Agradecemos Deborah Studer pela ajuda com o bioprinter. O trabalho foi financiado pelo Programa da União Europeia Sétimo Programa-Quadro (FP7/2007-2013), sob acordo de subvenção n ° NMP4-SL-2009-229292.

1. Preparação da solução de Poloxamer 407 Se estiver disponível, realizar a preparação da solução poloxamero em uma câmara fria (4 ° C). Se não estiver disponível, o lugar de uma garrafa de vidro de um recipiente cheio de água gelada. A temperaturas mais elevadas, o poloxâmero estará acima do ponto de gel e não se dissolvem bem. <ol><li> Adicionar 60 ml de solução de PBS frio de gelo numa garrafa de vidro e agita-se vigorosamente com um agitador magnético. </li><li> Pesar 24,5 g de poloxâmero e adiciona-o em pequenas quantidades ao PBS frio. Aguarde até que o poloxamero foi parcialmente dissolvido antes de adicionar mais. </li><li> Agita-se a solução até tudo estar dissolvido poloxâmero. </li><li> Adicionar PBS frio até um volume final de 100 ml é atingida. A concentração final será de 24,5% w / v </li><li> Parar a agitação da solução e deixar em repouso a 4 ° C até que as bolhas e espuma na solução desapareceram. As bolhas que estão presos dentro do gel vai ser transferido para o pcartucho rinter e vai levar a defeitos nos moldes sacrificiais impressos. </li><li> Filtro (filtro de 0,22 mM), a solução directamente para dentro do cartucho de impressão para remover quaisquer partículas indesejáveis, que poderiam obstruir a agulha. O passo de filtração deve ser realizada numa sala fria (ou se não estiver disponível, arrefecidos com pontas de filtro, etc), para evitar a gelificação do poloxâmero no filtro. Manter o cartucho carregado a 4 ° C, até 30 minutos antes da experiência. </li></ol> 2. Preparação da impressora 3D A impressora 3D utilizado neste trabalho foi o &quot;biofábrica&quot; ​​de regenHU. A parte do sistema de extrusão é composto por várias peças. Um cartucho sob pressão na parte superior está ligada a um conector por meio de um adaptador luer. O conector preenche os espaços entre a saída do cartucho e a entrada de uma válvula de solenóide. À saída da válvula de solenóide, as agulhas de diferentes diâmetros podem ser usadas. O material é extrudido sobre um subdemonstrar que é realizada a um estágio em movimento por vácuo. As partes principais do sistema estão apresentados na Figura 1. Outros sistemas baseados em extrusão pode ser utilizada para o processo de impressão, e o processo de optimização precisa de ser feito para cada sistema. <ol><li> Coloque a válvula de solenóide (diâmetro do bocal de 0,3 mm), e a agulha (diâmetro interno de 0,15 milímetros), em tubos de ensaio separados cheios com 1,5 ml de água ultrapura e colocá-los num banho de ultra-sons para limpar aquecida durante 30 min. Lavar as válvulas limpas com álcool e seque-os com uma arma de nitrogênio. </li><li> Instalar a válvula de agulha e na impressora, bem como um cartucho vazio e limpo. </li><li> Aplicar 3 bar de pressão para o sistema e apagar quaisquer líquidos residuais da válvula instalada e agulha com ar comprimido. Para pequenos diâmetros de agulhas, é recomendado para ter um filtro (filtro de seringa comum, de tamanho de poro de 0,45 um) instalado na saída do ar comprimido a fim de evitar a entrada de pequenas partículas que podem entupir a agulha. </li&gt; <li> Vire a pressão e instale o cartucho carregado com o poloxamero. O cartucho deve ser retirado do frigorífico, aproximadamente, 30 min antes da montagem do cartucho de modo que o poloxâmero pode atingir a temperatura ambiente e gel. </li><li> Aplicar 3 bar de pressão no sistema e dispensar poloxâmero até que ele atinja a ponta da agulha e é extrudido numa cadeia contínua. </li></ol> 3. Otimização dos parâmetros de impressão Para criar estruturas 3D precisas, o processo de impressão tem que ser optimizado para o material escolhido e concentração. Dependendo da viscosidade e o sistema de impressão 3D cada material irá produzir um volume de dosagem específico e a espessura da linha de um conjunto fixo de parâmetros. <ol><li> Com um software CAD adequado (capaz de criar arquivos ISO a partir dos desenhos), desenhe uma única linha sobre o mesmo comprimento que a estrutura que você pretende imprimir. </li><li> Coloque uma lâmina de vidro de microscópio 25 milímetros x 75 mm x 1mm ou qualquer outro substrato na impressora e prendê-lo ligando o vácuo. </li><li> No software da impressora, defina a válvula solenóide de alta freqüência de 50 Hz e defina uma alta pressão de 3 bar. </li><li> Imprimir uma camada de uma única linha, com uma velocidade de fase de 300 