Os autores gostariam de agradecer Genoma Canadá e Genoma British Columbia para financiamento plataforma e suporte. Agradecemos também a Dra. Carol E. Parker para revisão crítica da assistência manuscrito e edição. CHL também graças a Columbia Proteômica rede britânica de apoio.

1. Seccionamento Tissue <ol><li> Flash-congelar as amostras de emissão, uma vez colhidas, utilizando nitrogênio líquido, enviá-los em gelo seco (se o transporte for necessário), e armazená-los a -80 ° C até o corte do tecido. (Se forem utilizadas amostras comerciais, assegurar que as amostras são preparadas deste modo.) </li><li> Corte órgãos para um tamanho gerenciável para atender a meta de MALDI. Apare quaisquer partes não desejadas do órgão. Para este estudo descrito aqui, as lentes de bovino foram decapsulated utilizando um procedimento previamente descrito 35 antes de seccionamento de tecidos. </li><li> Remover órgãos inteiros a partir do freezer -80 ° C e corrigi-los em uma fase de corte de tecidos criogênico. Para corrigir uma lente de vitelo, coloque uma ou duas gotas de água na fase de corte de tecidos de um criostato. Rapidamente coloque a lente na água antes de ela se solidifica. Alternativamente, a temperatura de corte óptima (OCT) compostos também podem ser usados ​​para fixar um tecido para a fase de corte. Se forem utilizados compostos outubro, um minimal quantidade de outubro deve ser aplicada, e deverá ser tomado cuidado para assegurar que as secções de tecido de corte não será contaminada com compostos outubro que podem interferir com a detecção e ionização dos analitos 5,36,37. </li><li> Permitir que a temperatura no interior do criostato para equilibrar a -18 ° C. Temperaturas mais baixas ou altas podem ser usadas para os tecidos moles ou duras, respectivamente. Em seguida, corte o tecido equatorialmente em 20 mM fatias grossas. Use 10-15 uM rodelas grossas para a maioria dos tecidos, no entanto, por causa da fragilidade do tecido da lente de bovino, foram utilizados 20 uM de espessura. Para tecido lente bovina, descarte as seções primeiros tecidos e só usar fatias que estão perto ou no plano equatorial. </li><li> Se um tecido ocular é trabalhada, utilizar de 1,5 mL de ácido fórmico (98% em pureza, LC-MS grau) para prewet a superfície de um óxido de índio e estanho (ITO) revestido lâmina de vidro. </li><li> Transferir cuidadosamente as secções de tecido para a superfície do ITO-cociado vidro lâmina de microscópio dentro do criostato. O corte de tecido rapidamente descongelar e vai se tornar firmemente afixada à superfície do slide. Geralmente, várias secções de tecido podem ser montados numa mesma lâmina revestida de ITO desta forma. </li><li> Liofilização o slide por 15 minutos antes da aplicação da matriz MALDI. </li><li> Para os testes de matriz, dissolver as matrizes individuais, em solventes apropriados. Identificar manualmente 1 ml de cada solução de matriz para a secção de tecido. Além disso, identificar um padrão de calibração de pequenas moléculas para o tecido para verificação da sensibilidade MALDI. </li><li> Adicione três marcas de ensino para a lâmina de vidro ITO revestido por escrever sobre a superfície não condutora da lâmina de vidro ITO revestido com uma caneta corretiva-fluido. Pegue uma imagem óptica do slide tecido usando um scanner de mesa e guardá-lo em um formato adequado, como tiff ou jpg. </li></ol> 2. Matriz de Revestimento 2.1. Automated Matrix Revestimento <ol><li> ApAs soluções matriciais camadas, que contêm o acetonitrilo ou misto de acetonitrilo / água como solventes, automaticamente para as superfícies das secções de tecido, utilizando um Bruker ImagePrep ou um pulverizador semelhante matriz electrónica. </li><li> Cobrir as bordas da superfície da frente da lâmina de vidro ITO revestido com fita de modo a que a matriz não se revestir os bordos da lâmina. Isto assegura que as marcas de ensino sobre a superfície oposta pode ser usado para o alinhamento do tecido deslizante. Não cobrir as extremidades da corrediça com a matriz à medida que são usadas como pontos de contacto para manter a condutividade eléctrica da corrediça ITO revestido. </li><li> Revestir a lâmina de vidro, utilizando vinte ciclos de revestimento de matriz (2-sec pulverização, 30 seg de incubação, e 60 seg de tempo de secagem para cada ciclo). </li></ol> 2.2. Manual de matriz de revestimento <ol><li> Se os solventes orgânicos (por exemplo, clorofórmio e acetato de etilo), que são incompatíveis com os materiais da matriz pulverizador electrónico de fabricação são