Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Investigação Interno do NIH, Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial.

Parte 1: Microscópio e Preparação da Configuração de Imagem <ol><li> Qualquer microscópio confocal invertido deve ser adequado para IVM. Neste estudo, um microscópio Olympus IX81 invertido, equipado com uma unidade confocal laser scanning Fluoview-1000 foi usado. Para obter a melhor resolução possível, é recomendado o uso de altos objetivos de NA, como o de imersão em água UPLSAPO 60x/1.20 NA, ea imersão em óleo Plan-Apo 60x/1.42 NA. Objectivos de imersão em óleo têm eficiências de recolha elevadas e embora eles exigem a utilização de uma lamela entre o tecido e o objectivo, que proporcionam uma melhor qualidade de imagem quando usado para áreas de imagem dentro de 15-20 um a partir da superfície. Além disso, o uso de óleo elimina a preocupação para a evaporação de água durante as sessões de imagem mais longos. A fim de manter a temperatura e humidade, o microscópio deve ser completamente fechado e alimentada com ar quente e humidificado. Alternativamente, o animal, a platina do microscópio, e aobjectivo deve ser aquecido por outros meios. Por exemplo, as almofadas de calor químico pode ser usado para o animal e a fase, e aquecedores objectivos especificamente concebidos podem ser utilizados para o objectivo (Figura 1A). O aquecedor objetivo deve ser ligada 30 minutos antes de iniciar o procedimento. Nota: quando as almofadas de calor são usados ​​para manter o animal aquecer uma gaze tem que colocar entre o bloco e a pele. A pele tem de ser monitorado para queimaduras. </li><li> As fases padrão na maioria dos microscópios confocais disponíveis comercialmente têm uma abertura que é usada para inserir vários suportes que são usados ​​para ajustar as lâminas, placas de Petri, e placas de diferentes tamanhos. A fim de executar IVM, uma inserção de fase normal de 35 milímetros pratos de Petri é invertida de cabeça para baixo, coberta com uma lâmina de vidro de 40 mm, que é então fixado por graxa alto vácuo de silicone ou fita adesiva (Figura 1A). Um acessório personalizado também pode ser fabricado a partir de 3 milímetros chapa de alumínio de espessura. A superfície de vidro é então cleaned com etanol a 70% e passou com um Kimwipe. </li><li> Fabricação titular personalizado para a imobilização SG (estabilizador). O objetivo do titular é estabilizar as SGs no lugar e rigidamente casal-los para o palco ea lamela. O suporte pode ser feito de um plástico 60 milímetros placa de Petri. Em primeiro lugar, o fundo do recipiente é retirada a partir das paredes e cortado em rectângulos de cerca de 15 x 10 mm. Em seguida, as bordas são arredondadas e polidas, usando uma lixa fina. Quatro espaçadores (1,5-2 mm) são construídas removendo as pontas de borracha de 1 ml de êmbolos de seringas. Usando uma lixa fina, a superfície dos espaçadores e os quatro cantos da peça de plástico são polidos. Os espaçadores são então colados usando supercola gelatinosa, e depois alisados ​​utilizando uma lixa fina sobre uma superfície plana. Note-se, que para os animais maiores, o tamanho dos suportes e os espaçadores podem ter de ser aumentada para acomodar glândulas ligeiramente maiores. </li><li> Preparação do gel de acoplamento óptico. 0,3% de Carbomer-940 (Tabela 2) em gel é preparado por aquecimento de 100 ml de água ultra-pura e dissolvendo 5,47 g de D-sorbitol. Em seguida, 0,3 g de Carbomer-940 são adicionados. A proveta deve ser coberto e colocado numa placa quente a agitação (temperatura mais baixa) durante várias horas ou até que todos os aglomerados de carbómero estão completamente dissolvidos. Finalmente, Trietanolamine é adicionada gota a gota, com agitação suave, até que um pH de cerca de 7,4 seja alcançado. O gel foi armazenado a 4 ° C 13. </li></ol> Parte 2: Animais e Anestesia <ol><li> Antes de realizar quaisquer experimentos com animais, os protocolos devem ser aprovados por seu comitê de cuidados com os animais e ética local. É importante ressaltar que os pesquisadores devem ser devidamente treinados para realizar procedimentos cirúrgicos e devem consultar com seu comitê de cuidado animal local ou instituição veterinário antes de prosseguir com o procedimento. </li><li> Neste estudo, um modelo de rato (GFP / mTomato-mouse) resultantes do cruzamento camundongos FVB expressando GFP solúvel (GFP-mouse) wiForam utilizados ratos C57B6 ª expressando um peptídeo alvo membrana fundida com a proteína fluorescente tandem-tomate (mTomato-mouse) 6. Nota: toma geralmente 20-30 minutos para que o animal se tornar totalmente anestesiado e preparado para imagens </li><li> Os ratos são alojados num ambiente controlado na instalação para animais e são deixados a aclimatar durante uma semana antes da experiência. Este passo é necessário para a imagem do SG desde qualquer resultado de socorro em aumento da atividade secretora 12. Água e comida são fornecidas ad libitum. Os machos a partir de 2 -5 meses de idade são utilizados em experiências de imagem (20-30 g). </li><li> Antes da anestesia, pesar os animais para determinar a dose apropriada de anestésico. </li><li> Uma vez que a tensão induzida pela administração de anestésicos injectáveis ​​podem prejudicar a actividade secretora da SG, induzir pré-anestesia por inalação de isoflurano, seguida pela injecção de anestésicos. Para tal, colocar os ratos muito suavemente para a câmara de vaporizador, eligar o fluxo de oxigênio (800-900 mmHg). Defina os níveis de isoflurano a 3% para iniciar a indução pré-anestésica. </li><li> Uma vez que os animais estão inconscientes, injectar uma mistura de 100 mg / kg de cetamina e 20 mg / kg de xilazina na cavidade peritoneal (25 L de agulha). Os anestésicos são recém preparada diluindo 100 mg / ml de xilazina a 20 mg / ml em solução salina e em seguida misturando-o com a cetamina. Esta mistura é ainda diluída 1:1 com solução salina e de uma quantidade adequada é injectado com base no peso do animal. Esta diluição ajuda na prevenção de overdose acidental. Note-se que a mistura perde a sua eficácia depois de 20 min. </li><li> Observar os animais por sinais de vigília e injetar mais mistura anestésica se eles estão saindo da anestesia (aproximadamente 75% da dose inicial no prazo de 45 minutos após a primeira injeção, e 50% a cada hora depois). Verifique a profundidade da anestesia a cada 15 min, apertando a pata e a observação da resposta. Nota: Sempre administrar pomada oftálmica para evitarsecura ocular. </li><li> Anestésicos induzem hipotermia, que pode afectar a reprodutibilidade dos experimentos e a saúde do animal. Portanto, os ratinhos devem ser mantidas sob a lâmpada de calor ou sobre uma almofada de aquecimento durante todo o período da experiência. Nota: a lâmpada de aquecimento deve ser, pelo menos, 12-18 polegadas a partir do animal para impedir a queima </li><li> A temperatura corporal dos animais tem de ser monitorizada com um termómetro equipado com uma sonda de temperatura rectal. </li></ol> Parte 3: Cirurgia Animal e Posicionamento de Microscopia intravital <ol><li> Preparar a área de trabalho com todos os instrumentos cirúrgicos (Tabela 1) que devem ser limpos e esterilizados. </li><li> Raspar a área do pescoço do rato com um aparelho eléctrico. Limpar o lado ventral da área do pescoço do rato anestesiado com uma gaze embebida em etanol a 70%. Seca-se o excesso, com um Kimwipe. </li><li> Com pinças curvas maçantes levantar um pequeno pedaço de pele na linha média (aproximadamentemadamente, na extremidade inferior dos músculos de diafragma), e faz uma pequena incisão (Figura 1B). </li><li> Inserir a tesoura para a abertura e separar a pele para longe do tecido subjacente, abrindo as lâminas de