mm / min. </li><li> Reduzir a pressão até que a largura da linha desejada seja atingida. Também é possível controlar o volume que é extrudido através do tempo de abertura da válvula. </li><li> Reduzir a frequência da válvula, até que nenhuma linha contínua mais pode ser impressa. Escolha uma freqüência acima deste valor. </li></ol> Observação: Uma vez que a largura da linha desejada e linhas contínuas são alcançados, determinar a velocidade de fase óptimo e isto é, a espessura da camada de elevação da agulha depois de uma camada impressa. <ol start="7"><li> Imprimir várias camadas em cima uns dos outros e ver se a agulha está na posição correcta sobre a camada anterior, depois de várias camadas impressas. Ajustar a espessura da camada (elevador agulha) De modo que cada camada é impressa em cima do próximo (Figura 3). </li><li> Diminua a velocidade de fase da etapa, de 300 mm / min passo a passo para que as camadas extrudados começam e terminam nas mesmas posições que os anteriores (Figura 4). Velocidades demasiado elevadas do estágio causar a fase de mover-se antes de o material extrudido tiver tocado na camada anterior. </li><li> Para imprimir as estruturas de pilar, siga os passos 3.1.-3.8., Mas em vez de desenhar uma única linha desenhar um único ponto. Os parâmetros para se concentrar ao imprimir os pilares são a pressão (regula a espessura da camada e do diâmetro pilar de poloxâmero), o tempo de abertura da válvula (volume micronizada) e o tempo de residência na cabeça de impressão na posição onde o pilar deve ser depositado . </li><li> Quando os parâmetros são optimizadas, a impressão de várias camadas de uma linha deverá resultar numa parede sólida ou, no caso de os pontos, um pilar. Salvar os parâmetros para uso posterior. </li></ol> Use os parâmetros encontrados durante o processo de otimização a partir deste ponto. <ol><li> Imprima a estrutura interna (aqui é uma matriz coluna) em uma lâmina de vidro e deixe secar durante a noite. Esta a) reduz o tamanho e espessura das estruturas e b), proporciona uma melhor adesão entre a estrutura e o substrato, de modo a descolagem durante o enchimento pode ser evitado. </li><li> Com o software CAD, desenhar uma estrutura que consiste em uma parede exterior em torno da estrutura que você pretende ter eluição de distância e preenchido. Imprimir a estrutura com poloxamero. A impressão da parede terá 6 min. </li></ol> Atenção: A parede tem de ser impresso, pelo menos, 3,5 milímetros de distância a partir da estrutura interna por causa das dimensões da agulha. Caso contrário, a impressão da parede exterior vai destruir a estrutura interna <ol start="3"><li> Prepare a solução que você deseja para aterrar seu sacrmolde ificial com (aqui de agarose 1% em água deionizada). A solução de agarose deve ter uma temperatura entre 35 ° C e 45 ° C. Abaixo dessa temperatura, irá a agarose solidificar muito rapidamente; acima desta temperatura, o que poderia destruir os pilares impressos porque a estrutura poloxâmero vai amolecer. </li><li> Lentamente encher o molde de sacrifício com a solução de enchimento, utilizando uma pipeta. Isto deve ser feito lentamente para evitar a destruição da estrutura dentro da parede. </li><li> Deixe a solução de gel utilizados no enchimento ou reticular que, dependendo do polímero usado. No caso de agarose a solidificação terá lugar a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Coloque o molde sacrificial backfilled num banho de gelo durante 10 minutos para eluir a estrutura poloxâmero. </li><li> Blot a estrutura backfilled com um lenço de papel e colocá-lo em uma nova lâmina de vidro. Pressionar a estrutura cuidadosamente no lâmina de microscópio de vidro para evitar a fuga da terceira hidrogel do vácuo no espaço entrea estrutura e utilizados no enchimento da lâmina de vidro. </li></ol> 5. Enchimento dos vazios <ol><li> Para preencher os espaços vazios deixados pela poloxâmero eluido, preencher a solução de polímero que se destina a uma seringa equipada com uma agulha 30 G. Neste exemplo, utilizou-se um alginato de metacrilato de 1% em solução de NaCl 0,15 M com a adição de 0,05% w / v de lítio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (PLA) e de 2,5% v / v de Alexa-488 fibrinogénio conjugado . A Alexa-488 fibrinogénio conjugado foi adicionada para efeitos de visualização. </li><li> Fotopolimerizá o polímero com uma lâmpada de UV de alta intensidade (100 watt, 365 nm, distância do substrato foi de 3,5 cm), durante 5 min e a construção da imagem usando um microscópio de epi-fluorescência ou confocal. </li></ol>

