Este trabalho é apoiado por ARRA NSF MRI instrumento de desenvolvimento concessão # 0923179 a FMF. Agradecemos do Aqua Asberry, Coordenador Lab para a Parker H. Petit Instituto de Bioengenharia e Ciências Biológicas Histologia Core, para a assistência com o seccionamento do tecido.

1. Tissue Seccionamento <ol><li> Loja de tecidos flash-congelado, inteiro em freezer -80 ° C até que esteja pronto para o corte. </li><li> Permitir que a amostra de tecido para atingir a temperatura no cryomicrotome antes de seccionamento (30 min.) Conjunto da lâmina e a temperatura da amostra a -30 ° C. </li><li> Uma vez que o tecido tenha atingido a temperatura, a manipulação da amostra com uma pinça, corte frontal ou traseira do cérebro, dependendo de qual parte do cérebro é de interesse para montagem em superfície suficiente (ou seja, se a parte frontal do cérebro é de primordial importância, monte traseira do cérebro por chuck). <ol><li> Aplicar ~ 0,5 ml Optimal Cutting Composto Temperatura (OCT, Tissue-Tek, Sakura) para chuck no centro e, usando uma pinça, segure amostra no lugar em outubro, até ela se solidifica. Uma vez que outubro está completamente congelado, montagem do mandril no suporte da amostra. </li><li> Uma quantidade mínima de outubro usado para montar a amostra é preferido (em contraste com a montagem do espécime num bloco de outubro como é feito geralmente na outra histoprocedimentos lógicos) para minimizar a contaminação da amostra. A contaminação da amostra por OCT é prejudicial para o processo de gravação e DESI devido à supressão de iões. </li></ol></li><li> Cortes de tecidos típicos necessários para Range Imaging MS 12-18 m de espessura. Tecidos seção na espessura desejada dentro da faixa recomendada. Descongele montar cada tecido seccionado tocando levemente a temperatura ambiente lâmina de vidro sobre a seção. Uma vez que uma amostra é montada, tenha cuidado para não tocar a secção de tecido, uma vez que irá alterar as distribuições e composições químicas. </li></ol> Nota: Recomendamos a montagem de dois pontos por slide, usando uma seção para a otimização, eo outro para a imagem latente. Se seções não são para a imagem imediato, armazenar lâminas de -80 ° C freezer em uma caixa de slides até que esteja pronto para análise. <ol start="5"><li> Se analisar seções armazenadas, remova slide freezer, transferir imediatamente para exsicador de vácuo, e permitir ~ 15-20min para descongelar. Deixando o espécime no exsicador mais vai secar a amostra e reduzir a eficiência DESI. A optimização da fonte de iões de DESI será feito com a amostra de tecido, uma vez que foi descongelado, no entanto, no interesse de tempo, o período durante o qual a amostra é descongelamento serve como um tempo ideal para a inicialização do equipamento. <ol><li> Usando acetonitrilo com 1% de ácido acético como solvente de DESI, ligar a bomba de seringa, com uma taxa de fluxo de 5 ul / min. Uma taxa de fluxo mais baixa irá reduzir lado do pulverizador DESI e tamanho efectivo de pixel local de impacto, mas uma taxa de fluxo mais elevada pode ser necessário para a sensibilidade suficiente. Portanto, a taxa de fluxo (tipicamente 1-5 mL / min) devem ser otimizados para cada aplicação e a sensibilidade ea resolução desejada. Certifique-se de que a seringa contém solvente suficiente para a otimização completa e imagem em determinada vazão. </li><li> Uma vez que o solvente aparece pingando da ponta fonte, ligue o gás nitrogênio nebulização com um pressure de 160 psi. </li><li> Ligue a fonte de alimentação de alta tensão ligado a fonte de íons de aplicar 3.600 V. </li></ol></li><li> Montar o slide no palco de movimento e começar a fonte de íons e MS otimização </li></ol> 2. DESI Otimização <ol><li> O sistema DESI consiste de uma sonda de origem (ver Figura 2), uma seringa e uma bomba ou sistema de entrega de solvente alternativo, nitrogênio comprimido, estágio da amostra tradução e montagem. Prossiga com a otimização fonte DESI uma vez que o espectrômetro de massas foi ajustado para o intervalo e analitos de interesse massa apropriada. <ol><li> Se os componentes de origem não ter sido ligado, no entanto, referem-se às seções 1.5.1-3 para direções. </li><li> As variáveis ​​discutidas nestas secções são recomendados para a imagiologia de tecidos biológicos. No entanto, estas variáveis ​​devem ser otimizados para diferentes tipos de tecido ou amostra. Solventes alternativos, vazões, pressões de gás de nebulização e tensões têm sido relatados por imaginaçãong de tecidos biológicos 16-18. </li></ol></li><li> Certifique-se de que, inicialmente, a fonte de DESI não está tocando a lâmina de vidro, e não dirigida a qualquer parte da secção de tecido. Isto irá assegurar que