tesoura. Evitar danificar o tecido glandular subjacente ao apontar a tesoura para cima para o lado de baixo da pele. Repetir este passo várias vezes, até que a pele é separada dos tecidos mais profundos (Figura 1B). </li><li> Com uma tesoura, corte uma tira de pele solta cerca de 3 mm de largura e 10 mm de comprimento. A pele deve ser cortada de modo a que a abertura começa perto da base dos GV de onde o nervo, a conduta e os vasos sanguíneos se conectam a glândula para o resto do corpo. Após a limpeza da área da ferida, a abertura resultante será de forma oval e medir aproximadamente 8 x 12 mm. Ambos os SGs será visível após a abertura (Figura 1B). </li><li> Com uma seringa de aplicação do gel de acoplamento óptico para o meio do corte e limpá-lo em direcçãoo do lado de fora com uma gaze estéril. Limpar peças de gaze deve ser usado para limpar cada um para impedir a introdução de cabelo ou sangue para o tecido exposto. Repita este passo até que todo o sangue e cabelo solto é removido. </li><li> Usando pinças # 7, separar o tecido conjuntivo longe da glândula submandibular direita todo o caminho até à base da glândula (alternativamente este protocolo pode ser utilizado em SG a esquerda). Em primeiro lugar, encontrar a ponta do SG e pegue o tecido conjuntivo alguns milímetros acima da ponta da glândula. Rasgue o tecido conjuntivo ao redor da glândula sem ferir o parênquima. (Figura 1B). Uma vez que a glândula está exposta, suavemente separar o tecido conjuntivo a partir da glândula. Se ocorrer sangramento, lave o sangue com soro fisiológico. Certifique-se de que todos os tecidos conjuntivos são separados ea glândula está totalmente exposta. Manter a glândula húmido por aplicação de gel de acoplamento óptico regularmente. </li><li> Antes de levar o animal ao microscópio, coloque um grosso pedaço de gaze e do heat embalar para a fase de microscópio de manter uma temperatura de 38 ± 2 ° C. A temperatura do bloco de calor químico pode ser ajustado pelo tamanho dos cortes que expõem a bolsa interna para a atmosfera. Gaze proporciona algum isolamento do aparelho de calor a partir da fase de metal. Cobrir o topo do aparelho de calor com um pequeno pedaço de gaze, bem. </li><li> Colocar o animal em seu lado (lado direito para a glândula direita) e sobre a gaze. Posicionar o animal com as glândulas salivares submandibulares colocado no meio da lamela (Figura 1C). </li><li> O animal deve ser protegido e estabilizado nesta posição antes de imobilização da glândula. Coloque um pedaço de fita adesiva no lado ventral da pata dianteira direita do mouse. Gancho incisivos do mouse por um fio de seda (Figura 1C, inserir). Criar alguma tensão entre o fio de seda e na pata e anexá-las para o palco por fita adesiva. O SG deve ser descansando naturalmente no meio dolamela. A cabeça e no tórax deve ser adicionalmente estabilizados por cunhas de plástico que podem ser acoplados à fase. </li><li> Coloque um pequeno pedaço de tecido de limpeza de lentes sobre a glândula (Figura 1C). Estender a glândula ligeiramente e coloque um suporte personalizado sobre a glândula. Fortemente par do estabilizador para o palco com fita adesiva. O acoplamento pode ser melhorada através de uma braçadeira de metal ligado à fase (Figura 1C). Ângulos de tensão e pontiagudos devem ser evitados, pois podem comprometer o fluxo de sangue. Imediatamente após a estabilização inspecionar o fluxo de sangue ou através do exame da glândula visualmente (que deve reter a coloração rosa) ou por epifluorescência. No rato GFP / m-tomate, alterações macroscópicas do fluxo sanguíneo pode ser facilmente avaliada uma vez que ambos os vasos sanguíneos e várias das células sanguíneas são rotulados com o m-tomate. </li><li> Cobrir o animal com uma almofada de gaze e aquecida. Medir a temperatura da glândula expostos por meio de um termómetro equipado wom uma pequena sonda de termopar flexível colocado em contacto com um dos lados da glândula exposta. </li></ol> Parte 4: Parâmetros de imagem <ol><li> Usando epifluorescência foco iluminação na superfície da glândula quer utilizando o GFP ou o conjunto de filtro de RFP. Encontrar a superfície da SG, e avaliar o fluxo sanguíneo nos vasos capilares e a morfologia global do tecido. Os sinais de danos nos tecidos incluem Blebbing membrana ou o aparecimento de grandes vacúolos. </li><li> Avaliar a estabilidade do tecido, quer através de epifluorescência ou por pré-digitalizar a área selecionada. A preparação estável é essencial, pois a maioria dos artefatos de movimento não pode ser removido ou corrigido para a análise dos dados pós-processamento. Se a preparação não é estável, são necessários ajustes. </li><li> Para encontrar a imagem adequada plano focal das glândulas no modo de pré-varredura (1X zoom), e mover-se gradualmente o objetivo para a lamela até as estruturas acinares, os grânulos de secreção e da pmembrana LASMA tornar claramente visíveis (Figura 2). </li><li> Os parâmetros de imagem para o lapso de tempo depende da experiência individual. Para imagem da dinâmica dos grânulos secretores usar uma velocidade de digitalização de 0,5-2 seg / frame, e 256 x 256 pixels com 0,2 m / pixel escala espacial (campo de visão de aproximadamente 50 mm x 50 mm). A fim de visualizar melhor forma os grânulos e a membrana do plasma, a espessura óptica deve ser ajustado entre 0,9-1,2 um. Para excitar o GFP e a tandem tomate, pode-se usar um comprimento de onda de 488 nm e 561 nm, respectivamente. A potência de pico é definido em torno de 0,5 mW para a 488 nm e 1 mW para a 561 nm. Isto assegura fotobranqueamento mínimo. </li><li> As definições do detector tem de ser ajustada para manter o sinal dentro da gama dinâmica e depende da luminosidade do espécime. </li><li> Uma vez que todos os parâmetros são definidos, a imagem pode ser iniciado. Em primeiro lugar, tirar uma foto do campo de visão para ser usado como um ponto de referência. Enquantoimagem em lapso de tempo, deriva do tecido em XY e Z podem ocorrer. Isso pode ser compensado manualmente ajustando a área de digitalização e da posição Z. Os ajustes devem ser feitos de forma gradual e em pequenos incrementos para evitar artefatos. Além disso, a imagem de referência pode ser utilizada para determinar se ocorre a fotodegradação. Se for detectada a fotodegradação significativa (redução de mais de 15-20% da fluorescência), reduzir a potência de laser de 0,1 mW. </li><li> Para estimular exocitose, injectar por via subcutânea 0,1 mg / kg de uma solução recentemente preparada de isoproterenol em solução salina. A exocitose é accionado a cerca de 1 minuto após a injecção. Grânulos de secreção de fusão com a membrana plasmática será detectado por um aumento da fluorescência da GFP em torno dos grânulos e a difusão dos péptidos em tandem de tomate nas suas membranas limitantes (Figura 3). Recomendamos adquirir 3-4 seqüências de lapso de tempo na mesma área, 10 min cada. </li><li> Após a sessão de imagens, eutanásia do anesthetized animais por inalação de CO2, numa câmara eutanásia (10-12 mm Hg durante 10 minutos). </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. 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Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. 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Até agora estruturas subcelulares foram fotografadas principalmente em in vitro (ou seja, culturas de células) ou ex vivo (ou seja, organiza-culturas, fatias de tecido, preparações acinares) sistemas modelo que muitas vezes não recapitulam as características dos tecidos vivos intactos 6. Nesse sentido, a abordagem aqui apresentada representa um grande avanço, pois permite imaginando a dinâmica de um passo tráfico de membrana específico (ou seja, exocitose regulada) em rato...