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Sci. 290, 1575-1582 (2012).</li><li>Pescosolido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid+and+Dextran-Based+Semi-IPN+Hydrogels+as+Biomaterials+for+Bioprinting.">Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting.</a> Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+of+collagen/chondroitin+sulfate/hyaluronan+interpenetrating+polymer+network+for+cartilage+tissue+engineering.">Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Apresentamos aqui, pela primeira vez, o uso de um polímero para um molde thermoresponsive sacrificial que podem ser rapidamente eluída em água fria, devido à transição gel-sol de poloxâmero de ~ 20 ° C. A velocidade de todo o processo torna poloxâmero interessante para a criação rápida de estruturas de biopolímeros, que não podem ser impressas com uma resolução adequada. A técnica aqui descrita pode ser usado para modelar um hidrogel dentro de um outro ou de hidrogel para a criação de canais microflui...

Abordagens de engenharia de tecidos têm feito grandes progressos nos últimos anos no que diz respeito à regeneração de tecidos e órgãos humanos 19,20. No entanto, até agora, o foco de engenharia de tecidos tem sido geralmente limitada a tecidos que têm uma estrutura simples ou de pequenas dimensões, como a bexiga ou a pele 21,22 23-25. O corpo humano, no entanto, contém muitos tecidos tridimensionais complexas onde células e matriz extracelular são arranjados de um modo espacialmente definido. Para a fabricação desses tecidos, é necessária uma técnica que possa colocar andaimes células e matriz extracelular num construto tridimensional em posições especificadas. Bioprinting tem o potencial de ser uma técnica em que a visão de fabricação de tecidos tridimensionais complexos podem ser realizados 10,11,26-28. Bioprinting é definida como &quot;o uso de processos de transferência de materiais para padronização e montagem biologicamente relmateriais levantes - moléculas, células, tecidos e biomateriais biodegradáveis ​​-., com uma organização prescrita para realizar uma ou mais funções biológicas &quot;4 Ela engloba várias técnicas diferentes que funcionam em diferentes resoluções e escalas de comprimento, que vão desde a resolução sub-micron de dois -fotão de polimerização 29 com uma resolução de 150 um a 420 mm para a impressão de extrusão 1,12,30. Nem um único material ou combinação de materiais que satisfazem os requisitos de cada método 31. Para a impressão de extrusão, os parâmetros principais são a viscosidade e o tempo de gelificação 32, onde a elevada viscosidade e gelificação rápida são desejáveis. Impressão 3D é uma técnica que permite a fácil criação de moldes sacrificiais para a criação de geometrias complexas 30,33,34. Este processo baseia-se na construção de um molde usando uma técnica de prototipagem rápida, tal como um bioprinter extrusão. O molde sacrificial criado é usadode modo a formar estruturas complexas, a partir de materiais que são difíceis de imprimir devido à sua baixa viscosidade e o tempo de gelificação lenta. O método aqui apresentado envolve a criação de um molde sacrificial consistindo de um material que se dissolve rapidamente a uma temperatura baixa e pode ser extrudida com precisão. O copolímero em bloco de poli (etileno-glicol) 99-poli (propileno glicol) 67-poli (etileno-glicol) 99 (também conhecido como o Pluronic F127 ou poloxâmero 407) cumpre estes requisitos. Já foi utilizada uma versão modificada na impressão de extrusão 1, mas, para o nosso conhecimento, nunca foi usado para imprimir na sua versão inalterada, devido à sua instabilidade em ambientes líquidos. Poloxero 407 também apresenta um comportamento não responsivo térmica inversa 18 ou seja ela muda de um gel para um sol durante o arrefecimento. Mais importante, ele pode ser impresso nas estruturas curvadas arbitrariamente complexas com elevada fidelidade. Isso permite a criação de uma estrutura a partir de um hidrogelmaterial de baixa viscosidade, neste caso, de gelificação lenta de agarose, pipetando-se a solução para dentro do molde sacrificial impressa. A combinação de impressão do molde de sacrifício com alta fidelidade e sua eluição rápida do hidrogel estruturado fundido torna um método rápido e flexível para criar moldes com geometrias diferentes, sem o uso de uma máscara ou um selo, uma vez que é muitas vezes necessário em métodos de litografia. O hidrogel estruturado fundido pode ser ainda cheio com outro material que não é adequado para a impressão de extrusão, devido a sua baixa viscosidade. Isto é, no nosso caso uma solução de alginato de metacrilato de baixa viscosidade. Aqui apresenta-se o método de moldes sacrificiais invertidas thermoresponsive para padronização de hidrogel, utilizando o exemplo de uma matriz de coluna.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poloxamer (Pluronic F127)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2443</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=10010015" target="_blank">10010-015</a></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAD software</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>BioCAD</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alginate methacrylate</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F13191</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>50004</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioprinter</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>Biofactory</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Valve</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>300 &mu;m Nozzel Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>150 &mu;m Inner Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeiss Axioobserver with ApoTome</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Light Source</td>
 <td>UVP</td>
 <td>Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp</td>
 <td>100 W</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

printing thermoresponsive reverse molds for the creation of patterned two-component hydrogels for 3d cell culture