a sonda não seja danificado no processo de optimização inicial e não contaminará qualquer parte do conjunto se ao entrar em contacto com a amostra de tecido. <ol><li> Um bom ponto de partida é, com a ponta 3 mm da superfície da amostra e 5 mm a partir da entrada capilar MS, com a sonda a um ângulo de 55 ° em relação à superfície da amostra. O capilar interna da sonda DESI deve estender ~ 1 mm para além do capilar exterior. Todos esses parâmetros serão otimizados. </li></ol></li><li> A interface MS capilar deve ter um ângulo de recolha de ~ 15 ° em relação à superfície da amostra de transferência óptima de iões. Ajustar a altura da fase de modo que os capilares MS paira sobre a superfície da amostra, o capilar deve ser &lt;1 mm a partir da superfície, o mais próximo possívelsem tocar. </li><li> Alinhar a sonda DESI na dimensão x com respeito à entrada de MS capilar de modo a que eles estão directamente em linha. </li><li> Ajuste as yez posições da fonte de DESI para a sensibilidade ideal usando a seção de tecido extra. Note-se que como a sonda de DESI é dirigida a uma área da amostra, que irá, eventualmente, s sorver e ionizar todos os analitos em que a área e o sinal irá diminuir gradualmente como esta ocorre. Executando esta etapa tão rapidamente quanto possível, é importante. <ol><li> Por conseguinte, durante todo o processo de optimização, a amostra tem de ser movido por baixo da cabeça de pulverização para garantir que a nova amostra está a ser analisada e que quaisquer alterações no sinal são devidos a optimização fonte, não depleção da amostra. No entanto, considerando-se que a composição química variada de diferentes regiões do tecido, uma comparação directa da intensidade de iões através da secção de tecido inteiro não é totalmente precisa. O tálamo do cérebro fornece uma área razoavelmente grande porte comcomposição química mais consistente, mas ainda não é perfeitamente uniforme. Alternativamente, uma marcação de Sharpie vermelho, que contém o corante rodamina 6G ([M] +, m / z 443), sobre a lâmina de vidro longe da amostra fornece uma resposta forte por MS de DESI, e também pode ser utilizado para a optimização, mas dada a forma diferente da amostra e do analito, estas condições ainda não se correlacionam com um set-up ideal para tecidos biológicos. </li><li> Recomendado separação y entre a ponta da fonte e entrada capilar: ~ 4 mm, separação z recomendado entre a ponta ea superfície da amostra: ~ 1,5 mm. Embora estes parâmetros será um pouco diferente para cada experimental set-up. </li><li> Considerando a geometria e no ângulo da sonda, levar em conta que as posições z-y e dimensão estão inter-relacionados no que diz respeito à transmissão eficaz de gotas de solvente e do analito contendo. Uma alteração numa variável exige uma modificação ulterior no outro para manter a mesma posição de impacto e de pulverizaçãoseus ângulos de transmissão. </li></ol></li><li> Ajuste a distância das extrusões capilares internas do capilar exterior da fonte para o máximo de sensibilidade, e o tamanho do ponto de impacto mínimo. Atenção: Certifique-se de que a alta tensão é OFF ao fazer este ajuste. </li><li> A geometria da fonte será considerado óptimo quando o sinal máximo é observado. <ol><li> As variáveis ​​otimizadas nas seções 2,5-2,6 estão inter-relacionados, portanto, o ajuste de um vai inerentemente requer o reajuste do outro para manter a geometria necessária fonte-sample-entrada, ou ajuste de condições discutido na seção 1.5.1- 3. </li></ol></li><li> Além disso, um elemento de aquecimento em torno da transferência capilar para o espectrómetro de massa pode melhorar a sensibilidade, facilitando dessolvatação das gotículas carregadas de analito obtidos durante o processo de ionização. Aqui usamos um aquecedor corda enrolada em torno da transferência capilar definido para 100 ° C. </li></ol> 3. Tissue Imagem <ol><li> Durante o processo de gravação, a fase de amostra move-se a amostra por baixo da sonda DESI e MS capilar de entrada e de todos os outros componentes permanecem estacionários. Os parâmetros do movimento da fase deve ser seleccionado com base no impacto de DESI tamanho pluma e sensibilidade óptima. <ol><li> A pluma de maior impacto resultará numa maior intensidade de iões, uma vez que mais de amostra está a ser dessorvida, no entanto, para imagiologia, ele irá também resultar em um tamanho maior do pixel e, assim, piorar a resolução da imagem. </li></ol></li><li> O estágio de translação utilizado nesta experiência é o lar construído e controlado por um programa Labview que permite o controlo da velocidade e rastering espaçamento de linha para uma imagem de dimensões dadas. O VI controle de movimento palco utilizado