Nas últimas duas décadas, o advento de microscopia vivo e a utilização de proteínas fluorescentes levaram a grandes avanços em cada processo celular imagináveis, avançando assim a nossa compreensão da biologia das células 1. Este campo tem beneficiado tremendamente a utilização de culturas de células de mamíferos que são sistemas de modelos extremamente poderosos, em particular quando se trata de manipulações experimentais. No entanto, eles muitas vezes não fornecem uma representação verdadeira da biologia de organismos multicelulares complexos 2. Essa questão começou a ser abordada pelo desenvolvimento da microscopia intravital (MIV), que abriu a porta para investigar questões biológicas fundamentais em áreas como a neurobiologia, imunologia e biologia do tumor 3. Até agora, a maioria dos estudos baseados em IVM foram realizados a nível de tecidos e células individuais, sem fornecer qualquer informação sobre a dinâmica dos compartimentos subcelulares. Recentemente, o nosso laboratório e outross desenvolveram técnicas capazes de MIV de imagem estruturas subcelulares em roedores vivos 4-7, 13-15 e permitindo manipulações farmacológicas e genéticas in vivo. Esta abordagem tem sido usada por nós para estudar o tráfico de membrana in vivo, e mais especificamente a endocitose e exocitose regulada 6,7. Nosso sistema modelo experimental é baseado em expor, estabilizando e imagem das glândulas salivares submandibular (SG) roedores anestesiados. A escolha do SG como um modelo de órgão para IVM é devido ao facto de que as glândulas são facilmente acessíveis através da realização de uma pequena cirurgia, pode ser exteriorizada sem comprometer a sua fisiologia e estabilizado para reduzir os artefactos de movimento devido a pulsação do coração e da respiração. Além disso, a SGS pode ser selectivamente manipulada geneticamente por injecção de vectores baseados quer virais ou não virais através do ducto salivar 8,9. Finalmente, a SGS são glândulas exócrinas compostas de epith polarizadaElial células, que formam a ácinos e as condutas, as células mioepiteliais, e uma população complexa de células estromais. Por esta razão, eles são um excelente modelo para estudar a exocitose, endocitose, a entrega do gene, e do citoesqueleto de actina, como destacado em nossos estudos recentes 10, e oferecem a oportunidade de estudar aspectos da biologia celular, como polaridade celular, divisão celular, células- junções celulares e canais iônicos. Neste trabalho, descrever em detalhes um protocolo de imagem para atingir resolução subcelular no epitélio das SGs de um rato vivo. Especificamente, nós mostramos como a imagem dos grânulos de secreção nas células acinares das SGs durante exocitose regulada. Como mostrado anteriormente, após estimulação com agonistas do receptor beta-adrenérgico, os grânulos de secreção fundir com a membrana plasmática apical e gradualmente colapso, libertando o seu conteúdo para o canalículos acinar 6. Nosso objetivo é fornecer as ferramentas básicas para investigadores com mexperiência inimal em procedimentos cirúrgicos e manuseio dos animais, de modo que eles podem realizar com sucesso IVM a uma resolução subcelular. Desde a parte mais desafiadora em IVM é a preparação do animal, aqui vamos nos concentrar na descrição dos procedimentos cirúrgicos básicos que são utilizados para expor e imobilizar os SGs sem comprometer a sua função. Quanto aos procedimentos a etiquetar estruturas subcelulares diversas estratégias, tais como a entrega sistémica de sondas fluorescentes, a utilização de animais transgénicos, ou uma combinação de ambos, têm sido descritos em outros lugares 7,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