Bioprinting é uma tecnologia emergente que tem suas origens na indústria de prototipagem rápida. Os diferentes processos de impressão pode ser dividido em contacto bioprinting 1-4 (extrusão, mergulho caneta e de litografia suave), sem contacto bioprinting 5-7 (transferência para a frente de laser, de jacto de tinta de deposição) e técnicas baseadas em laser de dois fotões, tais como fotopolimerização 8. Ele pode ser usado para muitas aplicações de engenharia de tecidos, tais como 9-13, 14-16 e microfabricação biossensor, como uma ferramenta para responder a perguntas biológicos básicos, tais como as influências da co-cultura de diferentes tipos de células 17. Ao contrário dos métodos de fotolitografia ou litografia suave comuns, bioprinting extrusão tem a vantagem de que ele não requer uma máscara ou um selo separado. Utilizando software de CAD, o desenho da estrutura pode ser rapidamente alterada e ajustada de acordo com os requisitos do operador. Isto faz bioprinting mais flexível do que com base em litografiaabordagens. Aqui demonstramos que a impressão de um molde de sacrifício para criar uma estrutura em 3D de multi-material com uma matriz de pilares no interior de um hidrogel, como um exemplo. Esses pilares podem representar estruturas ocas de uma rede vascular ou os tubos dentro de um guia de canal do nervo. O material escolhido para o molde sacrificial foi poloxamer 407, um polímero thermoresponsive com excelentes propriedades de impressão, que é líquido a 4 ° C e um sólido acima da sua temperatura de gelificação ~ 20 ° C para soluções de 24,5% p / v de 18. Esta propriedade permite que o molde de sacrifício à base de poloxâmero ser eluída sob demanda e tem vantagens sobre a dissolução lenta de um material sólido, principalmente para geometrias estreitas. Poloxero foi impressa em lâminas de vidro de microscópio para criar o molde sacrificial. A agarose foi pipetada para dentro do molde e arrefecida até a gelificação. Após eluição do poloxâmero em água gelada, os espaços vazios no molde de agarose foram preenchidos com alginato metacrilato spiked fibrinogénio marcado com FITC. Os vazios cheios foram então reticuladas com UV e a construção foi fotografada com um microscópio epi-fluorescência.

Os resultados representativos mostram que a técnica de molde reversa (ilustrado na Figura 2), vai criar um gel estruturado que pode ser preenchido com um segundo material. No início de cada processo de impressão os parâmetros de impressão são optimizados em primeiro lugar. Ajustamentos faseada dos parâmetros irão resultar em camadas múltiplas impressas construções representadas na Figura 3 e na Figura 4, quando as linhas individuais são impressos. Se a espes...

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Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K visualizações.  Cartilage Engineering & Regeneration. Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Imunologia e Infecção

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the aquaculture industry that has resulted in the mass morbidity and mortality of tilapia in many parts of the world. An effective, rapid, and accurate diagnostic assay for TiLV infection is therefore necessary to detect the initial infection and to prevent the spread of the disease in aquaculture farming. In this study, a highly sensitive and practical reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method is presented to detect tilapia lake virus in fish tissue. A comparison of the RT-qPCR and RT-LAMP assays of infected samples revealed positive results in 63 (100%) and 51 (80.95%) samples, respectively. Moreover, an analysis of uninfected samples showed that all 63 uninfected tissues yielded negative results for both the RT-qPCR and RT-LAMP assays. The cross-reactivity with five pathogens in tilapia was evaluated using RT-LAMP, and all the tests showed negative results. Both the liver and mucus samples obtained from infected fish showed comparable results using the RT-LAMP method, suggesting that mucus can be used in RT-LAMP as a nonlethal assay to avoid killing fish. In conclusion, the results demonstrated that the presented RT-LAMP assay provides an effective method for TiLV detection in tilapia tissue within 1 h. The method is therefore recommended as a screening tool on farms for the rapid diagnosis of TiLV.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

We present an RT-LAMP assay for the detection of TiLV in tilapia fish using simple instruments over a relatively short period of time compared to conventional RT-PCR techniques. This protocol may help control the epidemic spread of TiLVD, especially in developing countries.

Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para a detecção específica e rápida do vírus do lago tilápia

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...