neste experimento está disponível em omnispect.bme.gatech.edu. Em alternativa, uma fonte de DESI comercialmente disponíveis e poderiam ser utilizados fase tal como o 2D automatizado Omni fonte de borrifar Prosolia Inc. (Indianapolis, IN EUA). <ol><li> Para tecidos cerebrais atamanho típico imagem é de 10 x 15 mm, e tendo em conta os parâmetros de movimento de palco, a imagem vai demorar cerca de 3 horas. <ol><li> Programa LabView VI ou software de controle equivalente para condições de imagem desejada, usando uma velocidade de fase de digitalização de 80 mM / seg, e espaçamento entre linhas de 200 mM. Ao utilizar a fonte de spray Omni, parâmetros de movimento deve ser definido para uma velocidade de digitalização de 100-200 mM / seg e um espaçamento entre linhas de 200 mM. Note-se que estes parâmetros do movimento podem ser alteradas, dependendo do número de pixels em cada dimensão desejadas e sensibilidade necessárias. <ol><li> Um espaçamento menor foi mostrado para melhorar a qualidade da imagem, com a velocidade de varredura de ter menos de um efeito. 25 No entanto, é importante notar que isso não necessariamente indicar e melhor resolução de imagem, uma vez que é fortemente dependente do ponto de impacto tamanho. A velocidade de varredura lenta e espaçamento entre linhas menor vai aumentar significativamente o tempo de análise e, portanto, deve ser optimizaçãozado para cada tipo de tecido ou amostra. </li></ol></li><li> Com a aquisição espectral MS fixado em 1 leitura / seg, e a imagem criada como um pixel de / digitalização, a velocidade de fase define o tamanho do pixel na dimensão x, enquanto o espaçamento entre linhas determina o tamanho do pixel na dimensão y. Embora o tamanho do pixel verdadeira da imagem é maior que este, devido à propagação de pulverizar, o movimento mais lento permite mais tempo para a dessorção e detecção de analitos. </li></ol></li><li> Dê caminho do diretório eo nome do arquivo para a posição e tempo de arquivos a serem gravados durante imagens dentro do LabView VI. </li></ol></li><li> Na preparação para a aquisição de dados de espectro de massa, calcular o tempo total requerido para a imagem latente. O programa Labview utilizado por nosso grupo fornece automaticamente este valor, mas se controle estádio alternativo é usado, este cálculo é necessário para as configurações de aquisição de dados MS. <ol><li> Quando se utiliza uma fonte de pulverização e Omni fase automatizado, cada linha da imagem é adquirida como emindivíduo é executado. O tempo por linha e o número de linhas necessárias para determinadas dimensões de imagem são calculados utilizando o programa de controle do pulverizador Omni ser inseridos no software espectrómetro de massa. </li></ol></li><li> Certifique-se que a velocidade de verificação espectrômetro de massa é um espectro / seg, e definir o tempo de aquisição de instrumento para coincidir com o tempo total calculado. <ol><li> Definir espectral velocidade de digitalização de um espectro / sec. </li><li> Aquisição de dados em modo PROFILE e garantir que a gama m / z é apropriado para as espécies de interesse. Lembre-se que DESI também produz analitos multiplicam carregadas, como em ESI. </li><li> Definir o tempo de aquisição para combinar tempo total da imagem dada pelo LabView. </li></ol></li><li> Posicione o ponto de impacto de pulverização no canto superior esquerdo da área a ser trabalhada. </li><li> Comece a aquisição de dados de MS e de movimento fase simultaneamente. </li><li> Após a conclusão da aquisição de dados, retornar espectrômetro de massa para o modo standby. </li><li> Desligue alta tensão da fonte de DESI. </li><li> Desligue ogás nitrogênio ff. </li><li> Desligar a bomba de seringa. </li></ol> 4. Processamento de Imagem <ol><li> Dados espectrais de massa, em combinação com a fase de tempo e dados de posição guardadas como ficheiros de texto através LabView deve ser &quot;dobrado&quot; numa imagem 2D correlacionando coordenadas de pixels com os espectros correspondentes. As imagens aqui apresentadas foram processadas utilizando o software baseado em Matlab que está disponível gratuitamente em: omnispect.bme.gatech.edu. Se os dados são adquiridos por meio da fonte de pulverização Omni, o software de conversão de dados do vaga-lume é usada para criar o cubo de dados para a visualização da imagem em BioMAP (www.maldi-msi.org). </li><li> Para os dados adquiridos na Jeol AccuTOF espectrômetro de massa, o cromatograma registrado devem ser exportados em formato cdf., Para posterior análise. <ol><li> Usando o DataManager dentro MassCenter, primeiro converta os dados adquiridos aos dados centroided (Ferramentas → converter dados Aquisição de Centroid). Em seguida, exportar os dados em formato cdf. Usando a combinação de teclas Ctrl + Shift + E folseguido pelas Tools → Exportar. </li></ol></li><li> Faça o upload dos dados brutos. Cdf massa espectrais e os dois arquivos de texto, posição e tempo, para o site OmniSpect. Dados de imagem Firefly-processados ​​podem ser visualizados em BioMAP. <ol><li> Processamento adicional dos dados, incluindo análise estatística pelo Fatoração Matrix não-negativo ou plotagem de um único íon de interesse pode ser realizada diretamente no site. </li><li> Alternativamente, o cubo de dados brutos podem ser exportados para análise em Matlab. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Biological+Samples:+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS.">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Pacholski, M. L., Winograd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+Mass+Spectrometry.">Imaging with Mass Spectrometry.</a> Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).</li><li>Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Imaging+at+Atmospheric+Pressure+Using+Desorption+Electrospray+Ionization+(DESI)+Mass+Spectrometry.">Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).</li><li>Nemes, P., Laser Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure,+in+Vivo,+and+Imaging+Mass+Spectrometry.">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric-pressure+Molecular+Imaging+of+Biological+Tissues+and+Biofilms+by+LAESI+Mass+Spectrometry.">Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).</li><li>Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -. N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+microjunction+surface+sampling+probe+electrospray+mass+spectrometry+for+detection+of+drugs+and+metabolites+in+thin+tissue+sections.">Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections.</a> J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).</li><li>Tak&#225;ts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Sampling+Under+Ambient+Conditions+with+Desorption+Electrospray+Ionization.">Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization.</a> Science. 306, 471-473 (2004).</li><li>Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Dynamics+and+Ionization+Mechanisms+in+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).</li><li>Costa, A. B., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+atmospheric+transport+and+droplet-thin+film+collisions+in+desorption+electrospray+ionization.">Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization.</a> Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).</li><li>Costa, A. B., Graham Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+splashes:+Elucidating+the+mechanism+of+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).</li><li>Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+Mechanism+of+Electrospray+Ionization.">Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization.</a> Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).</li><li>Kebarle, P., Verkerk, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray:+From+ions+in+solution+to+ions+in+the+gas+phase,+what+we+know+now.">Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now.</a> Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).</li><li>Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+electrospray+solvent+composition+on+desorption+electrospray+ionisation+(DESI)+efficiency+and+spatial+resolution.">The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution.</a> Analyst. 135, 731-737 (2010).</li><li>Van Berkel, G. J., Kertesz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Sampling+and+Imaging+of+Analytes+Separated+on+Thin-Layer+Chromatography+Plates+Using+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).</li><li>Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+and+other+ambient+ionization+methods:+current+progress+and+preview.">Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview.</a> Analyst. 135, 669-681 (2010).</li><li>Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+lipid+characterization+and+biological+tissue+imaging.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).</li><li>Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+adrenal+gland+by+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 28-32 (2010).</li><li>Wiseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry:+Imaging+drugs+and+metabolites+in+tissues.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).</li><li>Eberlin, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classifying+Human+Brain+Tumors+by+Lipid+Imaging+with+Mass+Spectrometry.">Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry.</a> Cancer Res. 72, 645-654 (2012).