<p class="jove_content"&gt; Agradecemos Nadeshda Wolf, Nadine Eschen e Susanne Delong para a pecuária excelente. CW foi apoiado por uma bolsa de doutorado do programa de Helmholtz &#39;<em&gt; Biointerfaces</em&gt; Internacional de pós-graduação da escola &quot;(BIFIGS). Apoio adicional foi fornecido por uma concessão KIT-RISC e por Marie Curie Internacional Reintegração Grant dentro do 7 º Programa-Quadro da Comunidade Europeia (PIRG07-GA-2010-267552) para CG. AHS foi apoiada por BOLD (Biologia do Fígado e pâncreas e Desenvolvimento de Doenças) - Marie Curie Rede de Formação Inicial (238.821). UL foi apoiada por Dopaminet FP7 (Seventh Framework Program) (223.744).</p&gt;

1. Manejo dos animais Para o queixo ensaio utilização larvas dpf 3 resultantes de cruzamentos do grupo entre homozigotos duplo transgênico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 e peixe AB (tipo selvagem). Recolher embriões por desova natural e levantá-los a 29 ° C em meio E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, e de metileno 0,1% de azul, equilibrada a pH 7,0) em placas de Petri. É essencial para manter uma densidade de embriões não superiores a 50-70 por placa. 2. Classificação Larva Confira todas as larvas sob um estereoscópio de fluorescência para a expressão repórter fluorescente, inflamação espontânea e desenvolvimento adequadas à idade relacionados. 3. Preparação Triagem Médio (Sempre preparar fresco) Preparar meio E3 sem azul de metileno suplementado com DMSO (1% final) e MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Preparação (Sempre preparar fresco) Primeiro pesar CuSO4 (M r = 159,6 g / mol) e preparar uma solução-mãe 20 mM em dH2O Preparar 120 uM CuSO Solução de trabalho de 4 (a partir de 20 mM de solução stock) em E3/DMSO (1%) / MS-222. Proteja CuSO 4 solução da luz. 5. 384-bem Preparação Plate (Greiner 384 Bem Microplaca) Pré-adicionar 20 ul de E3/DMSO (1%) / MS-222 a cada poço com uma pipeta inversa. Um aumento da pipeta furo é necessário para lidar com os embriões cuidadosamente sem infligir qualquer ferimento, o que é feito cortando a ponta de um furo de 2 mm. Transferir larva único em 74 uL de meio a cada poço (84 uL para o controlo não tratado). Se necessário, orientar as larvas em posição lateral no interior da cavidade utilizando um flexível Eppendorf Microloader pipeta (Eppendorf; 5242 956,003). Conduz todos os passos seguintes para manipulação de líquidos com um líquido robômanuseamento da estação de trabalho para assegurar o tratamento simultâneo de todas as larvas. 6. Tratamento de Drogas Misture compostos em chapa estoque de drogas 5 vezes por pipetagem cima e para baixo. Adicionar 16 ul de estoque de chapa 7.5x droga a cada poço e misturar 5 vezes. Ajuste a posição da ponta dentro dos poços para evitar lesões de larvas e dispensar o médio de 10 s / ul. Misturar médio em poços 4 vezes para assegurar uma distribuição homogénea do fármaco no interior do poço. 7. Incubação Incubar placa de rastreio durante 1 h à 29 ° C coberto com folha de alumínio para proteger compostos, bem como CuSO 4 a partir de luz. 8. Ferir Química Adicionar 10 ul de 120 mM CuSO4 solução de trabalho para cada poço, excepto para controlos negativos, mistura de 4 vezes e incubar novamente durante 1 h em 29 ° C. 9. Lavagem Retire e trocar 80 ul de mim<html> sódio de cada poço duas vezes (em passos de 20 ul) para remover compostos, bem como CuSO4. 10. Aquisição de Imagem Iniciar a aquisição da imagem em um microscópio invertido automatizado (isto é: Olympus digitalização ^ r) 90 minutos após o tratamento de cobre inicial. Definir inicial z nível para que neuromasts de direita e esquerda da linha lateral posterior são visíveis. Imagem cada poço uma vez por hora no brightfield canais, Cy3 e GFP em 4 planos focais (50 distância mm) usando uma objetiva de 4x (NA = 0,13). Informações adicionais sobre a imagem e processamento de dados estão disponíveis mediante solicitação. 11. Processamento de Imagem 1. Dados de classificação Imagens brutas são processados ​​com nosso script personalizado software LabView. A primeira operação no pipeline de processamento de imagem é a classificação de imagens brutas do microscópio pasta de dados gerado pelo bem do canal, e tempo-informação. ove_step &quot;&gt; 2 foco. prolongado Subsequentemente, o software cria imagens de foco estendidos a partir de 4 planos de contacto para cada um dos canais. 