O protocolo descreve como registrar um perfil de mobilidade de íons para os fragmentos produzidos após a ativação de uma molécula no espectrômetro de massa, e discriminar entre estruturas isomericas. O protocolo permite que os glicocanos sejam classificados em 11 grupos em relação a algumas de suas principais características estruturais e, assim, forneçam informações de outra forma difíceis de obter. Pode servir para construir redes moleculares que são extremamente genéricas e adequadas para muitas famílias moleculares, como metabólitos ou drogas de interesse em muitas áreas de pesquisa.
A abordagem aproveita ao máximo um novo conceito na espectrometria de mobilidade de íons, e será útil onde só a espectrometria de massa não discriminará entre duas estruturas. O experimento requer um bom comando de espectrometria de massa e mobilidade de íons. No entanto, o experimentador deve ser bem sucedido na implementação do método se seguir cuidadosamente cada uma das etapas.
Demonstrando o procedimento será Simon Ollivier, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, configure uma sequência IMS de passe único a partir da página Tune, coloque o instrumento no modo Mobility e abra a janela Controle de Sequência Cíclica. Selecione o modo Avançado na guia Funções Cíclicas desta nova janela, selecione Adicionar pacote e, em seguida, Single/Multipass.
Aguarde que uma sequência de eventos de mobilidade apareça na guia Sequência da mesma janela. Adapte a sequência para que todos os íons calibrantes façam uma única passagem ao redor da pista cíclica do IMS. Não altere o tempo de injetar ou o tempo de Ejeção e Adquira, no entanto, reduza o tempo separado para um milissegundo.
Se alguns íons da mistura de calibração não se encaixarem na janela de tempo de chegada exibida, altere a sincronização do IMS com o empurrador do analisador TOF de aceleração ortogonal aumentando o número de empurrões por caixa na guia Configurações ADC. Para gravar uma aquisição de dois minutos na janela Controle de Sequência cíclica, clique em Adquirir para abrir a janela pop-up Configurações de aquisição, insira o nome de arquivo, descrição e comprimento de aquisição, minutos e clique em Salvar. Mude o instrumento para o modo TOF a partir da página MS Tune para verificar a estabilidade do sinal.
Registoso da aquisição completa da amostra por um minuto, o que será útil para verificar o padrão isotópico e a presença de potenciais contaminantes. Coloque o instrumento no modo MSMS a partir da guia de perfil Quad/MS da página principal de sintonia. Selecione a massa do ferro alvo no campo de massa MSMS para isolamento no quadrupole.
Registo uma aquisição de um minuto para verificar o isolamento precursor ao processar os dados. Para executar uma seleção baseada em mobilidade do isômero de interesse, mude o instrumento para o modo Mobilidade na janela Controle de Sequência Cíclica, a partir da guia Funções Cíclicas, selecione Adicionar pacote e, em seguida, fatiamento. Aguarde que uma sequência complexa de eventos de mobilidade apareça na guia Sequência.
Posicione o evento Ejetar e adquirir logo após o primeiro evento Separado e, em seguida, clique em Executar. Procure os resultados da separação inicial a ser exibida em tempo real. Aumente a duração do primeiro evento Separado para uma separação de vários passes alterando o valor de tempo para este evento na sequência até que a resolução dos picos do IMS seja satisfatória.
Registo uma aquisição de um minuto para referência. Clique em Pausar, posicione o evento Ejetar e Adquirir abaixo dos eventos Eject, Eject to Pre-Store e Hold e Eject. Ajuste a duração dos eventos de modo que o pico alvo esteja na região do Ejetar para Pré-Loja, e qualquer outro íon esteja na região de Ejetar ou Hold e Ejetar.
Posicione o evento Eject and Acquire no final da sequência abaixo do Reinject da Pré-Loja e do segundo Eventos Separados. Clique em Executar para exibir a população selecionada. Verifique a qualidade do isolamento.
Registo uma aquisição de um minuto para referência. Na guia Sequência, na coluna ao lado dos horários de evento definidos pelo usuário, procure os tempos resumidos de todos os eventos. Tome nota do Time Abs encontrado na linha do evento Reinject from Pre-Store para realizar a calibração CCS.
Defina a duração do evento Separado, procedendo diretamente o Ejeto e a Aquisição em um milissegundo. Na linha Reinject da Pré-Loja, marque a caixa Ativar e otimize a fragmentação com o controle embutido. Se a fragmentação não for satisfatória com o controle embutido, desmarque a caixa de ativação e continue a otimizar manualmente as tensões de reinjeção, aumente o Gradiente Pré-Array e baixe a tensão de deslocamento do array até que os resultados sejam satisfatórios.
Para registrar uma aquisição de dois minutos na janela popup Acquisition, marque a opção Reter tempo de deriva para gerar um arquivo contendo apenas os tempos de chegada, contra M sobre Z rotulado como _dt.raw. Após a realização da análise em MS da mistura de pentasacarídeo arabinoxylan, o espectro apresentou um padrão isotópico com um único pico de M sobre z 685,24 sugerindo que os dois compostos são isomericos na natureza. Os adutos dos pentasacarídeos foram separados através da célula IMS cíclica, e três picos foram separados com diferentes tempos de chegada.
O XA3XX puro mostra os picos em 83 e 90 milissegundos, enquanto o XA2XX exibe um pico de 94 milissegundos. Após a primeira etapa da separação do IMS, íons pertencentes ao XA3XX foram ejetados, e o pico em 94 milissegundos foi selecionado para análise do IMS-IMS. Uma separação de três passes foi realizada após reinjetar o íon sem ativação, e um pico para XA2XX foi obtido em 199 milissegundos.
Os dados gerados do IMS-IMS MS foram desarvolvados usando o tempo de chegada e as dimensões M over Z, gerando o espectro IMS-IMS. Os picos acima de 0,2% de intensidade relativa foram exportados para calibração do CCS, resultando em um espectro IMS-IMS calibrado pelo CCS. É sempre importante verificar o isolamento do íon precursor, caso contrário, o espectro pode vir de uma mistura do composto de juros e dos contaminantes.
Anteriormente, usamos espectros IMS-IMS para construir redes e classificar compostos, mas eles também poderiam ser usados para procurar em bancos de dados para identificação de compostos. Esta técnica é muito recente, mas esperamos que seja extremamente útil em glicemias, bem como em qualquer contexto onde os analistas sejam confrontados com moléculas isomeméricas.
