Carrapatos são ectoparasitas hematófagos, Rhipicephalus microplus, popularmente conhecido como carrapato bovino tem enorme impacto econômico negativo sobre a pecuária em áreas tropicais. Além disso, preocupações crescentes com as condições ambientais degradadas e preocupações com a saúde pública causadas pelo uso inadequado de acaricídios químicos e pelo aumento da resistência das populações de carrapatos aos parasitas tradicionais, estão estimulando pesquisas sobre métodos alternativos de controle, como o uso de fungos entomopatômicos. Esses entomopatógenos infectam ativamente os hospedeiros artrópodes, através de sua cutícula e colonizam seu corpo.
O artrópode pode ter respostas diferentes para a infecção fúngica. O sistema imunológico artrópode é dividido em respostas humorais e celulares. A resposta humorística envolve processo de hemagglutinação e produção de moléculas antimicrobianas, enquanto os hemócitos mediam a resposta imune celular.
A maioria dos estudos sobre resposta imune ao artrópode são relatados usando insetos, enquanto as respostas ao carrapato permanecem menos exploradas. Além disso, a inoculação de patógenos e a coleta de hemoglifos de carrapato são técnicas pouco difundidas necessárias para entender melhor a resposta imune do artrópode. Assim, este vídeo aborda técnicas\usadas para filmar a inoculação, coleta hemolífi e processamento.
Uma vez que os hemócitos do carrapato que a colheita enfrenta algumas limitações, como interrupção de células, baixo valor hemóclático e baixa concentração de células recuperadas. Infectando diretamente na configuração e análise das células. Depois da coleta de carrapatos, lave fêmeas engorgadas.
Use água da torneira e mergulhe-as em solução de hipoclorito de sódio de 0,5% por três minutos em um recipiente de copo de vidro de 500 mililitros. Para a higiene da cutícula, divida as fêmeas em grupos homogêneos com 20 fêmeas cada. Foram realizadas três réplicas de cada grupo.
Metarhizium robertsii blastospores foram usados no processo de inoculação. Adicione um líquido de cinco microliters metarhizium blastospores suspensão à superfície de um filme de parafina de plástico. Para acelerar o processo de inoculação, várias bolhas podem ser adicionadas à superfície do filme de parafina de plástico, cada bolha correspondente a cinco microlitadores.
Use uma seringa de insulina ultrafina de um milímetro e uma agulha de 0,3 milímetros para colocar uma suspensão e inocula-la no carrapato. Lembre-se de tirar todo o ar da seringa antes de usá-la. Inocular 5 microlitres de suspensão de fungos no carrapato feminino entre o scutum e o capitúlo.
Um pequeno volume de hemolífio pode estar presente no enquadramento após a incisão da agulha. Tenha cuidado para não inocular ar. Inocula as fêmeas com suspensão de fungos entre a coxa da perna e o corpo da fêmea usando uma seringa de insulina ultrafina de um mililitro acoplada a uma agulha de 0,3 milímetros.
Quando a inoculação de blastospores de metarhizium é realizada entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato, um pequeno volume de hemoglifo pode estar presente na coxa após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular ar. Use a parte de borracha de uma infusão alada um tubo capilar de 0,3 milímetros e uma ponta de filtro para realizar a coleção hemoglifo.
Interrompa a cutícula dorsal feminina usando uma agulha de 0,3 milímetros. Após a interrupção aplicar pressão suave na parte anterial do corpo do carrapato. Observe uma poça líquida quase transparente fora do local de interrupção.
Colete o hemofímetro sugando o líquido através da ponta do filtro acoplada a uma parte de borracha de um conjunto de infusão alado e um tubo capilar de 0,3 milímetros. Não pressione o corpo do carrapato quase durante sua imobilização porque isso pode perturbar o midgut e contaminar o hemisão. Espere até que a pressão suave possa expulsar o fluido sem contaminação.
Imobilize o carrapato. Corte um pedaço de uma perna dianteira. Uma ou mais pernas podem ser cortadas, bem como a mesma perna pode ser cortada mais de uma vez.
Aplique pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observe uma bolha líquida transparente aparecer no lado do corte e colecioná-la com o tubo capilar. Não pressione o corpo do carrapato mal, durante sua mobilização, porque isso pode perturbar o midgut e contaminar o hemóglifo.
Espere até que a pressão suave possa expulsar o fluido sem contaminação. Após a coleta hemolímph, deposite-o em 1,5 mililitros microtubos previamente preenchidos com 30 coquetéis protease de microlitres e 82 tampão salino de microlitres. Mantenha os microtubos no gelo durante toda a coleção de hemoglifos.
Amostras de centrífugas e a pelota macia de hemócitos serão formadas após a centrifugação hemoclfíquica. Para quantificação hemolímph, quantifique o volume hemofífono obtido contando o volume total dentro do microtubo e descontando o volume de coquetel de protease e tampão salino. Remova cuidadosamente o hemoglifo livre de células sobrenanasces e suspenda suavemente as células.
Quantifique os hemócitos colocando 10 microlitres de hemócitos re-suspensos na câmara de Neubauer. Para células, foi usada uma mídia cultural. Corte a perna dianteira do carrapato, aplique pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato, observe uma bolha líquida transparente aparecer no local do corte.
Aplique as gotas hemolímph diretamente em lâminas de microscópio limpos. Depois disso, use métodos apropriados para manchar as células. A inoculação entre a coxa da perna e o carrapato do corpo feminino também pode danificar órgãos internos do carrapato, como o midgut e os túbulos malpighianos.
Quando o carrapato é interrompido pela agulha na coleta hemolímph dorsal, o fluido obtido é vermelho, não transparente. Isso indica uma coleta hemofífona incorreta. Neste caso, a hemofífita deve ser descartada por estar contaminada.
A contaminação hemolímph também pode ser observada quando o carrapato é naturalmente infectado com altas cargas de patógenos, ou nas etapas finais após o processo de morte causado por patógenos inoculados. O volume hemolífio obtido após a coleta dorsal é maior do que o volume obtido na coleta através da perna. Apesar da facilidade de contaminação ser maior no primeiro método de coleta.
A concentração de hemócitos também foi significativamente maior na coleta dorsal. Quando a coleta correta de hemócitos é realizada uma boa mancha pode ser obtida e é possível distinguir diferentes hemócitos após a coloração. Este vídeo forneceu informações sobre métodos para realizar a inoculação de patógenos, especificamente fungos entomopatômicos, em carrapatos e coletar seu hemisão.
As técnicas aqui apresentadas requerem recursos tecnológicos muito baixos em nossos passos clássicos para estudos sobre fisiologia do carrapato, patologia do carrapato e resposta imune do carrapato. A colheita correta das células artrópodes e o hemolífio livre de células é crucial para pagar informações confiáveis para estudos subsequentes. Por isso, também é importante estar atento aos erros mais comuns observados na execução dessas técnicas.
Além disso, as propostas deste estudo determinarão o local mais adequado para a coleta de hemoglifos através da deformação ou corte das pernas, considerando a diferença no volume obtido e a probabilidade de contaminação.
