Os autores gostariam de agradecer os membros antigos e atuais do laboratório de Kim, Mark Nilan para o cuidado e manutenção do peixe-zebra, o Dr. Robert Wheeler para discussões úteis e compartilhamento de dados, e NIH concede 3RO1GM087308-02S1 e 1P20RR024475-01A2 eo Agrícolas e Florestais Maine Experiment Station (Publicação Número 3303) para financiamento.

1. Cuidados e Manutenção Zebrafish <ol><li> Pecuária: desova Mass adulto zebrafish como descrito anteriormente 13. Recolhe embriões gerados como anteriormente descrito 14. </li><li> Microinjecção (se for o caso): Microinject 1-4 estágio de células de embriões de peixes-zebra com oligonucleótidos morfolino para knockdown produtos do gene ou ARNm para sobre-expressar os produtos dos genes, como previamente descrito 15. <ol><li> Manter uma piscina adequada de falsa controles injetados (pelo menos 48 localização, simulada injetado peixes de controle e 48 de vida, o peixe experimentalmente manipulados são necessários para preencher uma microplaca de 96 poços). </li></ol></li><li> Manter os embriões: crescer embriões em placas de petri de profundidade a 28 ° C em água de ovo (60 mg / ml instantâneo Oceano sal do mar em água destilada autoclavada de água) até o estágio de desenvolvimento desejado (a resposta explosão respiratória não é detectável usando esse protocolo em embriões de peixe-zebra com menos de 2 dias após a fertilização 12). Nota: Foi observed que a prevenção da pigmentação em embriões de peixe-zebra, quer através da utilização de 1-fenil-2-tioureia (PTU) ou peixe-zebra mutante golden/slc24a5 não altera significativamente a indução de fluorescência por PMA (dados não publicados, embriões testados aos 48, 72, e 96 hpf). <ol><li> Retirar embriões mortos diariamente com uma pipeta de transferência de plástico. </li><li> Decantar cuidadosamente água ovo velho e reabastecer com água nova ovo por dia. </li></ol></li><li> Embriões Dechorionate: No dia da experiência, os embriões dechorionate (se embriões ainda estão nas suas córions) como descrito anteriormente usando duas pinças finas 14 (este ensaio explosão respiratória também podem ser realizadas sobre os rins dissecados de peixes-zebra adultos de 12 e protocolos detalhados para rim dissecção a partir do peixe-zebra adultos foram previamente descritos 16,17). </li></ol> 2. Preparação de Solução <ol><li> Prepare uma solução estoque de H2DCFDA: Pesar 1 mg de H2DCFDA. <ol><li> Dissolve 1 mg de H2DCFDA em 1 ml de dimetil-sulfóxido (DMSO) para fazer uma solução estoque de 1 mg / ml. </li><li> Faça 22 mL alíquotas desta solução estoque em 1,7 ml microtubos. </li><li> Enrole as alíquotas de solução estoque H2DCFDA em papel alumínio e manter no escuro, sempre que possível, porque H2DCFDA é sensível à luz. </li><li> Alíquotas loja H2DCFDA a -20 ° C por até 3 meses. </li></ol></li><li> ATENÇÃO - Prepare uma solução estoque de acetato de forbol miristato (PMA): Pesar 1 mg de PMA utilizando equipamento adequado de protecção individual (ou seja, luvas, óculos e máscara). <ol><li> Dissolve-se PMA em 1 ml de DMSO para produzir uma solução stock de 1 mg / ml. </li><li> Faça 11 mL alíquotas de 1,7 ml microtubos. </li><li> Armazenar aliquotas de uma solução de estoque de PMA a -80 ° C durante até 3 meses. </li></ol></li><li> Preparar uma solução de trabalho de H2DCFDA: No dia da experiência, fazer uma solução de trabalho de H2DCFDA pela adição de 1 parte de solução de estoque de um H2DCFDADMSO parte (500 mg / ml H2DCFDA concentração final). Por exemplo, adicionar 20 ml de solução estoque H2DCFDA e 20 mL de DMSO a uma folha envolto 1,7 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de PMA: No dia da experiência, fazer uma solução de trabalho de PMA por adição de 1 parte de solução de estoque de PMA a 49 partes por nucleases água livre (20 ug / ml de concentração final de PMA). Por exemplo, diluir 10 mL de