</li><li>Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+by+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).</li><li>Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-Layer+Chromatography+and+Mass+Spectrometry+Coupled+Using+Desorption+Electrospray+Ionization.">Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization.</a> Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).</li><li>Lane, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+reveals+surface-mediated+antifungal+chemical+defense+of+a+tropical+seaweed.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).</li><li>Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+Surface+Alignment+Considerations+in+Chemical+Imaging+with+Desorption+Electrospray+Mass+Spectrometry.">Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).</li><li>Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+imaging+resolution+in+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).</li><li>Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+spatial+resolution+in+the+imaging+of+biological+tissue+using+desorption+electrospray+ionization.">Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).</li><li>Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Whole-body+Sections+Down+to+Cellular+Level,+Multiscale+Imaging+of+Phospholipids+by+MALDI+Mass+Spectrometry.">From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).</li><li>Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+quality+in+tissue+analysis+using+desorption+electrospray+ionization.">Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).</li><li>Jackson, S. N., Wang, H. -. Y. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Profiling+of+Lipid+Distribution+in+Brain+Tissue+Using+MALDI-TOFMS.">Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS.</a> Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).</li><li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ion+mobility-TOFMS+imaging+of+lipids+in+rat+brain+tissue.">MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue.</a> J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).</li><li>Wang, H. -. Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimalist+approach+to+MALDI+imaging+of+glycerophospholipids+and+sphingolipids+in+rat+brain+sections.">A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections.</a> Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).</li><li>Wu, B., Becker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+elements+and+molecules+in+biological+tissues+and+cells+in+the+low-micrometer+and+nanometer+range.">Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range.</a> Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).</li><li>Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Vizualization+of+Mouse+Brain+by+Lipid+Analysis+Using+Ambient+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).</li><li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Imaging+by+Mass+Spectrometry:+A+New+Frontier.">3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier.</a> Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Pulfer, M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+mass+spectrometry+of+phospholipids.">Electrospray mass spectrometry of phospholipids.</a> Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).</li><li>Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalogen+deficiency+in+early+Alzheimer's+disease+subjects+and+in+animal+models:+molecular+characterization+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).</li><li>Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+levels+are+altered+in+down+syndrome+brain.">Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain.</a> Brain Res. 867, 9-18 (2000).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Myocardial+Cardiolipin+Content+and+Composition+Occur+at+the+Very+Earliest+Stages+of+Diabetes:+A+Shotgun+Lipidomics+Study.">Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study.</a> Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A otimização da geometria de origem DESI é fundamental para as experiências bem-sucedidas MSI. As múltiplas variáveis ​​que contribuem para o alinhamento do sistema de afectar directamente a sensibilidade e resolução de imagem. Se durante a optimização, o experimentador tem dificuldades na obtenção do sinal, é recomendável usar mancha vermelha Sharpie desenhada na corrediça, como um valor de referência, o corante, a rodamina 6G, m / z 443, produz um forte sinal no modo de ião positivo e pode ser usa...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50575" target="_parent">Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry</a>. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:
Rachel V. Bennett