3. RGB-overlay Em uma última etapa as imagens desfocadas estendidos a partir dos 3 canais são combinadas para resultar em uma imagem RGB-sobreposição final. 4. Detecção automática neuromasto Uma ferramenta de reconhecimento de padrões (LabView rápida IA ​​ferramenta de prototipagem) identifica neuromasts dentro das imagens de sobreposição RGB e cria uma área empiricamente definida de interesse em torno dos neuromasts. 5. Quantificação Dentro da área empiricamente definido de interesse em torno neuromasts lesionados vermelhas leucócitos fluorescentes (reflectido como pixels vermelhos) são pontuados resultando em uma leitura primária de p ercent um ó rea ccupied por eukocytes l (PAOL). Em média 95,27 ± 2,11% (FDA1) e 95,12 ±1,56% (FDA2) de poços (larvas) foram detectados de forma adequada e foram subsequentemente submetidos a processamento de dados adicional. A saída de dados brutos (PAOL para cada neuromasto detectado) é armazenado em um arquivo txt e serve como entrada de dados para os scripts do MATLAB que processam os dados brutos mais. 12. Informática 1. Imaps Avaliar o sucesso de experiências individuais através da visualização gráfica da PAOL-prima de dados de saída em um código de cor pode ser realizado com os mapas chamados inflamação (imaps) (Figura 2). Verde brilhante reflete um índice inicial de alta inflamatória; preta indica que não há inflamação. Esta visão rápida permite a identificação rápida de experiências com falha, que pode então ser excluídos da análise de dados complementares. 2. Média de controles Cada placa experimental contém 320 compostos refletindo umadados de ponto único por composto eo tempo de ponto, bem como 32 controlos positivos e negativos, respectivamente. O controle de 32 repetições são média e desvio padrão é calculado. Para os controlos apenas os pontos de dados dentro de 2 desvios padrão estão incluídos. 3. Normalização A normalização é feita por análise de planilhas. O valor médio de DMSO, sendo o controlo negativo, é definido como 0 e os mais altos PAOL calculada a média para o controlo de cobre é definido como 1, de modo que a diferença máxima entre o controlo positivo e negativo é definido como 1. PAOL cada composto é linearmente interpolados ou extrapolados para os controlos respectivos na placa experimental. 4. Final ler-out: índice Inflamatória Depois de experiências duplicadas suficiente (ou seja 15) foram realizados, normalizados dados brutos de experiências duplicadas são em média, resultando em uma final ler-out - o inflamatóriaíndice. O índice de inflamatória inicial do controle de cobre começa a 100% para o tempo de ponto zero e correlaciona-se para a imagem de tempo de início de aquisição (90 minutos após o tratamento de cobre inicial). 5. Montagem de regressão exponencial Monotonic Devido à resolução da inflamação ao longo do tempo realizamos um ajuste de regressão monotônica exponencial não-linear para a inflamação inicial usando <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Equação 1" /> - Um 0 é uma medida para a resposta inicial em t = 0, um 1 está relacionada com a inclinação da magnitude ao longo do tempo. 6. 2-D trama espaço de características (Figura 4) Para gerar o espaço de características, uma regressão não-linear e é aplicado um cluster de análise-divide o espaço de características em regiões característicos, permitindo assim que identificação automática de candidatos interessantes de diferentes modulatórios-imune categorias (anti-inflammatteoria, anti-resolução, pró-inflamatória, de resolução de pro). Todos os compostos são apresentados no gráfico 2-D com base nos parâmetros de um 0 e um 1. 13. Manuseio e Armazenamento de Dados Nossos dados manipulação rotinas criar páginas web para visualização e representam as telas de drogas tais fornecendo uma visão rápida da imagem e processamento de dados dos resultados passos, bem como uma visão detalhada, quando solicitada pelo usuário 10. Soft links para outros bancos de dados heterogêneos relevantes biológicas e químicas são integrados, assim como para fornecer um recurso valioso para estudos comparativos e romance 11. Por essas rotinas, normas adequadas de dados e metainformação são definidas para armazenamento a longo prazo destes dados. 