solução stock PMA em 490 mL de água livre de nuclease em um tubo de 1,7 ml de microcentrífuga. </li><li> Prepara-se uma solução de dosagem de H2DCFDA: No dia da experiência, fazer uma solução de dosagem H2DCFDA com uma concentração final de 1 ug / ml em água H2DCFDA ovo. Os volumes das soluções preparadas de dosagem pode ser modificado como desejado, mas asseguram que as concentrações finais dos reagentes são mantidos. Para rins, em vez de água do ovo, usar o mesmo volume de medium/F-12 modificado por Dulbecco Eagle (50% de DMEM, 50% de F-12, sem vermelho de fenol). Para tornar a 5 ml de H2DCFDAsolução de dosagem, use uma pipeta de 5 ml sorológico para transferir 5 ml de água ovo (ou DMEM/F-12) em um tubo de centrífuga de 15 ml cônico embrulhadas em papel alumínio e rotulados &#39;H&#39;. <ol><li> Retirar 10 ml de água do ovo (ou DMEM/F-12) a partir das 15 ml tubo cônico rotulados &#39;H&#39; e descartar. </li><li> Adicionar 10 ml de solução de trabalho H2DCFDA no tubo de 15 ml rotulados &#39;H&#39; e vortex para misturar (este volume é suficiente para 48 embrião ou amostras de rim (metade de um total de 96 poços de microplaca) e esses poços irá fornecer medições do nível de fluorescência de fundo). </li></ol></li><li> Prepara-se uma solução de dosagem de H2DCFDA + PMA: No dia da experiência, fazer uma solução de H2DCFDA + PMA dosagem com concentrações finais de: H2DCFDA - 1 ug / ml e PMA - 400 ng / ml. Para tornar a 5 ml de solução de dosagem H2DCFDA + PMA, utilizar uma pipeta de 5 ml serológico para transferir 5 ml de água de ovo (ou DMEM/F-12) para um novo tubo de 15 ml rotulados &#39;H + P&#39;. <ol><li> Remover 110 _6; l de água do ovo (ou DMEM/F-12) a partir das 15 ml tubo cônico rotulados &#39;H + P&#39; e descartar. </li><li> Adicionar 10 ul de solução de trabalho de H2DCFDA, depois adicionar 100 mL de solução de trabalho de PMA no tubo de 15 ml rotulados &#39;H + P&#39; e vortex para misturar (este volume é suficiente para 48 amostras ou a outra metade de um total de 96 poços de microplacas ). </li></ol></li><li> Manter as soluções de dosagem no gelo. </li></ol> 3. Programação Leitora <ol><li> Preparar instrumento: Ligue o leitor de microplacas. <ol><li> Aqueça-se a fonte de luz. </li><li> Estabelecer um programa para ler a fluorescência: por exemplo, Excitação: 485 nm; emissão: 528 nm; Optics Posição: top 510 nm; Sensibilidade: 65, com um passo tremendo 5 segundos antes da leitura. </li></ol></li></ol> 4. Microplaca de 96 poços Set Up (ver Figura 2) <ol><li> Reúna suprimentos: obter pratos com embriões dechorionated, preto microplaca de 96 poços, p200 pipeta edicas, balde de gelo com H2DCFDA e soluções de dosagem H2DCFDA + PMA, multicanal p200 pipeta, dois reservatórios estéreis, folha de alumínio, e uma tesoura. </li><li> Transferência de um embrião em cada poço de uma microplaca de 96 poços: Use a tesoura para cortar uma ponteira de tal forma que os embriões ou rins passar pela abertura. <ol><li> Definir um pipetador de p200 para 100 ul e transferir um embrião, juntamente com a água do ovo (ou DMEM/F-12) em que muitos dos poços de uma microplaca de 96 poços preta como desejado (que não é necessário mudar a ponta de pipeta para cada diferente amostra do embrião dentro de uma condição experimental, mas pode ser necessário para mudar entre as pontas condições experimentais). Certifique-se de evitar a transferência de córions residuais, uma vez que estes tendem a distorcer os dados coletados. Para a transferência dos rins, uma pipeta de volume maior (definida como 100 ul) pode ser utilizado e as pontas das pipetas pode ser cortada para se obter um tamanho maior do furo, se necessário. Pode ser necessário incorporar poços sem amostras de embrião ou de rim, mas comas soluções de dosagem para controle de algumas manipulações experimentais. </li></ol></li><li> Adicionar soluções de dosagem: despeje