Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório Kucenas pelas valiosas discussões e Tecnologias de quorum, Inc. Para obter suporte técnico soberbo. O trabalho foi apoiado pelo Fundo UVA de Excelência em Ciência e Tecnologia (FEST) (SK).

1. Preparação e montagem de embriões Zebrafish para ablação e Imagens ao vivo <ol><li> Prepare um estoque de 0,8% de baixa fusão agarose em água ovo. Alíquotas 13X em tubos de cultura de 100 mm descartáveis ​​e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Zebrafish adulto Cruz contendo estavelmente transgenes integrados para rotular fluorescente os neurônios motores e tipos de interesse de células gliais. Coletar embriões zebrafish em água ovo e coloque em 28,5 ° C incubadora para o estadiamento correto mais tarde 3. </li><li> Aproximadamente 24 horas após a fertilização (HPF), remover a água do ovo e adicionar 0,002% de 1-fenil 2-tioureia (PTU) em água ovo. Retorno embriões para a incubadora. </li><li> Entre 24 e 96 hpf, embriões devem ser pesquisados ​​quanto à presença de transgenes desejados sobre um escopo de dissecação fluorescente. Coloque embriões selecionados em água doce ovo PTU e voltar para a incubadora. </li><li> Quando as larvas atingiram seis dias após a fertilização (dpf) (ou idade desejada), removê-los da incubadora, Selecione algumas larvas para a montagem, e transferi-los para um prato menor. </li><li> Remover a água do prato e substituir imediatamente com cerca de 0,02% em Tricane PTU água ovo. Permitir que as larvas se sentar na anestésico cerca de 5 min. </li><li> Colocar uma alíquota de 0,8% de agarose de baixa fusão num copo com água da torneira e micro-ondas durante 30 segundos, ou até a agarose é derretido. Deixe o copo para esfriar até que a agarose no tubo de cultura se sente morna ao toque (não quente). </li><li> Selecione uma larva anestesiados e transferi-lo para um único ou multi-bem 35 milímetros prato fundo de vidro. Retire toda a água que foi transferido com a larva, em seguida, cubra imediatamente a larva com agarose quente o suficiente para preencher a parte de vidro de fundo do prato, mas não criar uma grande cúpula. </li><li> À medida que a agarose endureça, utilizar uma agulha de dissecação para posicionar a larva do seu lado, na parte inferior do prato e incline a larva apenas ligeiramente na sua parte traseira. É imperativo para lesão e imagem subseqüente, quea larva montado estar a tocar o vidro sobre o fundo do prato. Utilize a agulha de dissecação para manter a larva nesta posição até que a agarose é solidificado e a larva é imobilizada. </li><li> Uma vez que a agarose é completamente endurecido, lentamente pipetar Tricane água suficiente (este pode ser o mesmo usado para anestesia Tricane) para o prato de modo a cobrir totalmente a agarose e larva. </li></ol> 2. Calibração e Ensaios Laser <ol><li> Ligue todos os instrumentos microscópio confocal, lasers de diodo apropriadas para transgenes zebrafish emocionantes, eo nitrogênio-bombeou o laser de corante. Certifique-se o feixe de &quot;branco&quot; divisor está no lugar, o atenuador laser é totalmente aberto, ea 435 nm célula corante cumarina está no lugar. No computador, abra o software de imagem. </li><li> Mover uma objetiva de imersão em água 1.2NA 63x na posição e aplique uma pequena gota de meio de imersão para os objetivos da água para o objetivo. Um objectivo 63x permitirá boa precisão ablação a laser e água immersion permite uma maior distância de trabalho, o que é necessário quando se trabalha com larvas do peixe dpf 6-7. </li><li> Obter uma lâmina de vidro espelhado com um lado a ser usado para a calibração do laser. Coloque o slide, o lado do espelho para baixo, para o palco microscópio. </li><li> Usando a ocular sob iluminação de campo claro, encontrar e se concentrar em um arranhão ou etch no espelho. A luz brightfield estará brilhando para baixo sobre a lâmina de vidro, mas só passará para o objetivo em locais onde o espelho foi arranhado ou gravado de distância, fazendo com que o espelho para olhar negro através da ocular, e as gravuras para olhar como manchas ou linhas de luz. </li><li> Ver e concentrar as gravuras na tela do computador usando o software de imagem. Abrir a janela que controla a calibração e ajustes de potência de laser. Defina o número de pulsos para &quot;1&quot; ea placa de atenuação para &quot;3&quot; transmissão%. O número de impulsos representa o número de vezes que o laser será disparado dentro de cada região de interesse (ROI) e a transmissão% representa a potência do laser. Certifique-se a configuração de calibragem correta está selecionada para a objectiva de imersão em água 1.2NA 63x. </li><li> Selecione a ferramenta elipse a partir da barra de ferramentas principal e clique na imagem na tela do computador para criar um único ROI circular. Faça isso mais três vezes, até que há quatro ROIs circular espaçados aleatoriamente sobre a imagem. </li><li> Alguns sistemas podem incluir uma característica de segurança que não permitirá que o laser para disparar, se o percurso da luz para as oculares é aberta. Se este for o caso, a fechar manualmente o percurso da luz para as oculares neste momento. </li><li> Disparar o laser. Isto irá criar quatro pequenas gravuras no local, uma em cada ROI circular. Se o laser não dispara, verifique se o laser é ligado e conectado corretamente, e que o caminho da luz para as oculares é fechado. Se os fogos de laser, mas sem ataque é visto, verifique se o &quot;branco&quot; divisor de feixe está no lugar. Se tudo estiver no lugar, aumentar a potência do laser e &quot;FRAP&quot; até o gravuras are visível. Se uma fonte de laser de fixação superior 10 é necessário para gravar o vidro, isto pode indicar que o cartucho de laser plasma tem de ser substituído. </li><li> Se as manchas aparecem gravadas centrado dentro do ROI selecionado, nenhuma calibração é necessário (vá para 2.12). Se os pontos não estão centradas, o ajuste de calibração precisa ser atualizado. </li><li> Para calibrar, clique na atualização da configuração de calibragem. O laser vai disparar e será apresentada uma imagem que contém um único ponto gravado. Se o ponto não aparecer, cancelar a calibração, aumentar a potência do laser, e iniciar a calibração novamente. </li><li> Clique no centro do local. O laser vai disparar de novo, e outro ponto aparecerá. Clique nesse ponto, e repita o processo até que a calibração está completa e 9 pontos aparecem em forma de grade. Repita os passos de 2,6-2,9 para verificar se a calibração foi bem sucedida. </li><li> Retire a lâmina de vidro a partir do estágio do microscópio e limpar a objetiva. Abra o caminho da luz para a oculars, e substituir o &quot;branco&quot; divisor de feixe com o &quot;100% ILL&quot; divisor de feixe. </li></ol> 3. Secção do nervo Usando ablação a laser e Time-lapse imagem confocal de Comportamentos de células gliais <ol><li> Remover a fase usado para manter a lâmina de vidro e substitua por uma fase adequada para a realização de 35 milímetros pratos de vidro com fundo. Continuar a utilizar o objetivo de imersão em água 1.2NA 63x. </li><li> Aplique uma pequena gota de meio de imersão em água com o objectivo, e coloque o prato com larva montado no palco. Estabilizar o prato com clips. </li><li> Usando a ocular e iluminação de campo amplo, o foco da larva e localizar os nervos motores. Digitalizar os nervos hemisegments 10-20 e selecionar um nervo motor para transecção. </li><li> Traga um live-view do nervo na tela do computador usando o software de imagem. Selecione Z-aviões e adquirir uma imagem dos axônios e células gliais do nervo ileso. </li><li> Prepare as configurações de imagem time-lapse no software de imagem para capturarZ-projecções de todos os tipos de células em intervalos de 5-30 min, dependendo da experiência. O melhor é criar todas as configurações necessárias para o lapso de tempo antes de realizar a ablação, para que não haja atraso no início do lapso de tempo uma vez que a lesão é completa. </li><li> Retire o &quot;100% ILL&quot; divisor de feixe e substituir com o &quot;branco&quot;. Feche o caminho da luz para as oculares. </li><li> Voltar para o live-view do nervo. Use o canal fluorescente apropriado para ver os axônios que será seccionado. </li><li> Usando a ferramenta elipse, crie um ROI elíptica fino na área a ser cauterizado, em seguida, criar ROIs menor dentro da região selecionada. </li><li> Na janela que controla as configurações de laser, defina o número de pulsos para &quot;2&quot; ea placa de atenuação para &quot;18&quot; transmissão%. Disparar o laser dentro do ROI selecionada. Se restos de fluorescência dentro do ROI, aumentar a potência do laser, espere cerca de 10 segundos e disparar o laser novamente. Faça isso até chegar a uma configuração que faz com que fluoresce a desaparecer dentro do ROI. </li><li> Aguarde 10 segundos ou mais e verifique a área ablacionada novamente por fluorescência. Tenha em atenção que um ROI pode parecer