14. Os resultados representativos Em uma tela de piloto analisamos uma biblioteca composta de 640 aprovados pela FDA conhecidos compostos bioativos para efeitos na progressão da iniciação, ou resolução de um granulresposta inflamatória ocytic. Com base nos efeitos observados nos classificados 4 tipos de fenótipos moduladores do sistema imunológico que podem ser indicativos de diferentes modos de ação: anti-inflamatórios (1), a resolução anti-(2), pro-inflamatória (3) e pró-resolução (4) , que pode ser descrito com os parâmetros um 0 e um 1, que surgem a partir de um encaixe de regressão não-linear monotónica (e AO + alx -) para a inflamação inicial. A 0 representa a magnitude da resposta inflamatória ao passo que um 1 caracteriza o declive da curva e, assim, descreve resolução da inflamação. Mostrar todos os compostos num lote espaço 2-D característica (um 1 vs um 0) permite a identificação automática de candidatos atingidos a partir das diferentes categorias modulatórios imunes (Figura 3). 45 para fora de 640 compostos exerceu efeito anti-inflamatória significativa através da redução do índice de inflamatória inicial a 50% ou menos. Dentro this categoria encontramos 6 compostos pertencentes à classe farmacológica de não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides), confirmando a validade da nossa abordagem. No entanto, os AINE não classificado entre os mais potentes anti-inflamatórios. Além dos AINEs encontramos várias classes de drogas farmacológicas adicionais como, por exemplo, os bloqueadores do receptor da angiotensina (BRA), antibióticos e inibidores da bomba de protões. 7 compostos preencheram os critérios de limite empiricamente definidos para potenciais pró-resolução drogas. 18 medicamentos exerceu um efeito pró-inflamatória, resultando em recrutamento de leucócitos exagerada a neuromasts feridos em comparação com os controlos positivos. Apenas 2 compostos impediu a resolução atempada da resposta inflamatória. O efeito anti-inflamatório de candidatos vários hit (candidatos exemplares acima mencionados a partir de classes de drogas farmacológicas) a partir do ecrã coul pilotod ser confirmado, de maneira dose-dependente em subsequentes ensaios Chin secundárias (dados não mostrados). Novo teste de 4 potenciais pró-drogas resolução não confirmar o modo de ação indicada como exercida na tela principal. 2 dos fármacos tinham um potencial anti-inflamatório ligeiro em concentrações mais elevadas (20 mM). Uma terceira droga exibiu um marginal não-dose-dependente efeito anti-inflamatório em concentrações que variam de drogas 5-20 uM. O quarto fármaco não teve nenhum efeito sobre a resposta inflamatória com as concentrações testadas. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo de Trabalho do ensaio Chin. Individual composto transgênico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larvas (3 dpf) são manualmente distribuídas em placas de microtitulação 384-bem. Drogas são adicionados simultaneamente a cada cavidade utilizando um Zephyr Workstation Handling Compact líquido. Placas de ensaio são então incubadas durante 1 h em 29 ° C. O tratamento com CuSO 4 </sub&gt; - Solução (10 mM de concentração final) durante 1 h inflige o ferimento e inicia uma resposta inflamatória aguda. Finalmente, a solução de cobre e as drogas são lavadas e de aquisição de imagem automatizado é iniciado (90 minutos após o tratamento de cobre inicial). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figura 2. . Resumo imagem de imagens brutas A figura mostra imagens brutas de 4 planos focais (Z = 0 - 3) a distâncias de 50 um dos canais Cy3 (esquerda) e GFP (direita), respectivamente. Setas (Z = 1,2) indicam neuromasts exemplares, pontas de seta (Z = 1,2) apontam para cerca de leucócitos cluster neuromasts. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figura 3. Mapas inflamação (IMAPS) O sucesso das experiências individuais podem ser avaliados em imaps refletindo a resposta inflamatória (dados brutos) em um código de cores: verde brilhante. Reflete uma inflação alta inicial<html> resposta mmatory; preta indica que não há inflamação imaps no instante 0 (esquerda) e tempo-5 (à direita) mostram claramente se um experimento devem ser incluídos no tratamento dos dados.. Controles de cobre (linha 13 e 24) aparecem em vários tons de verde, enquanto DMSO poços de controlo (linha 1 e 12) aparecem em verde escuro ou preto. Em tempo de ponto-5, a inflamação é quase resolvido nos controles de cobre, agora indicado em tons escuros de verde ou preto. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figura 4. 