requivermelho, use um pulverizador airbrush pneumaticamente assistida para aplicar a matriz. Adicione a solução matriz preparada para o reservatório de solvente do injetor do airbrush e aplicar um fluxo suave de gás nitrogênio pressurizado para preparar o spray. </li><li> Cobrir as bordas da superfície frontal das lâminas de vidro ITO revestido com fita de modo a que a matriz não se revestir os bordos da lâmina. Isto assegura que as marcas de ensino sobre a superfície oposta pode ser usado para o alinhamento do tecido deslizante. Não cobrir as extremidades da corrediça com a matriz à medida que são usadas como pontos de contacto para manter a condutividade eléctrica da corrediça ITO revestido. </li><li> Depois de ter sido observado sprays estáveis ​​e finos, spray manualmente a matriz para que ele reveste completamente a secção de tecido. Aplique a quantidade mínima de solução matriz necessário para mal molhar a superfície durante cada ciclo para evitar uma possível deslocalização analito. Em geral, utilizam aproximadamente 10 ciclos de pulverização para o revestimento de uma matriz de corte de tecido, o número de ciclos édepende do tipo de tecido e composição da matriz. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> Prepara-se uma solução de calibração de massa através da diluição da solução de &quot;ES ajuste Mix&quot; padrão por um factor de 1:200 em 60:40 de isopropanol: água (contendo 0,1% de ácido fórmico na mistura final). </li><li> Introduzir 2 mL / min da solução &quot;ES Sintonia Mix&quot; diluído na dual-mode ionização electrospray (ESI) / fonte de íons MALDI no espectrômetro de massa FTICR, do lado da ESI. </li><li> Utilizar o aparelho FTICR no modo ESI positivo-ion, com detecção de banda larga e um tamanho de aquisição de dados de 1.024 kb / seg. Os parâmetros típicos são ESI tensão electropulverização capilar, 3900 V; pulverizar tensão escudo, 3600 V; gás nebulizador (N 2), fluxo, 2 L / min, gás seco (N 2) e a temperatura de fluxo, de 4 L / min e 200 ° C; skimmer uma tensão de 15 V, o tempo de vôo (TOF), 0,009 s; gás de colisão (Ar) de fluxo, 0,4 L / s; fonte de íons acumulação tempo, 0,1 seg;e célula de colisão de íons acumulação tempo, 0,2 seg. Ajustar os parâmetros de operação FTICR, a fim de maximizar a sensibilidade analítica sobre a faixa de massa de m / z de 200 a 1.400, enquanto que a manutenção da boa no domínio do tempo de indução livre de cárie sinais (FID). Normalmente, os parâmetros de operação ICR são tensão ajudante, 8 V; sidekick tensão de offset, 8 V; amplificação excitação de 10; excitação tempo de pulso, 0,01-,015 seg; frente tensão da placa armadilha, 1,5 V; armadilha de volta tensão de placa, 1,6 V e tensão de entrada do analisador, -4 V. Depois de um conjunto de parâmetros de operação FTICR tem sido determinada, obter o espectro de massa ESI e calibrar o instrumento, utilizando as massas dos compostos de referência padrão na solução de &quot;ES ajuste mistura&quot;. </li><li> Para afinar o instrumento para uma operação de MALDI, dissolver várias aliquotas de 1 ul de uma solução mista e terfenadina padrão reserpina na solução da matriz a uma concentração de 1 | iM de cada, e detectar estas soluções directamente sobre uma das tissue secções (ou seja, uma secção de tecido de teste) o qual foi montado sobre uma corrediça de ITO revestido. Colocar a lâmina ITO revestido numa placa de corrediça de tecido (ou seja, um alvo de MALDI especial) e carregar o adaptador do lado de MALDI na fonte de iões ESI / MALDI dupla. Otimizar os parâmetros de funcionamento MALDI apropriadas para a potência do laser e do número de disparos de laser para a acumulação de sinal MALDI para cada digitalização em massa, etc parâmetros de operação MALDI típicos são: disparos de laser, de 50, e uma MALDI tensão da placa de 300 V. </li><li> Depois de tuning, calibrar e otimizar o instrumento para experimentos MALDI-MSI, alinhe a localização física de uma secção de tecido a ser trabalhada com a sua imagem óptico registrado no software de imagem. Use as três marcas &quot;de correcção de líquido&quot;, que tinha sido previamente colocados no lado oposto da superfície de deslizamento de ITO revestido (passo 1.9), para este alinhamento, utilizando um método de triangulação de três pontos. </li><li> Realize uma ESI simultânea e MALOperação DI de modo que cada espectro de massa contém os picos de massa de referência da solução &quot;ES Sintonia Mix&quot; para o pós-aquisição de calibração de massa interna. Isto irá resultar na massa medição mais precisa durante o