instead of:
Rachel V. Bennet

Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Imagem não segmentados por espectrometria de massa facilita a aquisição de informações químicas para aplicações de descoberta e hipótese de geração. Imaging alvo de uma substância química conhecida de interesse, por outro lado, pode facilitar o aumento da sensibilidade e seletividade através de desenvolvimento de método específico. Espectrometria de massa de imagem (MSI) é mais comumente realizada em tecidos utilizando MALDI, uma espectrometria de massa de íons secundários (SIMS), 2 e técnicas de ionização ambiente, incluindo dessorção ionização electrospray (DESI), 3-ablação a laser de ionização electrospray (LAESI), 4, 5 e líquido micro-junção da superfície Sonda (LMJ-SSP). 6 Em MALDI e SIMS, as amostras têm de ser fisicamente removido do espécime, e tem que ser plana e fina, como são analisados ​​sob alto vácuo. MALDI requer revestimento da amostra com uma matriz de absorção de radiação, a adição de um passo adicional e pesado para a preparação da amostra. SIMStem a mais alta resolução lateral, mas o bombardeamento com partículas altamente energéticas provoca a fragmentação molecular grande. Portanto, a MSI por métodos ambientais preencher um nicho onde a análise macio com a preparação da amostra mínima é desejável. No entanto, até à data, todos os métodos são ainda limitada pela exigência de superfícies de amostras planas. DESI usa um spray solvente carregada pneumaticamente assistida dirigido para a superfície da amostra para desadsorver e ioniza analitos. 7 O modelo de trabalho para a dessorção e ionização por subsequente DESI é conhecida como a &quot;gota de pick-up model&quot;. 8-10 As gotículas carregadas primárias produzido pela sonda DESI colidem com a superfície, e molhando-formação de uma película fina em que o analito é dissolvido por um mecanismo microextracção sólido-líquido 8 subsequente gota resultam em colisões de transferência de momento e descolagem de gotículas secundárias contendo o material extraído da superfície . 9,10 Finalmente, o gásiões de fase são acreditados para ser produzido através de processos como a ESI-após evaporação de iões, os modelos de resíduos de carga ou de outros modelos, 11 no entanto, o processo de formação de iões preciso em DESI ainda tem que ser comprovada experimentalmente. sensibilidade 12 DESI é fortemente dependente da solubilidade do analito em solvente do pulverizador, como dessorção depende do microextracção localizada 13. Quando usado com uma fase de amostra controlado por software, a amostra é analisada unidireccionalmente com pista pisar debaixo da sonda de ionização de DESI, e através do domínio do tempo, m / z informação é correlacionada com a distribuição espacial da espécie química &quot;(Figura 1). Desde a primeira prova de princípio experimento DESI-MSI relatado por Van Berkel e Kertesz em 2006, 14 a técnica amadureceu consideravelmente, 15 com aplicações relatadas na análise de lipídios, 3,16 metabólitos de drogas, 17,18 doenbiomarcadores si, 19 tecido cerebral, 3,18,20 tecido pulmonar, 18 de tecido do rim, 18 de tecido testicular, 18 glândulas supra-renais, 17 placas de cromatografia em camada delgada, 21 e superfícies de algas. 22 A resolução rotina de imagens obtidas por DESI-MSI é 100-200 um, que é finalmente determinada pela área de superfície efectiva extraída pelo spray, mas resoluções tão baixo como 40 um foram relatados. 23-25 ​​Tal resolução e facilitar a análise torna-DESI MSI adequado para a análise rápida e simples de amostras de tecidos biológicos com áreas de superfície na faixa de 0,5-5 cm 2, permitindo a aquisição de informação espacial valioso para entender melhor os processos biológicos 26. Aqui, como um exemplo de uma aplicação típica DESI-MSI, vamos rever os detalhes processuais da realização de uma experiência bem sucedida envolvendo imagens de lipídios nos tecidos de cérebro de rato. As duas etapas mais críticas do protocolo são apreparação de tecido 27 e DESI optimização fonte de iões, tal como descrito abaixo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura-Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td><a href="http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48" target="_blank">http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0156-6</td>
			<td>OmniSolv, LC-MS Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092-500 ml</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CryoStar* NX70</td>
			<td>Any available microtome can be used for tissue sectioning <a href=" http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar" target="_blank"> http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Omni Spray;DESI Spray Head</td>