2-D trajetória no espaço de recurso de 320 compostos de um FDA aprovou biblioteca e seus respectivos controles. Todos os poços compostos podem ser exibidos em uma trama espaço 2-D característica com base nos parâmetros de um 0 e um 1, que surgem a partir de um não-linear montagem de regressão (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Equação 1 &quot;/&gt;) para a inflamação inicial. Este lote espaço recurso permite a identificação automática de candidatos interessantes que pertencem a uma das seguintes 4 modulatórios-imune categorias que podem ser indicativos das drogas &quot;modo de ação:. anti-inflamatório (1), anti-resolução (2), pro-inflamatória (3) e pró-resolução (4) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<p class="jove_content"&gt; Aqui nós apresentamos uma estratégia de rastreamento totalmente automatizado de alto rendimento que permite a identificação de moduladores-imune compostos em um contexto animal inteiro. Monitorização permitindo assim de uma resposta inflamatória aguda<em&gt; In vivo</em&gt; E em tempo real.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós fornecemos um protocolo para aplicar zebrafish como um organismo modelo valioso para a descoberta de medicamentos ou drogas esforços reaproveitamento, uma vez que os efeitos da droga sobre o recrutamento de leucócitos para feridas podem ser estudadas com relativa facilidade no contexto de um totalmente funcional sistema imune inato. A única vantagem de nossa abordagem é o fato de que ferindo química torna a manipulação larvas obsoleta do manual, permitindo a automação e rastreamento em um formato de alto rendimento.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Além disso, efeitos adversos ou tóxicos, bem como fortes fora do alvo os efeitos podem ser facilmente avaliada com a proposta de set-up. A FDA biblioteca aprovado no entanto, não contêm quaisquer compostos tóxicos nas concentrações de rastreio dadas. No entanto, nós propomos para compostos tóxicos aparentes para comparar o conjunto de dados disponíveis (fenótipo modulatório imunitário, por exemplo, a concentração de droga) entre os membros da presente classe farmacológica mesma substância na biblioteca testado. Membros tóxicos de uma família de substâncias, que de outra forma exerce um fenótipo modulatório promissora imune, pode ser novamente testados em concentrações mais baixas, se for necessário.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós demonstramos a possibilidade de drogas categorizar automaticamente de acordo com a sua exerceu efeito modulatório-imune. Drogas pertencentes à categoria de compostos anti-inflamatórios podem ser validados em experiências independentes, a maioria dos compostos exercem o seu efeito de uma forma dependente da dose. Quatro compostos identificados como potenciais pró-drogas resolução poderia, assim, não muito longe ser confirmado como tal. Também indica que esta categoria especial modulatório imune é difícil de descrever, uma vez que nenhuma droga que afectam apenas resolução foram até agora descritos na literatura. No entanto, 3 das 4 drogas reanalisada mostrou uma tendência anti-inflamatório nas maiores concentrações molares. Otimizando os critérios de limite empiricamente definidos devem ajudar a reduzir o número de falsos-positivos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Além disso, a técnica apresentada oferece a possibilidade de ser utilizado para a identificação de mutações em genes que afectam o comportamento migratório de leucócitos<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Concluindo, o método proposto pode facilitar e acelerar a descoberta de medicamentos ou drogas redirecionando esforços produzindo potenciais estruturas de chumbo com novas informações disponíveis sobre tolerância à droga, toxicidade, dosagem, bem como potenciais efeitos fora do alvo. Portanto, servindo como uma estratégia simples, de custo e economia de tempo nas fases iniciais do desenvolvimento da droga.