MALDI MS. Para isso, em primeiro lugar atenuar o sinal ESI, diminuindo a tensão capilar até os sinais MALDI dominar os espectros, enquanto os sinais de calibração ESI são ainda suficientemente elevada para a calibração interna de massa. </li><li> Em seguida, configure um método automatizado para rastering irradiação laser. Definir as regiões de tecido a ser trabalhada e definir o tamanho adequado passo varredura laser. Note-se que tamanhos de passo menor raster fornecer imagens de tecido com maior resolução, mas requerem um tempo significativamente mais longo massa espectral aquisição e mais espaço de armazenamento de dados. O número de pixels da imagem que é dependente do tamanho do passo de varredura a laser para configurar e a dimensão do tecido. Para uma lente de bovino típico que tem um tamanho de tecido de 1 cm2, de uma imagem de tecido é geralmente composto de ca. </em&gt; 5000 pixels se um tamanho de passo de varredura a laser de 200 um é usado em um instrumento FTICR. Use uma análise &quot;ponto aleatório&quot;, pois isso evita viés baseado em localização, devido à atenuação do sinal gradual durante o experimento. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Calibrar os espectros de massa MALDI usando calibração interna para a comparação inicial e selecionar picos para MS / MS. De-isótopo e selecionar os picos monoisotópico conforme descrito anteriormente, usando um script VBA personalizada 38. </li><li> Exportar o resultado listas de pico monoisotópico e introduzir os valores medidos m / z para o METLIN 39 e / ou bancos de dados de metaboloma HMDB 40 para correspondência em massa com as entradas de biblioteca. Considere o (M + H) +, (M + Na) + e (M + K) + iões durante as pesquisas de banco de dados, com um erro de massa permissível de ± 1 ppm. </li><li> Gerar imagens de MALDI para todas as entidades de lípidos detectados através da secção de tecido inteiro usando imagsoftware e-análise, com uma largura de filtro de massa de 1 ppm no vértice do pico. </li><li> Uma vez que as imagens tenham sido gerados para todos os valores de m / z que correspondem as entradas do banco de dados, gerar imagens para todos os outros picos, assim como para procurar padrões de distribuição exclusivas que podem ser investigados posteriormente. </li></ol> 5. A confirmação das identidades dos Lipídeos fotografada <ol><li> Confirmar as identidades dos lípidos elevada abundância, que têm iões fragmentados característicos que podem ser detectados utilizando o instrumento FTICR (por exemplo, 184,073 para fosfolípidos), por MALDI-MS/MS. Realizar MALDI-MS/MS usando induzida por colisão de dissociação (CID) directamente sobre o tecido. </li><li> Para as espécies de lípidos que não podem ser directamente confirmados por MALDI-MS/MS, usar um sistema UPLC acoplado a um espectrómetro de massa Q-TOF 34. <ol><li> Dissecar manualmente alíquotas contendo ~ 10 mg de tecido a partir da área onde as espécies de interesse estava localizada. Coloque essas alíquotas de tecido em 2tubos de centrífuga ml. </li><li> Homogeneizar cada alíquota tecido em 250 mL de água, usando um moinho misturador com duas bolas de metal em aço inoxidável 5 milímetros. </li><li> Adicionar 1 ml de solução em clorofórmio-metanol (1:3, v / v), e os tubos de vórtice. Em seguida, centrifugar os tubos utilizando uma microcentrífuga a 12000 xg durante 10 min. </li><li> Recolher os sobrenadantes e seque-as em um concentrador de velocidade rotativo a vácuo. </li><li> Dissolve-se os resíduos em 100 mL de isopropanol: água 30:70. Injectar uma alíquota de 10 uL na coluna UPLC de separação utilizando uma eluição de gradiente. </li><li> Use as condições cromatográficas para LC-MS/MS em linha lipídicas, que foram previamente publicados 34. </li><li> Corrente de iões gerar extraída (XIC) cromatogramas usando os valores teóricos, m / z, com uma janela de ± 50 ppm em torno das massas teóricas. </li><li> Se os compostos autênticos para esses lípidos estão disponíveis, coincidir com os tempos de retenção dos compostos autênticos com aqueles do correspondente XIC picos das amostras de tecido. Se os compostos são a mesma, os tempos de retenção e dos espectros de MS / MS deve corresponder. </li></ol></li><li> Se um composto autêntico não estiver disponível, utilize o padrão de fragmentação do lípido detectado para corresponder a um padrão do espectro MS / MS a partir de uma base de dados tal como metaboloma METLIN ou HMDB. Use de novo de interpretação do espectro de massa para determinar uma possível estrutura para o lípido. </li></ol>