			<td>Prosolia Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment <a href=" http://www.prosolia.com/sources.php" target="_blank"> http://www.prosolia.com/sources.php</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>High Voltage Power Supply</td>
			<td>Stanford Research Systems, Inc.</td>
			<td>PS350/5000V-25W</td>
			<td><a href="http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm" target="_blank">http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rope heater, RTD, controller</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters" target="_blank">http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Version 7.1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Translational stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Optiscan II</td>
			<td><a href="http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html" target="_blank">http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AccuTOF Mass Spectrometer</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JMS-T100LC</td>
			<td>Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging of biological tissues by desorption electrospray ionization mass spectrometry

Espectrometria de massa de imagem (MSI) fornece informações molecular segmentados com a maior especificidade e resolução espacial para a investigação de tecidos biológicos para as centenas para dezenas de escala de microns. Quando realizada sob condições ambiente, o pré-tratamento da amostra torna-se desnecessário, simplificando assim o protocolo, mantendo a elevada qualidade das informações obtidas. Dessorção de ionização por electrospray (DESI) é uma técnica baseada em MSI ambiente de pulverização, que permite a amostragem directa das superfícies, ao ar livre, mesmo in vivo. Quando usado com uma fase de amostra controlado por software, a amostra é rastered debaixo da sonda de ionização de DESI, e através do domínio do tempo, m / z informação é correlacionada com a distribuição espacial da espécie química &quot;. A fidelidade da saída DESI MSI depende da orientação da fonte e do posicionamento em relação à superfície da amostra e uma entrada de espectrómetro de massa. Aqui, nós revisamos como preparar cortes de tecido para DESI imaging e condições experimentais adicionais que afetam diretamente a qualidade de imagem. Especificamente, nós descrevemos o protocolo para a imagem de cortes de tecidos de cérebro de rato por desi-MSI.

A Figura 3 mostra um espectro obtido a partir de um representante secção de cérebro de rato não tratado. No modo positivo, o espectro de massa é dominada por fosfatidilcolinas, devido às suas elevadas eficiências de ionização (atribuído ao grupo amónio quaternário carregado positivamente). A imagem total de iões da secção de tecido é também mostrada na Figura 3, que mostra o sinal abundante em toda a secção do cérebro inteiro. Lípidos chave detectados são identific...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Dessorção de espectrometria de massa com ionização por electropulverização (DESI-MS) é um método pelo qual as amostras do ambiente, incluindo os tecidos biológicos, pode ser trabalhada com a preparação da amostra mínima. Por rastering a amostra abaixo da sonda de ionização, esta técnica baseada em pulverizador fornece resolução espacial suficiente para discernir as características moleculares de interesse dentro de cortes de tecido.

Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

imaging-biological-tissues-desorption-electrospray-ionization-mass

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.4K visualizações.  Georgia Institute of Technology. Dessorção de espectrometria de massa com ionização por electropulverização (DESI-MS) é um método pelo qual as amostras do ambiente, incluindo os tecidos biológicos, pode ser trabalhada com a preparação da amostra mínima. Por rastering a amostra abaixo da sonda de ionização, esta técnica baseada em pulverizador fornece resolução espacial suficiente para discernir as características moleculares de interesse dentro de cortes de tecido.

Vídeo: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Bioengenharia

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Amostra Estratégias Preparação para Mass Spectrometry imagem da cultura celular 3D Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caracterização qualitativa da fração aquosa de Hydrothermal Liquefação de algas por cromatografia gasosa 2D com Time-of-flight Espectrometria de Massa

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Engenharia 'Dourada' fluorescência por pressão seletiva de incorporação de aminoácidos não-canônicos e análise de proteínas por espectrometria de massa e fluorescência