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Cobre (II) de sulfato de anidro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> Aprovado pela FDA biblioteca de droga </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 microplaca não-vinculativo, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> preto </td></tr><tr><td> Olympus varredura ^ R </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Workstation Handling Compact Líquido </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Larvas Zebrafish são particularmente sensíveis ao animal como um todo pequena molécula 1,2 telas devido ao seu pequeno tamanho e relativa facilidade de manipulação e de observação, bem como o facto de que os compostos podem ser simplesmente adicionados à água de banho e são facilmente absorvidos quando administrados em uma &lt;1% de solução de DMSO. Devido à claridade óptica de larvas do peixe-zebra e da disponibilidade de linhas transgénicas que expressam proteínas fluorescentes em leucócitos, peixe-zebra oferecem a vantagem única de monitorização uma resposta inflamatória aguda in vivo. Por conseguinte, utilizando o peixe-zebra de alta conteúdo telas de moléculas pequenas destinadas à identificação de moduladores-imune compostos com alta taxa de transferência tem sido proposto 3-6, sugerindo cenários indução da inflamação, por exemplo, entalhes localizadas no tecido fin, danos de laser dirigido para a superfície de gema de 7 embriões ou tailfin amputação 3,5,6. A principal desvantagem destes métodos, porém, foio requisito de manipulação manual do larva para induzir ferimento, impedindo assim a seleção de alto rendimento. Introdução da inflamação induzida quimicamente (queixo) ensaio 8 eliminou esses obstáculos. Uma vez que ferimento é infligida quimicamente o número de embriões que podem ser tratadas simultaneamente é virtualmente ilimitada. Tratamento temporário de larvas do peixe com sulfato de cobre seletivamente induz a morte celular nas células ciliadas do sistema de linha lateral e os resultados no recrutamento de granulócitos rápida para neuromasts feridos. A resposta inflamatória pode ser seguido em tempo real, utilizando o composto transgénico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larvas do peixe 6,9 que expressam uma proteína verde fluorescente em células neuromastos, bem como um vermelho granulócitos marcação fluorescente da proteína. A fim de elaborar uma estratégia de rastreamento que permita ambas as análises de conteúdo de alta e de alto rendimento, introduzimos manipulação de líquidos robótica e micr automatizada combinadaoscopy com um script personalizado software desenvolvido. Este script permite a quantificação automática da resposta inflamatória, marcando a área ocupada por cento fluorescentes vermelhas leucócitos dentro de uma área definida empiricamente em torno feridos verdes neuromasts fluorescentes. Além disso, o processamento automatizado de dados, manipulação, visualização e armazenamento de todas baseadas no costume desenvolvido MATLAB e scripts Python. Em resumo, introduzimos uma tela HC / HT automatizado que permite o teste de compostos químicos para o seu efeito sobre a progressão da iniciação, ou a resolução de uma resposta inflamatória granulocítica. Este protocolo serve um bom ponto de partida para mais análises aprofundadas de mecanismos de drogas e vias envolvidas na orquestração de uma resposta imune inata. No futuro, pode ajudar a identificar os efeitos tóxicos intoleráveis ​​ou meta-off em fases anteriores da descoberta da droga e, assim, reduzir riscos e custos processuais para o desenvolvimento de drogas.

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Aqui nós descrevemos um romance de alto teor de ensaio inflamação induzido quimicamente visando a identificação de moduladores-imune bioativos. Temos sucesso combinado microscopia automatizada com scripts personalizados de software desenvolvidos permitindo a quantificação automática da resposta inflamatória, bem como processamento de dados ainda mais, a análise, mineração e de armazenamento.

Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.0K visualizações.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. Aqui nós descrevemos um romance de alto teor de ensaio inflamação induzido quimicamente visando a identificação de moduladores-imune bioativos. Temos sucesso combinado microscopia automatizada com scripts personalizados de software desenvolvidos permitindo a quantificação automática da resposta inflamatória, bem como processamento de dados ainda mais, a análise, mineração e de armazenamento.

Vídeo: Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Usando Ovos de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Como um<em&gt; Em vivo</em&gt; Modelo de Helmintos induzida por inflamação pulmonar

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Imunologia e Infecção

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...