Não temos nada a divulgar.

As considerações mais importantes para o sucesso MALDI MSI são: 1) a preparação do tecido, 2) escolha matriz; 3) aplicação de matriz e 4) interpretação e análise de dados. Quando a amostra e a matriz são adequadamente preparados, a aquisição de dados do MS é automatizado. A análise de dados a partir deste tipo de experiência é bastante trabalhoso. Preparação do tecido adequado é fundamental para experimentos MALDI MSI sucesso. A fonte de tecido e o tratamento pode ter um ...

Imagiologia de espectrometria de massa (MSI) é uma técnica analítica para determinar os padrões de localização e distribuição espacial dos compostos sobre a superfície de uma secção de tecido de 1,2. Matrix assistida a laser dessorção / ionização (MALDI) MSI para a análise de peptídeos e proteínas tem sido usado por mais de uma década e tem havido grandes melhorias em métodos para a preparação da amostra, a sensibilidade de detecção, resolução espacial, reprodutibilidade e processamento de dados 3,4. Ao combinar informações das secções histologicamente coradas e experimentos MSI, patologistas são capazes de correlacionar as distribuições de compostos específicos, com características interessantes fisiopatologicamente 5. Os padrões de distribuição de moléculas pequenas, incluindo drogas exógenas 6,7 e seus metabolitos 8-10 também foram interrogados por MALDI-MS imagiologia do tecido 11. Os lipídios são, talvez, o cla mais amplamente estudadoss de compostos com imagens MALDI, tanto em MS 12-17 e MS / MS 18 modos. O uso de MALDI MSI molécula pequena imagem tem sido limitado por vários factores: 1) matrizes MALDI são eles próprios moléculas pequenas (tipicamente de m / z &lt;500), que geram os sinais iónicos abundantes. Estes sinais abundantes pode suprimir a ionização de analitos de pequenas moléculas e interferir com a sua detecção 19,20. Livre de solvente revestimento de matriz 21, matriz de sublimação 22, e matriz de pré-revestidas MALDI MS 23, entre outros, têm sido desenvolvidos para melhorar a MSI de pequenas moléculas. Novas matrizes que podem melhorar a análise de compostos de baixa MW são de grande interesse na pequena molécula MSI. Estas matrizes devem proporcionar sinais de analitos aumentou com sinais de matriz diminuiu. No modo positivo de iões, 2,5-di-hidroxibenzóico Ácido (DHB) e-4-hidroxicinâmico α-ciano de ácido (CHCA) são os dois comumente utilizadas matrizes de MALDI MS para 24 MSI </sup&gt;. A matriz ideal seria formar pequenos cristais, de modo a preservar a localização espacial dos analitos. DHB tende a formar cristais de maiores dimensões, por conseguinte, a aplicação da matriz usando sublimação foi desenvolvida para ultrapassar parcialmente o problema, e permitiu a utilização desta matriz para imagiologia sensível de fosfolípidos 22,25. 9-aminoacridina foi usado para MSI de analitos próticos no modo positivo de iões 26, e para os nucleótidos e fosfolípidos no modo de ião negativo 26-29. 2-Mercaptobenzotiazole tem sido encontrado para dar detecção MALDI eficiente de lipidos 30, e tem sido utilizado para a imagem do cérebro do rato gangliósidos 31. A resolução ultra-alta de Fourier íon ciclotron de ressonância (FTICR) espectrômetros de massa tanto pode aliviar este problema, resolvendo sinais de analitos a partir de sinais de matriz 32. Outra vantagem do uso de FTICR-MS é que as intensidades dos aglomerados de matriz são metastáveis ​​reduçãoed 33, o que também reduz essas interferências 27. O uso de ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) na forma de uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecidos tem sido previamente reportado 34. No presente trabalho, um protocolo detalhado é fornecida para a utilização de DT para o MSI de lípidos endógenos na superfície das secções de tecido da lente de bovino, no modo de iões positivos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