solução de dosagem H2DCFDA em um estéril 25 ml reservatório. <ol><li> Usar uma pipeta multicanal p200 e oito pontas de pipeta, simultaneamente 100 jil de solução de dosagem H2DCFDA em uma coluna na microplaca de 96 poços (500 concentração ng / ml final H2DCFDA). </li><li> Repita este (trocando as pontas não é necessário) para as colunas desejado (geralmente seis colunas ou 48 poços se preenchendo toda uma microplaca de 96 poços). Adicionar esta solução a metade das amostras de controlo e de embrião de metade das amostras de embrião experimentalmente manipuladas (por exemplo, de 96 poços de microplacas configuração é mostrado na Figura 2, estes poços (cor de laranja) irá fornecer dados de fluorescência de fundo em amostras não induzidas com PMA) . </li><li> Verter a solução de dosagem H2DCFDA + PMA numa nova, estéril 25 ml de reservatório. </li><li> Use um p200 pipeta multicanal e oito dicas para Simultaneously pipeta 100 uL da solução de dosagem H2DCFDA + PMA nas colunas restantes (cor vermelha na Figura 2) da microplaca de 96 poços (mudar as pontas não é necessário, as concentrações finais de H2DCFDA-500 ng / ml e PMA a 200 ng / ml) . </li></ol></li><li> Cobrir a microplaca com papel alumínio. </li><li> Agitar a microplaca por aproximadamente 20 segundos a 150 rpm para homogeneizar as soluções em cada poço. </li><li> Incubar a microplaca a 28 ° C quando não está a ser lida. </li></ol> 5. Fluorescência Quantificação <ol><li> Leia a microplaca no tempo = 0 horas após a adição do PMA usando os parâmetros descritos no passo 3.1.2. <ol><li> Continuar a tomar medidas a cada poucos minutos, para o intervalo de tempo desejado ou incubar a folha enrolada microplaca a 28 ° C até um ponto de tempo mais tarde e, em seguida, fazer uma medição de ponto de extremidade a um tempo desejado (por exemplo, 4 horas após a adição do PMA). </li></ol></li><li> Use um plástico transferência pipeta para recuperar os embriões a partir dos poços. </li><li> Eutanásia os embriões de acordo com o seu cuidado com os animais e protocolo de uso, por exemplo, imersão em tricaina MS222. </li><li> Descarte a microplaca e outros materiais descartáveis ​​no recipiente de resíduos de risco biológico. </li></ol> 6. Análise de Dados <ol><li> Decidir sobre o ponto no tempo em que você gostaria de comparar os valores de fluorescência (por exemplo, 4 horas após a adição de PMA, a Tabela 1). </li><li> Subtrair o valor de fluorescência do grupo controle média induzida por un dos valores de fluorescência do grupo controle induzido por PMA individual. </li><li> Repita este procedimento para o grupo experimental com e sem PMA. </li><li> Armazene esses valores de fluorescência normalizados em duas colunas, o controle + grupo PMA eo experimental + grupo PMA (Tabela 2). </li><li> Calcular as médias e desvios-padrão para os valores de fluorescência normalizados do controle + PMA group eo grupo + PMA experimental. </li><li> Comparar os valores de fluorescência normalizados utilizando um teste t não emparelhado para determinar a significância estatística (Tabela 2). </li><li> Gráfico dos meios de controle + grupo + PMA eo grupo PMA experimental com barras de erro refletindo os desvios padrões apropriados. </li><li> Registe o nível de significância no gráfico e na legenda da figura (Figura 2). </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

A principal função dos fagócitos é detectar, engolfar e destruir patógenos. A capacidade dos fagócitos para produzir uma explosão respiratória adequado é crítico para esta função. Assim, a quantificação da resposta explosão respiratória é um método para permitir a comparação de saúde imune inato geral e função entre grupos de indivíduos e / ou em resposta a manipulações experimentais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para induzir, quantificar e comparar a resposta explosão respiratória ent...