Aqui, descrevemos um procedimento para imagem estruturas subcelulares em roedores vivo que é baseado na utilização de microscopia intravital confocal. Como um órgão modelo, usamos as glândulas salivares de ratos vivos, uma vez que oferecem várias vantagens. Em primeiro lugar, elas podem ser facilmente exposta, para permitir o acesso ao sistema óptico, e estabilizado para facilitar a redução dos artefactos de movimento devido a pulsação do coração e da respiração. Isso facilita a criação de imagens e rastreamento de pequenas estruturas subcelulares. Em segundo lugar, a maioria das populações de células das glândulas salivares são acessíveis a partir da superfície do órgão. Isto permite a utilização de microscopia confocal que possui uma resolução espacial mais elevada do que outras técnicas que têm sido usadas para imagiologia in vivo, tais como a microscopia de dois fotões. Finalmente, as glândulas salivares pode ser facilmente manipulado geneticamente e farmacologicamente, proporcionando assim um sistema robusto para investigar processos biológicos a um nível molecular. Neste estudo, centrar-se num protocolo concebido para seguir a cinética da exocitose de grânulos de secreção em células acinares e a dinâmica da membrana plasmática apical que os grânulos de secreção, se fundem com a estimulação dos receptores beta-adrenérgicos. Especificamente, nós usamos um camundongo transgênico que co-expressa GFP citosólica e um peptídeo alvo membrana fundida com a proteína fluorescente tandem-tomate. No entanto, os processos que usamos para estabilizar e imagem das glândulas salivares pode ser alargado a outros modelos de ratinho e acoplada a outras abordagens para etiquetar in vivo de componentes celulares, permitindo a visualização de várias estruturas subcelulares, tais como endossomas, lisossomas, mitocôndrias, e o citoesqueleto de actina.