inicialmente ablated, quando na verdade é Foto-descoloração. Se os retornos de fluorescência, aumentar a potência do laser e disparar o laser novamente. Repita este procedimento até florescimento desaparece dentro do ROI e não retornar dentro de 10 seg. É melhor começar com uma fonte de laser de menor e aumentar a energia necessária. A potência do laser necessária pode variar de acordo com cada sistema de microscopia, com idade de corante cumarina, montagem de amostras, a idade das larvas, e da espessura do tecido. Uma vez que a potência do laser ideal ter sido estabelecida, esta definição de potência pode ser utilizado novamente em nervos subsequentes no mesmo experimento. </li><li> Uma vez que a ablação é concluída, começam imagem time-lapse. </li><li> Quando o time-lapse é completo, use o software de imagens para compilar dados e criar cor composta Z-projeções para cada ponto de tempo. Crie um filme QuickTime para analisar o comportamentode axônios e células gliais simultaneamente. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os passos mais críticos da presente delineamento experimental são os seguintes: 1) para a montagem propriamente larvas lesão e subsequente in vivo de imagens e 2) calibrar o laser e escolhendo os ajustes de potência correctos, a fim de criar um corte transversal do nervo limpa que resulta em danos mínimos dos tecidos extra- . Para ajudar a garantir uma axotomia sucesso para in vivo de imagens e posterior análise, montar larvas múltiplas tanto em pratos com fundo de vidro individuais ou em um pra...

Zebrafish têm sido extensivamente usados ​​para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso devido a sua transparência óptica e facilidade de transgénese, que, quando acoplados, para permitir imagiologia espectacular dos comportamentos dinâmicos das células num embrião vivo. Além disso, por causa do peixe-zebra e mamíferos partes quase todos os genes necessários para a formação do sistema nervoso, a informação celular e molecular recolhidos neste modelo organismo é directamente relacionáveis ​​com outras espécies de vertebrados. Embora extremamente poderosa para o estudo do desenvolvimento neural, o peixe-zebra e os seus atributos únicos têm o potencial de também explicar os mecanismos que mantêm e reconstruir o sistema nervoso após a lesão. Larvas de peixe-zebra manter a sua translucidez em estágios larvais tardias e pigmentação pode ser bloqueado, quer com a utilização de inibidores farmacológicos de produção de melanina ou de mutantes genéticos que carecem de células de pigmento. Assim, usando este organismo modelo para estudar lesões e se regeneraion em animais mais velhos é possível e oferece a oportunidade única de investigar diretamente os mecanismos celulares e moleculares que reconstruir o sistema nervoso. Neste artigo, descrevemos como a ferir de forma eficiente e reproduzível nervos nos PNS de larvas de peixe-zebra. Este paradigma lesão presta-se a estudar não só a degeneração, mas também as respostas das células gliais e células do sistema imunológico periférico, bem como as interacções entre estas populações durante a regeneração. O SNP é uma rede complexa de nervos motores e sensoriais que é necessário para passar informação entre o sistema nervoso central (CNS) e na pele, músculo e órgãos do corpo, permitindo que um organismo de interagir com o seu ambiente e sobreviver. Ao longo destes nervos, células gliais periférico, incluindo células mielinizantes e não mielinizantes de Schwann e glia perineural, bem como o tecido conjuntivo, encerram os axónios e finalmente formam o nervo madura. Lesão destes nervos inicia um processo de known como degeneração Walleriana 10. Este mecanismo de fragmentação axonal, recrutamento imunológico, liberação de detritos e regeneração é muito estereotipada e geneticamente regulado 1. Estudos anteriores em sistemas de mamíferos têm descrito as funções das células de Schwann, durante a degeneração do nervo e regeneração 1, 2, 6, 8. Nestes estudos de tecido fixo ou de cultura de células, as células de Schwann, não só recrutados macrófagos para o local da lesão para ajudar na depuração de detritos, mas também ajudou na mielina fagocitose si. Embora esses estudos tenham sido incrivelmente informativo, nunca temos antes de respostas gliais visualizadas a lesão axonal periférica in vivo em tempo real, e não outros estudos investigaram a relação entre as diferentes classes de glia periférica durante esses eventos. Recentemente, vários