo ZC21 do que o grupo de magnésio.
No entanto, não mostra diferença significativa em relação ao T64 e as células apenas controlam grupos. Aqui, a figura A mostra o valor do pH dos meios de pós-cultura após a cultura de exposição direta e cultura direta. Para a cultura de exposição direta, os valores de pH da mídia variam de 8,3 a 8,4 para todas as amostras.
Na cultura direta, os valores de pH da mídia variam de 7,9 a 8 entre os grupos. A Figura B mostra a concentração de íons de magnésio na mídia pós-cultura. Tanto na cultura de exposição direta quanto na cultura direta, suas concentrações de íons de magnésio nos grupos ZC21 e magnésio são significativamente maiores do que qualquer outro grupo de controle.
Esta figura mostra os padrões XRD para ZSr41 e magnésio puro após uma cultura de exposição de três dias. Foram observadas fases cristalinas de diferentes composições, como magnésio, óxido de zinco e hidroxiapatita. Aqui, a figura A mostra a sobreposição de imagens SEM e mapas EDX de composição elementar superficial para magnésio revestido de óxido de magnésio, e o controle de substratos de magnésio e vidro após 24 horas de cultura direta com BMSCs.
A Figura B mostra a composição elementar da superfície quantitativa das superfícies amostrais, indicando diferentes deposições formadas durante a cultura celular. Conclusões. Neste vídeo, introduzimos três métodos in vitro diferentes para avaliar a citocompatibilidade de materiais de implante biodegradável baseados em diferentes desenhos experimentais e aplicações pretendidas. As interações entre materiais e diversos tipos de células poderiam ser investigadas através do método de cultura direta, método de cultura de exposição direta e método de cultura de exposição.
Este vídeo apresentou métodos in vitro importantes para estudar o efeito de materiais biodegradáveis, juntamente com seus produtos de degradação em comportamentos celulares para uma variedade de aplicações de implantemédicos.