No GFP / mTomato mouse, os ácinos aparecem como estruturas claramente distintos, que expressam GFP citosólica e direcionada à membrana tandem-Tomate peptídeo (Figura 2, linha quebrada). Em ácinos indivíduo, células acinares são delineadas por o péptido em tandem de tomate. GFP é também detectado nos núcleos que são claramente visíveis no interior das células acinares (Figura 2, as setas). GFP citosólica é excluído dos grânulos secretores que aparecem vesículas circul...

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Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite a imagem latente vários processos biológicos em animais vivos. Neste artigo, é apresentado um método detalhado para a imagem dinâmica das estruturas subcelulares, tais como os grânulos secretores, nas glândulas salivares de ratos vivos.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

intravital-microscopy-for-imaging-subcellular-structures-live-mice

Research

JoVE Journal

Biology

23.5K visualizações.  National Institutes of Health.  Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite a imagem latente vários processos biológicos em animais vivos. Neste artigo, é apresentado um método detalhado para a imagem dinâmica das estruturas subcelulares, tais como os grânulos secretores, nas glândulas salivares de ratos vivos. 

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Biologia

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Labeling fluorescentes de Drosophila Estruturas Coração

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recuperação de fluorescência após p62 fotobranqueamento de amarelo fluorescente proteína marcados em Aggresome induzida por estruturas

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...