laboratórios têm investigado a degeneração Walleriana utilizando zebrafish e lesão axonal mediada por laser de semelhante ao que descrevemos aqui <sup&gt; 4, 5, 7, 9. Em alguns desses estudos, os axônios sensoriais superficiais foram axotomizado em larvas jovens usando um costume construído, dois fótons microscópio confocal 4, 5, 9. Em outro estudo, que é muito semelhante à nossa, axônios mais profundas dentro do nervo motor ventral foram seccionados em cinco dias de idade larvas usando um sistema de ablação a laser disponível no mercado 7. Em ambos os experimentais set-ups, o foco foi a degeneração Walleriana e os axônios e células imunológicas foram fotografados. Para ampliar esses estudos, descrevemos ferindo axônios motores em larvas mais velhas, com mais maduras, nervos mielinizados e ensaio a resposta de todos glia nervo periférico associado durante a degeneração e regeneração. Para fazer isso, nós transecto nervos motores de 6 e 7 dias após a fertilização (dpf) larvas e visualizar as respostas das populações da glia individuais, bem como investigar as interações entre essas populações ao longo dos axônios lesionados. Usando tra duplos e triploslinhas nsgenic que a glia periférica etiqueta, incluindo as células de Schwann e glia perineural, bem como um marcador de axónios, que utilizam um sistema de ablação a laser disponíveis no comércio consistindo de um átomo de azoto-de corante bombeado a laser (comprimento de onda de 435 nm) ligado a um sistema de disco giratório confocal para criar axônio transecções. Este experimental set-up permite visualizar ao vivo, peixe-zebra larval, ferir imagem time-lapse as respostas das populações da glia distintos tratos dos axônios motores periféricos específicos e à lesão axonal e sua relação com o outro. Este protocolo pode ainda ser adaptado para criar lesões nervosas em zebrafish de diferentes idades, com diferentes linhagens transgênicas ou mutantes genéticos para abordar diferentes questões científicas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

O sistema nervoso é frequentemente descrito como um componente de hard-wired do corpo, mesmo que seja um sistema de órgãos consideravelmente fluido que reage a estímulos externos em uma maneira consistente estereotipado, mantendo ao mesmo tempo a flexibilidade e plasticidade incrível. Ao contrário do sistema nervoso central (SNC), o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa, mas apenas começaram a compreender os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando zebrafish como um sistema modelo, temos a oportunidade sem precedentes para estudos regenerativos casal com in vivo de imagens e manipulação genética. Os nervos periféricos são compostos de axónios rodeado por camadas de células gliais e de tecido conjuntivo. Axônios são ensheathed por myelinating ou não células mielinizantes de Schwann, as quais são, por sua vez envolvida num fascículo por uma bainha celular chamado o perineuro. Após uma lesão, nervos periféricos adultos têm a notável capacidade de remove danificado detritos axonal e alvos de re-inervam. Para investigar os papéis de todos os glia periférica na regeneração PNS, descrevemos aqui um ensaio transection axônio que usa um laser de corante disponível comercialmente nitrogênio bombeado para axotomize nervos motores em zebrafish transgênicos ao vivo. Descrevemos ainda mais os métodos para casal estas experiências à imagem time-lapse de nervos lesados ​​e controle. Este paradigma experimental pode ser utilizado não só para avaliar o papel que desempenham na glia regeneração do nervo, mas pode também ser a plataforma para elucidar os mecanismos moleculares que governam a reparação do sistema nervoso.

O ensaio aqui descrito pode ser usado para avaliar a resposta das células da glia e outras populações de células nervosas associadas a lesão axonal in vivo. Filme 1 mostra um exemplo de uma lesão do nervo criada usando este método e a resposta de células vizinhas gliais. Este experimento foi realizado em Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed) zebrafish, no qual glia perineural expressar uma membrana alvo EGFP e neurônios motores expressa cytosolic DsRed. A lesão foi feito ao ...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K visualizações.  University of Virginia. Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Vídeo: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Neurociência

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...