O sistema imunitário é constituído por duas ramificações: a imunidade inata e adaptativa. A imunidade inata é evolutivamente mais antiga do que a imunidade adaptativa. Invertebrados são atualmente pensado para ter só a imunidade inata, enquanto os vertebrados possuem ambos os ramos inata e adaptativa. Enquanto a imunidade adaptativa confere imunidade específica e de longa duração a certos patógenos, a imunidade inata é uma resposta imediata às bactérias invasoras, vírus e fungos. Um aspecto importante da resposta imune inata envolve a libertação de citocinas e quimiocinas, o que resulta em inflamação e recrutamento de fagócitos (por exemplo, macrófagos, neutrófilos) para engolir e destruir invasores estranhos. Respostas imune inata de sucesso envolvem: (1) o reconhecimento de microorganismos invasores, (2) indução das cascatas de sinalização adequadas (por exemplo, liberação de citocinas e quimiocinas), (3) desenvolvimento adequado / número adequado de células fagocíticas, (4) Migração de fagócitos para locais de infecção; (5) imersão de patógenos, e (6) a destruição de microorganismos engoliram. Uma deficiência em qualquer uma dessas etapas pode levar ao host que está sendo oprimido por e sucumbir a, a infecção. Uma resposta imune inata robusta é vital para a saúde dos organismos, porque é a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, em todas as plantas e animais. Nos vertebrados, também potencia a resposta imune adaptativa 1. Portanto, é fundamental que nós somos capazes de avaliar todos os aspectos da resposta imune inata, a fim de entendê-lo melhor e para optimizar a sua função. Muitos organismos modelo são usados ​​para estudar a imunidade inata, que vão desde a Arabadopsis C. elegans, Drosophila a ratos para as células humanas em cultura. Uma vantagem de se utilizar o peixe-zebra (Danio rerio) sistema modelo para o estudo da imunidade inata é que o peixe-zebra é um vertebrado, com tanto inata e adaptativa imdade, mas o desenvolvimento da imunidade inata e adaptativa são temporalmente segregados. Zebrafish dependa exclusivamente de imunidade inata para a proteção contra a infecção até que a imunidade adaptativa torna-se totalmente funcional, que ocorre cerca de 4-6 semanas após a fertilização 2. Além de ferramentas para a manipulação genética, a claridade óptica e rápido desenvolvimento, externa, a imunidade inata como o modo de princípio de defesa em embriões de peixe-zebra fornece um modelo simplificado para se estudar a complexidade da resposta imune inata in vivo. Vários protocolos têm sido desenvolvidas para avaliar diferentes facetas da resposta imune inata em embriões de peixe-zebra. Microarrays e RNAseq validaram que os perfis de citoquinas induzidas pela resposta imune inata do peixe-zebra são semelhantes aos de humanos e têm também sugerido o envolvimento de genes inesperados na imunidade inata 3,4. A transparência do embrião de peixe-zebra e fluorescente, transgénicacepas ic de patógenos e zebrafish permitir a visualização de interações patógeno-hospedeiro dinâmicos in vivo em tempo real. Embriões de peixes-zebra transgénicos que expressam a GFP sob o controlo do promotor específico de mieloperoxidase de neutrófilos 5,6 ou o MPEG1 promotor específico de macrófago 7 tornaram possível visualizar e quantificar a migração dos fagócitos para os locais de infecções localizadas 8, bem como para visualizar a fagocitose e destruição de marcada com fluorescência patógenos 8,9. Embriões de peixes-zebra também são susceptíveis à geração de ensaios de alto rendimento e telas químicos. Por conseguinte, recentemente, têm sido desenvolvidos métodos de alto rendimento de análise do transcriptoma por infecção 10 e fagócitos migração para os locais de lesão induzida quimicamente 11. Das técnicas listadas acima, nenhum avaliar quantitativamente a fase final de destruição patógeno pelos fagócitos. Esta fase finalenvolve uma explosão respiratória (ou seja, produção de ROS e outros compostos tóxicos), que matam os patógenos engoliram. A enzima NADPH-oxidase é uma importante fonte de ROS nas células fagocíticas. Montagem das subunidades dos resultados da enzima NADPH-oxidase de transferência de electrões para o oxigénio, a geração de superóxido. Por meio de reacções enzimáticas subsequentes, superóxido pode então ser convertido em peróxido de hidrogénio e ácido hipocloroso (Figura 1A). É o colapso respiratório de fagócitos que mata organismos patogénicos e assim, a quantificação do potencial de explosão respiratória de embriões de peixes-zebra é indicativo de saúde global imune inata. Foi desenvolvido um ensaio baseado em fluorescência para quantificar a explosão