Imagiologia de espectrometria de massa (MSI) determina os padrões de localização e distribuição espacial dos compostos sobre a superfície de uma secção de tecido, utilizando principalmente MALDI (matriz assistida de laser de dessorção / ionização) baseada em técnicas analíticas. São necessárias novas matrizes para pequena molécula MSI, que podem melhorar a análise de baixo peso molecular (MW) compostos. Essas matrizes deve fornecer sinais de analitos aumentou, enquanto a diminuir sinais de fundo MALDI. Além disso, o uso de instrumentos de ultra-alta resolução, tais como a transformada de Fourier de iões ciclotrão ressonância (FTICR) espectrómetros de massa, tem a capacidade de resolver os sinais de analito a partir de sinais de matriz, e este pode superar parcialmente muitos problemas associados com o fundo proveniente da MALDI matriz. A redução nas intensidades dos clusters matriz metaestáveis ​​por FTICR MS também pode ajudar a superar algumas das interferências associadas com picos de matriz de outros instrumentos. De alta resoluçãoinstrumentos, como os espectrômetros de massa FTICR são vantajosas, pois podem produzir padrões de distribuição de muitos compostos simultaneamente enquanto continua a fornecer confiança em identificações químicas. Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecidos. Neste trabalho, um protocolo para a utilização da DT por MALDI imagiologia de lípidos endógenos das superfícies de secções de tecido de mamífero, por positiva de iões de MALDI-MS, de um quadrupolo híbrido ultra-resolução tem sido fornecida instrumento FTICR.

<html> As amostras de tecido que são seccionadas e degelo montados em lâminas de vidro ITO revestidas devem estar intactos, sem rasgo visível. Para muitos tecidos, descongele tecido direto montagem em uma lâmina de vidro ITO revestido é aceitável. Para alguns tecidos específicos, tais como lentes de bovino, extensa rompimento do tecido, muitas vezes é observado quando degelo montagem directa é utilizado (Figura 1a). De pré-revestimento da placa de vidro ITO com etanol ou ácido fórmico <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer at JoVE.com

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecido de pequenas moléculas; protocolos para a utilização de DT para a imagiologia de MALDI de lípidos endógenos na superfície de cortes de tecido por positivo-ion MALDI-MS em um ultra-alta resolução quadrupolo-FTICR instrumento são fornecidos aqui.

Dithranol como Matrix Assisted Laser Matrix para dessorção / ionização de imagem em um Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K visualizações.  University of Victoria.  Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecido de pequenas moléculas; protocolos para a utilização de DT para a imagiologia de MALDI de lípidos endógenos na superfície de cortes de tecido por positivo-ion MALDI-MS em um ultra-alta resolução quadrupolo-FTICR instrumento são fornecidos aqui. 

Vídeo: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantificar mistura usando Ressonância Magnética

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Melhorar a taxa de sucesso de cristalização de proteínas pela Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enriquecimento de Proteínas da Matriz Extracelular a partir de tecidos e digestão em péptidos para Análise de Espectrometria de Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

Calibração e uso de desempenho da MRM Microcoil demonstrados em raízes de truncatula medicago a 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

Preparação amostral para análise rápida lipídica no cérebro de Drosophila usando desorção a laser assistida por matriz/imagem de espectrometria de massa