respiratória em grupos de embriões de peixes-zebra individuais 12. Este ensaio utiliza a forma não-fluorescente, reduzida de um corante disponível comercialmente, de células-permeável. Este corante, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), é convertido para o fluocomposto cento, 2 &#39;, 7&#39;-diclorofluoresceína (DCF), por oxidação. As diversas ROS geradas pela explosão respiratória dos fagócitos podem oxidar H2DCFDA e gerar fluorescência 24. O aparecimento de fluorescência pode ser utilizado para quantificar e comparar a resposta de explosão respiratória entre grupos de peixe-zebra. A proteína quinase C de etilo agonista de miristato de forbol (PMA) é utilizado para induzir quimicamente NADPH-oxidase para a produção de ROS e, assim, aumentar as leituras de fluorescência (Figura 1B). Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado de uma versão modificada e optimizada deste ensaio explosão respiratória embrião do peixe-zebra. Este ensaio pode ser utilizado para comparar a explosão respiratória entre grupos de embriões de peixes-zebra individuais ao longo do tempo e / ou em resposta a manipulações experimentais (por exemplo, proteína de knockdown morfolino-mediada). O uso deste método, em conjunto com outros ensaios de imunidade inata peixe-zebra, irá fornecer uma imagem mais completa do complexo e críticoresposta imune inata.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

A explosão respiratória dos fagócitos é parte da resposta imune inata à infecção e envolve a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS são tóxicos e funcionar para matar microorganismos fagocitados. In vivo quantificação de derivados de fagócitos ROS fornece informações sobre a capacidade de um organismo para montar uma resposta imune inata robusto. Aqui nós descrevemos um protocolo para quantificar e comparar ROS em embriões de peixe-zebra inteiros após indução química da explosão respiratória dos fagócitos. Este método faz com que a utilização de um composto não fluorescente que se torna fluorescente por oxidação por ROS. Embriões de peixes-zebra individuais são pipetadas para os poços de uma microplaca e incubadas neste substrato fluorogénico com ou sem um indutor químico da explosão respiratória. Fluorescência em cada poço é quantificada em momentos desejados utilizando um leitor de microplacas. As leituras de fluorescência são ajustados para eliminar a fluorescência de fundo e, em seguida, compared usando um teste t não pareado. Este método permite a comparação do potencial de explosão respiratória de embriões de peixes-zebra, em diferentes estágios de desenvolvimento e em resposta a manipulações experimentais, tais como o knockdown da proteína, a sobre-expressão, ou a tratamento com agentes farmacológicos. Este método também pode ser utilizado para monitorar a resposta a explosão respiratória em rins dissecados inteiros ou preparações de células de rins de peixe-zebra adultos e algumas outras espécies de peixe. Acreditamos que a relativa simplicidade e capacidade de adaptação deste protocolo irá complementar os protocolos existentes e será de interesse para os pesquisadores que procuram entender melhor a resposta imune inata.

Aqui, nós fornecemos dados comparando a resposta explosão respiratória em embriões de peixe-zebra (tipo selvagem, AB de fundo) em 48 e 72 horas pós fertilização (hpf). Os 48 embriões HPF atuou como nosso grupo controle e os 72 hpf embriões como nosso grupo experimental. O tamanho da amostra utilizada foi de 24 embriões induzida por un e 24 embriões induzidas PMA por estágio de desenvolvimento. Leituras de fluorescência em bruto (em unidades de fluorescência relativas (RFU)) foram obtidas através da leitur...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

A resposta imune inata protege os organismos contra uma infecção patogénica. Um componente crítico da resposta imune inata, a explosão respiratória de fagócitos, gera espécies reativas de oxigênio, que matam microorganismos invasores. Nós descrevemos um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas quando a resposta imune inata é induzida quimicamente.

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.5K visualizações.  University of Maine.  A resposta imune inata protege os organismos contra uma infecção patogénica. Um componente crítico da resposta imune inata, a explosão respiratória de fagócitos, gera espécies reativas de oxigênio, que matam microorganismos invasores. Nós descrevemos um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas quando a resposta imune inata é induzida quimicamente. 

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...